Os fibroblastos são atualmente considerados componentes ativos da resposta imune porque estas células expressam receptores do tipo Toll (TLRs), são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e mediar a produção de citocinas e quimiocinas durante a inflamação. A resposta imune inata do hospedeiro a lipopolissacarídeos (LPS) de Porphyromonas gingivalis é incomum, já que diferentes estudos relataram que este LPS pode ser um agonista para TLR2 e um antagonista ou agonista para TLR4. A sinalização por TLRs envolve proteínas adaptadoras, como MyD88 e TRAM, que são necessárias para a transdução do sinal até o núcleo para que ocorra a transcrição de RNAm para os mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar se a sinalização por meio de TLR2 ou TLR4 poderia afetar a produção de Interleucina (IL)-6, IL-8 e CXCL12 em fibroblastos humanos gengivais (HGF) e fibroblastos humanos de ligamento periodontal (HPLF). Objetivamos também comparar a participação das moléculas adaptadoras MyD88 e TRAM na expressão do RNAm dos mesmos alvos. Material e Métodos: Após silenciamento mediado por RNA de interferência de TLR2, TLR4, MyD88 ou TRAM, confirmado por RT-qPCR, HGF e HPLF, provenientes de três dadores voluntários, foram estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis ou com dois agonistas sintéticos de TLR2, Pam2CSK4 e Pam3CSK4, por 6 horas. A expressão do RNAm e das proteínas IL-6, IL-8, e CXCL12 foram avaliados por qRT-PCR e ELISA, respectivamente. Resultados: A expressão do RNAm de TLR2 foi regulada em HGF, mas não em HPLF por todos os estímulos. O silenciamento de TLR2 diminuiu IL-6 e IL-8 em resposta ao LPS de P. gingivalis, Pam2CSK4 e Pam3CSK4 de maneira semelhante, em ambas as subpopulações de fibroblastos (p<0,05). Por outro lado, a produção de CXCL12 permaneceu inalterada pelo silenciamento de TLR2 ou TLR4. No caso do silenciamento de MyD88 e TRAM, em ambos os subtipos de fibroblastos, o RNAm para os mesmos alvos também teve sua expressão diminuída (p<0,05). Já a expressão constitutiva de CXCL12 foi aumentada com o silenciamento de MyD88 ou TRAM (p<0,05). Conclusão: Estes resultados sugerem que a sinalização por meio de TLR2, por fibroblastos, as células residentes mais numerosas em gengiva e ligamento periodontal, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal, mas não interfere nos níveis de CXCL12, uma quimiocina importante no processo de reparação. Concluímos também que o silenciamento de MyD88 ou TRAM é capaz de diminuir o aumento da transcrição gênica de IL-6 e IL-8 provocado por LPS de P. gingivalis, embora a expressão constitutiva de CXCL12 seja regulada positivamente. / Fibroblasts are now seen as active components of the immune response because these cells express Toll-like receptors (TLRs), recognize pathogen associated molecular patterns and mediate the production of cytokines and chemokines during inflammation. The innate host response to lipopolysaccharide (LPS) from Porphyromonas gingivalis is unusual in that different studies have reported that it can be an agonist for TLR2 and an antagonist or agonist for TLR4. TLRs signaling pathway involves adaptor proteins, like MyD88 and TRAM, which are crucial for signal transduction to the nucleus and mRNA expression of inflammatory mediators. This study investigated and compared whether signaling through TLR2 or TLR4 could affect the production of IL-6, IL-8 and CXCL12 in both human gingival fibroblasts (HGF) and human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The role of MyD88 and TRAM on the mRNA expression of the same targets were also evaluated. Methods: After small interfering RNA-mediated silencing of TLR2, TLR4, MyD88 or TRAM, confirmed by RT-qPCR, HGF and HPLF from three volunteer donors were stimulated with P. gingivalis LPS or with two synthetic ligands of TLR2, Pam2CSK4 and Pam3CSK4, for 6 hours. IL-6, IL-8, and CXCL12 mRNA expression and protein production were evaluated by RT-qPCR and ELISA, respectively. Results: TLR2 mRNA expression was upregulated in HGF but not in HPLF by all the stimuli applied. Knockdown of TLR2 decreased IL-6 and IL-8 in response to P. gingivalis LPS, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 in a similar manner in both fibroblasts subpopulations. Conversely, CXCL12 remained unchanged by TLR2 or TLR4 silencing. For MyD88 or TRAM silencing, IL-6 and IL-8 mRNA were also decreased, in both fibroblasts subtypes. However CXCL12 mRNA constitutive expression was increased by siMyD88 or siTRAM. Conclusion: These results suggest that signaling through TLR2 by fibroblasts, the most numerous resident cells in gingiva and periodontal ligament, may control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to periodontal pathogenesis, but does not interfere with CXCL12 levels, an important chemokine in the repair process. Also, MyD88 or TRAM knockdown may decrease the IL-6 and IL-8 LPS-induced upregulation and increase the constitutive CXCL12 mRNA.

