As doenças periodontais (DP) afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por micro-organismos gram-negativos anaeróbios presentes no biofilme periodontal. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, que atuam no micro ambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Acredita-se que citocinas inflamatórias, quimiocinas e seus receptores estão envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de determinação de resistência ou susceptibilidade às DP; ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliou-se o papel das células CCR5+ na DP experimental induzida pela inoculação oral de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos C57BL/6 wild type e camundongos CCR5-knockout. Os resultados mostram que a maioria das células CCR5+ possuem fenótipo compatível com células T do subtipo Th1, devido a co-expressão de CD3 e CXCR3; além de co-expressarem RANKL. Na ausência das células CCR5+, houve uma significativa diminuição da migração de células inflamatórias totais e RANKL+ para os tecidos periodontais, diminuição da reabsorção óssea alveolar, diminuição dos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFα-, IL-1β e IFN-γ, assim como diminuição na expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-13. Sua ausência não interferiu no controle da infecção periodontal apesar da diminuição dos níveis de iNOS. Estes resultados conduzem à conclusão de que a maioria das células CCR5+ são células T do subtipo Th1, que atuam como importantes moduladoras das citocinas TNFα-, IL-1β e IFN-γ, das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-2 e MMP-13, e que também expressam e modulam a expressão de RANKL, tendo participação importante na imunopatogenese da DP experimental, sem interferir no controle da infecção periodontal. Estes fatos tornam as células CCR5+ potenciais alvos para intervenção terapêutica visando ao controle das doenças periodontais. / The periodontal diseases (PD) affect the supportive tissues of the teeth and are triggered by periodontopathogens present in the dental biofilm. The clinical outcome is highly influenced by the host inflammatory and immune response with participation of many cellular types, that act in the local microenvironment modulating the host response to control the infection. Inflammatory cytokines, chemokines and its receptors are thought to be involved in the cellular migration to the periodontal tissues, but there is little knowledge about the mechanisms of determination of resistance or susceptibility to the PD and in the triggering of tissue damage by immune response components. This study evaluated the role of CCR5+ cells in the experimental PD induced by oral inoculation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in C57BL/6 wild type mice and CCR5-knockout mice. The phenotypic analysis of inflammatory infiltrate demonstrated that the most of CCR5+ cells coexpress CD3 and CXCR3, suggesting a phenotype compatible with Th1-type cells, and also co-express RANKL. In the absence of CCR5+ cells there was a significant overall reduction of inflammatory cells and RANKL+ cells influx to the periodontal tissues, reduction in the alveolar bone resorption, reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines TNFα-, IL-1β and IFN-γ expression, as a reduction in the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-13. The absence of CCR5+ cells did not impair the control of periodontal infection, despite the reduction of iNOS levels. In conclusion, these data demonstrate that the most of CCR5+ cells are Th1 cells, which act as important modulators of TNFα-, IL-1β and IFN-γ, MMP-1, MMP- 2 and MMP-13 levels, and which also express and modulate the expression of RANKL, playing an important role in the immunopathogenesis of experimental PD, without impairing the control of periodontal infection. These facts point to CCR5+ cells as potentials targets to therapeutic interventions aimed to control periodontal diseases.