A neutropenia é um achado freqüente em recém-nascidos de mães com pré-eclampsia. Estudos avaliando a ativação leucocitária nestes recém-nascidos são escassos. No entanto, as principais citocinas pró-inflamatórias envolvidas são a IL-8 e o GRO-α. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis plasmáticos de IL-8 e GRO-α em recémnascidos prematuros de mães com pré-eclampsia. Metodologia: Foram incluídos recém-nascidos com idade gestacional menor de 36 semanas e peso de nascimento inferior a 2000 gramas, sendo divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de pré-eclampsia materna. Os critérios de exclusão foram: malformações congênitas, erro inato de metabolismo ou anormalidades cromossômicas, infecções do grupo STORCH, óbito na sala de parto e recém-nascidos nos quais as mães possuíam hipertensão crônica sem a presença de pré-eclampsia. Nas primeiras 48 horas de vida, no momento de coleta assistencial, uma pequena amostra adicional de sangue foi obtida para dosagem de IL-8 e GRO-α pelo método de enzimoimunoensaio. Foram usados os testes qui-quadrado, T student, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e regressão logística múltipla. Resultados: 119 recém-prematuros (64 sem pré-eclampsia e 55 com pré-eclampsia). Os grupos foram similares quanto ao peso de nascimento, idade gestacional, escore de Apgar no 5’minuto, sepse, doença de membrana hialina , ventilação mecânica, nutrição parenteral total, enterocolite necrosante, hemorragia periventricular. O grupo com préeclampsia apresentou mais neutropenia, foi mais PIG, parto cesariano e menos bolsa rota superior a 18 horas. Os níveis de IL-8 foram maiores no grupo sem pré-eclampsia materna [157.1 pg/ml (86.4-261.3) e 26.54 pg/ml (3.6-87.2) p<0.001 para não préeclampticos e pré-eclampticos, respectivamente]. Após análise por regressão múltipla apenas a ausência de pré-eclampsia foi associada com níveis elevados de IL-8. Conclusão: O prematuro de mãe com pré-eclampsia apresenta níveis reduzidos de IL-8, sugerindo que a ativação leucocitária possa estar prejudicada nestes recém-nascidos. / Neutropenia is frequent in newborn infants of preeclamptic mothers.Information on leukocyte activation in those newborns is scarce, but IL-8 and GRO- are the main proinflammatory cytokines involved. The aim was to study IL-8 and GRO- plasma levels in preterm newborn infants of preeclamptic mothers. Methods: Newborn infants with gestational age < 36 weeks and birth weight < 2000 grams were included and divided: non-preeclamptic and preeclamptic groups. Exclusion criteria: major congenital malformations, inborn errors of metabolism or chromosomal anomalies,STORCH infections, inborn preterm that died in the delivery room, and those whose mothers had chronic hypertension without preeclampsia. During the regular blood sample collection in the first 48 hours, a small amount was used for IL-8 and GRO- measurement by enzyme immunoassay. Chi-square, Student s t test, Mann Whitney test, Kruskal-Wallis and multiple logistic regression model were employed. Results: 119 preterm infants (64 non-preeclamptic and 55 preeclamptic). They were similar in birth weight, gestational age, Apgar scores at 5 minutes, sepsis, SDR, mechanical ventilation, TPN, NEC, intraventricular hemorrhage and death. The preeclamptic group had more neutropenia, SGA, C Section, and less rupture of membranes for > 18 hours. IL-8 was higher in the non-preeclamptic [157.1 pg/ml (86.4-261.3) e 26.54 pg/ml (3.6-87.2) p<0.001 non-preeclamptic and preeclamptic groups, respectively]. GRO-α was similar [229.5 pg/ml (116.6-321.3) and 185.5 pg/ml (63.9-306.7) p=0.236 in non-preeclamptic and preeclamptic groups, respectively]. After multiple regression analysis only absence of preeclampsia was associated with high IL-8 levels. Conclusions: Preterm newborn infants of preeclamptic mothers have a decreased plasma level of IL-8, suggesting that the leukocyte activation may be impaired in infants of preeclamptic mothers.