A inflamação sistêmica é uma das características que marcam o diagnóstico da caquexia associada ao câncer. Entre as interações tumor-hospedeiro, o tecido adiposo branco contribui à inflamação, uma vez que ele sofre uma reorganização morfológica e lipólise, liberando ácidos graxos livres (AGLs), mediadores lipídicos (LMs) e citocinas pró-inflamatórias, que acentuam a ativação de vias de sinalização pró-inflamatória e o recrutamento de células do sistema imunológico para o tecido. O objetivo deste projeto foi investigar quais fatores inflamatórios sistêmicos estão envolvidos na inflamação do tecido adiposo e qual é a influência desses fatores sobre as enzimas envolvidas no metabolismo dos AGs ou LMs em indivíduos saudáveis (Controle), pacientes com câncer gastrointestinal com peso estável (WSC) e pacientes com câncer e caquexia (CC). Os resultados demonstraram que a resposta inflamatória sistêmica é diferente da resposta encontrada no tecido adiposo. A inflamação sistêmica dos pacientes com câncer e caquexia (CC) foi caracterizada por níveis circulantes mais elevados de ácidos graxos saturados (SFAs), tumor-necrosis-factor-&#945 (TNF-&#945), Interleukin IL-6, IL-8 e proteina Creativa (PCR), enquanto os níveis de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs), especialmente n3-PUFAs, foram menores em CC que nos demais grupos. In vitro e em explantes de tecido adiposo, citocinas pró-inflamatórias e SFAs aumentaram a expressão das quimiocinas IL-8 e CXCL10. E também observamos um aumento na expressão destas quimiocinas na inflamação do tecido adiposo no CC, que era mais profundo no tecido adiposo visceral (VAT) quando comparado ao tecido adiposo subcutâneo (SAT). A inflamação sistêmica foi negativamente associada com a expressão de enzimas sintetizadoras dos PUFAs, embora a expressão gênica e protéica mostraram somente pequenas diferencias entre os grupos. Os efeitos dos fatores inflamatórios sobre as enzimas no tecido adiposo podem ter sido mascarados pela modulação diferenciada dos diversos tipos celulares constituintes desse tecido. Experimentos in vitro mostraram que a expressão de enzimas que modificam os AGs, tais como as dessaturases e elongases em adipócitos e macrófagos, foram reguladas em direções opostas por TNF-&#945, IL-6, LPS e palmitato. Mesmo os pacientes CC demonstrando uma maior concentração plasmática da Resolvina D1, que é um mediador lipídico de resolução da inflamação, ainda assim, a inflamação sistêmica é maior nesses pacientes, e os resultados indicam que as citoquinas inflamatórias interferem com as vias de síntese das LMs da resolução. Concluímos que, os dados revelaram um crosstalk inter-tecidual e intercelular complexo mediado por citocinas pró-inflamatórias e compostos lipídicos que aumentam a inflamação na caquexia associada ao câncer por mecanismos autoregulação. / Systemic inflammation is a hallmark of cancer cachexia. Among tumor-host interactions, the white adipose tissue (WAT) is an important contributor to inflammation as it suffers morphological reorganization and lipolysis, releasing free fatty acids (FA), bioactive lipid mediators (LM) and pro-inflammatory cytokines, which accentuate the activation of proinflammatory signaling pathways and the recruitment of immune cells to the tissue. This project aimed to investigate which inflammatory factors are involved in the local adipose tissue inflammation and what is the influence of such factors upon enzymes involved in FA or LM metabolism in healthy individuals (Control), weight stable gastro-intestinal cancer patients (WSC) and cachectic cancer patients (CC). The results demonstrated that the inflammatory signature of systemic inflammation is different from local adipose tissue inflammation. The systemic inflammation of the cachectic cancer patients was characterized by higher levels of circulating saturated fatty acids (SFA), tumor-necrosisfactor- &#945 (TNF- &#945), interleukins IL-6, IL-8 and CRP while levels of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially n3-PUFAs, were lower in CC than in the other groups. In vitro and in adipose tissue explants, pro-inflammatory cytokines and SFAs were shown to increase the chemokines IL-8 and CXCL10 that were found to be augmented in adipose tissue inflammation in CC which was more profound in the visceral adipose tissue (VAT) than in subcutaneous adipose tissue (SAT). Systemic inflammation was negatively associated with the expression of PUFA synthesizing enzymes, though gene and protein expression did hardly differ between groups. The effects of inflammatory factors on enzymes in the whole tissue could have been masked by differentiated modulation of the diverse cell types in the same tissue. In vitro experiments showed that the expression of FA-modifying enzymes such as desaturases and elongases in adipocytes and macrophages was regulated into opposing directions by TNF- &#945, IL-6, LPS or palmitate. The higher plasma concentration of the pro-resolving LM resolvin D1 in CC cannot compensate the overall inflammatory status and the results indicate that inflammatory cytokines interfere with synthesis pathways of pro-resolving LM. In summary, the data revealed a complex inter-tissue and inter-cellular crosstalk mediated by pro-inflammatory cytokines and lipid compounds enhancing inflammation in cancer cachexia by feedforward mechanisms.

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-29T19:06:42Z No. of bitstreams: 1 rodrigo_nr_silva_ioc_mt_0018_2011.pdf: 2690965 bytes, checksum: 4ca3fb90882b72a2a1f27faf92a26bbd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-29T19:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodrigo_nr_silva_ioc_mt_0018_2011.pdf: 2690965 bytes, checksum: 4ca3fb90882b72a2a1f27faf92a26bbd (MD5) Previous issue date: 2011-09-16 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A malária permanece como um dos principais problemas de saúde pública do mundo, ocasionando mais de 200 milhões de casos anualmente, que resultam em cerca de um milhão de óbitos. Apesar de sua evidente importância epidemiológica, os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da doença ainda são pouco compreendidos. Acredita-se que citocinas e outros mediadores da resposta imune sejam crucias no processo de cura e na determinação do curso da infecção. Desse modo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os níveis séricos de citocinas, quimiocinas, proteína C-reativa (CRP) e as alterações hematológicas em pacientes com malária, de área endêmica do Estado de Rondônia. Os pacientes foram avaliados na fase aguda (no momento do diagnóstico, antes do início do tratamento) e na fase de convalescença (15 dias após o início do tratamento quando o paciente já se encontrava curado). Na fase aguda da doença, os pacientes com malária apresentaram plaquetopenia, eosinopenia, leucopenia e linfopenia, além de um número aumentado de células bastão. Adicionalmente, foram observadas alterações nos níveis das citocinas IL-1β, IL-2, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-17, IL-8, MIP- 1β e no nível de CRP, que se encontravam elevados. Na fase de convalescença, as alterações hematológicas retornam aos valores normais. Entretanto, os níveis séricos de IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-8 e MIP-1β, se encontram ainda mais elevados nesta fase. Tanto na fase aguda quanto de convalescença verificamos uma associação positiva entre IL-17 e os níveis das demais citocinas citadas, dado que reforça a ideia do papel de indução pró-inflamatória e regulação desta citocina. Além disso, houve uma redução drástica dos níveis de IL-10 e CRP nesta fase, quando atingem concentrações similares ao grupo controle. Por fim, os dados deste trabalho, também sugerem que as células bastão possam atuar como importantes fontes de IL-10 durante a infecção malárica, considerando a associação positiva entre o número de células bastão e os níveis de IL-10 na fase aguda e o retorno de ambos a níveis similares ao Controle na fase de convalescença da infecção. / Malaria remains as a major public health problems of the world, causing more than 200 million annual cases that result in an estimated one million deaths. However, despite the obvious importance of the disease epidemiology, mechanisms and factors involved in the pathogenesis and pathophysiology of the disease are still poorly understood. It is believed that cytokines and other mediators of immune responses are crucial in the healing process and in determining the course of infection. Thus, this study aimed to evaluate serum protein (CRP) and hematological State. Patients were levels of changes in evaluated during cytokines, chemokines, C-reactive patients with malaria in endemic the phase (at acute areas of diagnosis Rondonia before starting treatment) and convalescent phase (15 days after starting treatment when the patient was cured). In acute phase of illness, patients with malaria had thrombocytopenia, eosinopenia, leucopenia and lymphopenia, and an increased number of band cells. Additionally, changes were observed in levels of IL-1β, IL-2, IL-6, and TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-17, IL-8, MIP-1β and CRP level, which were high. In the convalescent phase, the hematologic changes return to normal. However, serum levels of IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-8 and MIP-1β, are still higher in this phase. Both in acute and convalescent other cytokines mentioned phase, we found a positive above. This data reinforces association between the idea that this IL-17 levels and cytokine has the a role in inducing pro-inflammatory and regulation of the other cytokines. In addition, there was a drastic reduction in the levels of IL-10 and CRP at this phase, when they reach concentrations similar to the control group. Finally, our data also suggest that band cells may act as producers of IL-10 during malaria infection, considering the positive association between the number of band cells and the levels of IL-10 in the acute phase and return both to levels similar to control in the convalescent phase of infection.

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma

As doenças periodontais (DP) afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por micro-organismos gram-negativos anaeróbios presentes no biofilme periodontal. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, que atuam no micro ambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Acredita-se que citocinas inflamatórias, quimiocinas e seus receptores estão envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de determinação de resistência ou susceptibilidade às DP; ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliou-se o papel das células CCR5+ na DP experimental induzida pela inoculação oral de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos C57BL/6 wild type e camundongos CCR5-knockout. Os resultados mostram que a maioria das células CCR5+ possuem fenótipo compatível com células T do subtipo Th1, devido a co-expressão de CD3 e CXCR3; além de co-expressarem RANKL. Na ausência das células CCR5+, houve uma significativa diminuição da migração de células inflamatórias totais e RANKL+ para os tecidos periodontais, diminuição da reabsorção óssea alveolar, diminuição dos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFα-, IL-1β e IFN-γ, assim como diminuição na expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-13. Sua ausência não interferiu no controle da infecção periodontal apesar da diminuição dos níveis de iNOS. Estes resultados conduzem à conclusão de que a maioria das células CCR5+ são células T do subtipo Th1, que atuam como importantes moduladoras das citocinas TNFα-, IL-1β e IFN-γ, das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-2 e MMP-13, e que também expressam e modulam a expressão de RANKL, tendo participação importante na imunopatogenese da DP experimental, sem interferir no controle da infecção periodontal. Estes fatos tornam as células CCR5+ potenciais alvos para intervenção terapêutica visando ao controle das doenças periodontais. / The periodontal diseases (PD) affect the supportive tissues of the teeth and are triggered by periodontopathogens present in the dental biofilm. The clinical outcome is highly influenced by the host inflammatory and immune response with participation of many cellular types, that act in the local microenvironment modulating the host response to control the infection. Inflammatory cytokines, chemokines and its receptors are thought to be involved in the cellular migration to the periodontal tissues, but there is little knowledge about the mechanisms of determination of resistance or susceptibility to the PD and in the triggering of tissue damage by immune response components. This study evaluated the role of CCR5+ cells in the experimental PD induced by oral inoculation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in C57BL/6 wild type mice and CCR5-knockout mice. The phenotypic analysis of inflammatory infiltrate demonstrated that the most of CCR5+ cells coexpress CD3 and CXCR3, suggesting a phenotype compatible with Th1-type cells, and also co-express RANKL. In the absence of CCR5+ cells there was a significant overall reduction of inflammatory cells and RANKL+ cells influx to the periodontal tissues, reduction in the alveolar bone resorption, reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines TNFα-, IL-1β and IFN-γ expression, as a reduction in the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-13. The absence of CCR5+ cells did not impair the control of periodontal infection, despite the reduction of iNOS levels. In conclusion, these data demonstrate that the most of CCR5+ cells are Th1 cells, which act as important modulators of TNFα-, IL-1β and IFN-γ, MMP-1, MMP- 2 and MMP-13 levels, and which also express and modulate the expression of RANKL, playing an important role in the immunopathogenesis of experimental PD, without impairing the control of periodontal infection. These facts point to CCR5+ cells as potentials targets to therapeutic interventions aimed to control periodontal diseases.

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NFκB; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T18:08:23Z No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:58:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) Previous issue date: 2008-04-11 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis. Novos métodos de diagnóstico e a vacinação contra tuberculose (TB) são necessários para o controle da doença. A resposta imunológica contra o M. tuberculosis envolve a produção de várias citocinas e quimiocinas, porém suas interações durante a infecção são bastante complexas. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da produção de citocinas e quimiocinas durante a tuberculose pulmonar, frente a estímulos de antígenos do M. tuberculosis. Através do método citométrico de esferas ordenadas (CBA-Cytometric Bead Array) foi possível avaliar os níveis plasmáticos das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1 em pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), em pacientes sob tratamento (TBST), em pacientes tratados (TBT) e em indivíduos controles sadios (CS). Utilizando esse mesmo método também foi realizada a mensuração das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 e IL-4 e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1, produzidas em cultura de células mononucleares do sangue periférico após estímulo com os antígenos ESAT-6/CFP-10 e 16kDa, nos grupos de pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), de pacientes tratados (TBT), de indivíduos controles sadios (CS) e de indivíduos contatos de pacientes com tuberculose (CT). As quimiocinas plasmáticas MIG, IP-10 e IL-8 estavam elevadas no grupo TBA, em comparação aos demais grupos (CS, TBST e TBT); e ainda os níveis das quimiocinas analisadas no plasma diminuíram após o início do tratamento. Nos ensaios “in vitro” com PBMC humanas, as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 e as quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES foram estimuladas em níveis maiores, pelo ESAT-6/CFP-10, nos grupos TBA e CT em relação aos controles e pacientes tratados, enquanto que o estímulo com antígeno 16kDa não permitiu diferenciar entre os grupos estudados quanto a produção dessas citocinas e quimiocinas. Já as citocinas IL-10 e IL-4 e a quimiocina MCP-1 apresentaram níveis elevados nas culturas de PBMC de indivíduos controles e contatos quando estimuladas com os antígenos do M. tuberculosis estudados em relação aos pacientes com tuberculose. O antígeno ESAT-6/CFP-10 diferenciou a tuberculose ativa quanto à produção das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-2, e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES, as quais podem contribuir para uma resposta protetora na tuberculose. O antígeno 16kDa se mostrou um forte estimulador de IL-10 e MCP1, moléculas que podem atuar como reguladoras ou inibidoras da resposta imunológica contra a infecção por M. tuberculosis, sugerindo o papel importante deste antígeno em favorecer a persistência do bacilo no hospedeiro. Os níveis de quimiocinas plasmáticas podem ser eficazes em diferenciar os pacientes com tuberculose ativa de indivíduos controles e ainda pode ser útil em monitorar o efeito do tratamento quimioterápico anti-tuberculose. O entendimento da dinâmica resposta imunológica contra antígenos do M. tuberculosis pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de combate à tuberculose. / One-third of the world's population is currently infected with Mycobacterium tuberculosis. The development of new methods of diagnosis and vaccines against tuberculosis (TB) are necessary for disease control. The immune response against M. tuberculosis involves the production of many cytokines and chemokines, but their interaction during the infection is complex. The objective of this work was to study the production of cytokines and chemokines in pulmonary TB under stimulation of M. tuberculosis antigens. The method of Cytometric Bead Array (CBA) was used to evaluate plasma levels of chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES in untreated patients with active TB (ATB), in patients during treatment (DTB) and in treated patients (TTB) and healthy controls individuals (HC). We also evaluated, by CBA, the levels of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 and IL-4, and chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES, in culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimulation with the antigens ESAT-6/CFP-10 and 16kDa, in groups of untreated patients with active TB (ATB), in treated patients (TTB), healthy controls individuals (HC) and in contact individuals of patients with TB (CT). The production of plasma chemokines, the levels of MIG, IP-10 and IL-8 were higher in the group ATB, compared to the other (HC, DTB and TTB), and the levels of chemokines analyzed in plasma decreased after the beginning of the treatment. In assays with human PBMC, the cytokine IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES were stimulated at higher levels, by the fusion protein ESAT-6 / CFP-10, in groups ATB and CT in relation to the controls and treated patients. The stimulation with antigen 16kDa did not allow for differentiation of these cytokines and chemokines between the groups. IL-10, IL-4 and MCP-1 showed high levels in the cultures of PBMC from healthy control individuals and contacts when stimulated with the studied M. tuberculosis antigens compared to patients with TB. The antigen ESAT-6/CFP-10 differentiated active TB with regard to the production of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES, which can contribute to a protective response in TB. The antigen 16kDa was a strong stimulator of IL-4, IL-10 and MCP-1 molecules that can regulate or inhibit the immune response against M. tuberculosis infection, demonstrating the important role of this antigen in promoting the persistence of the bacillus in the host. The plasma levels of chemokines can be effective in differentiating patients with active TB from the healthy control individuals, and can also be useful in monitoring the effect of anti-TB chemotherapy. The comprehension of the dynamics of the immune response against M. tuberculosis antigens can aid the development of new strategies to combat tuberculosis.