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-14T16:07:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Ronaldo Celerino_Biblioteca.pdf: 11538818 bytes, checksum: bb7cc47b8cb9d49a4b1e691267ae2ff3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-14T16:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Ronaldo Celerino_Biblioteca.pdf: 11538818 bytes, checksum: bb7cc47b8cb9d49a4b1e691267ae2ff3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-04 / CAPES, CNPq / A variabilidade genética humana tem desempenhado um papel importante para a compreensão de mecanismos envolvidos na susceptibilidade à infeção pelo HIV-1. O presente trabalho avaliou as distribuições de polimorfismos de base única (SNPs) em genes humanos relacionados à entrada (CCL3, CCL4, CCL5, CXCL12, CXCR6) e à replicação viral (APOBEC3G, CUL5, TRIM5, HLA-C e ZNRD1), e suas prováveis associações com a modulação da susceptibilidade à infecção pelo HIV-1 em uma população do Nordeste brasileiro (Recife-Pernambuco), a fim de estabelecer um modelo imunogenético de susceptibilidade ao HIV-1. Foi desenvolvido um estudo tipo caso-controle, utilizando pacientes infectados (HIV-1+) e controles saudáveis, os quais foram genotipados para 18 SNPs em genes reconhecidamente envolvidos na entrada e na replicação viral. Verificou-se que variantes nos genes CCL3 (rs1719134), CCL4 (rs1719153), TRIM5 (rs10838525) e CUL5 (rs11212495) foram mais frequentes em controles saudáveis; enquanto variantes em APOBEC3G e ZNRD1 (rs3869068) foram mais frequentes em pacientes HIV-1+, sugerindo, respectivamente, proteção e susceptibilidade à infecção pelo HIV-1 na população pernambucana. Neste sentido, sugere–se que SNPs em genes relacionados com a entrada e a replicação viral podem modular a susceptibilidade a infecção pelo HIV-1.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dominical_VeninaMarcela_M.pdf: 1517777 bytes, checksum: 002cdb44469c81ccafe110267d001ff0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, autoimune e sistêmica, caracterizada por ser uma poliartrite simétrica, acometendo preferencialmente os punhos, mãos e pés. O processo patológico que explique a AR ainda permanece desconhecido. A indução da resposta imune, característica da doença, resulta de uma inflamação nas articulações através da infiltração de células inflamatórias que são recrutadas para o tecido sinovial, onde elas aderem às células endoteliais e transmigram através da subcamada sinovial, formando complexos que produzirão citocinas inflamatórias, contribuindo para a hiperplasia da camada sinovial e estimulando a produção de mais citocinas e enzimas capazes de degradar a matriz óssea, provocando a destruição das articulações afetadas. No líquido sinovial, os neutrófilos são o principal tipo celular, atraídos para as articulações inflamadas por quimioatraentes como LTB4, C5a, IL-8 e TGF-?, e expostos a uma variedade de citocinas locais pró-inflamatórias como IL-1?, TNF-?, GM-CSF, IL-6 e IL-18. Estudos demonstraram que os neutrófilos têm papel indutor na geração de inflamação e esforços visando compreender os mecanismos exercidos pelos neutrófilos nesta doença podem ser um ponto chave para intervenções farmacológicas, promovendo a melhora dos sintomas e gravidade da doença. Diante disso, este estudo objetivou avaliar as propriedades adesivas e quimiotáticas de neutrófilos de pacientes com AR (com atividade e em remissão da doença) e verificar a influência das diferentes medicações utilizadas atualmente no tratamento da AR quanto a estas propriedades. Cento e vinte e três pacientes com artrite reumatoide em estado ativo ou de remissão da doença foram inclusos no estudo e divididos em três grupos: pacientes não tratados com drogas direcionadas para a AR (AR nt), pacientes tratados com drogas modificadoras da doença (AR dm) e pacientes tratados com agentes biológicos (AR ab); os indivíduos sem a doença foram nossos controles (Con). Os neutrófilos foram separados do sangue periférico e realizados ensaios de adesão estática e de quimiotaxia celular, ambos in vitro. Foi verificada a expressão gênica e de superfície de algumas proteínas envolvidas no processo adesivo. Além disso, foram quantificadas no soro e líquido sinovial destes pacientes, quimiocinas envolvidas no recrutamento de neutrófilos e a L-selectina - molécula de adesão expressa em leucócitos. Os neutrófilos da circulação periférica de pacientes com AR em atividade da doença não apresentaram alterações quanto às propriedades adesivas em relação a indivíduos saudáveis. Ainda, neutrófilos de pacientes em terapia com agentes biológicos apresentaram aumento das propriedades migratórias comparados a pacientes AR sem tratamento. Interessantemente, os neutrófilos de pacientes com AR em remissão da doença apresentaram redução da capacidade adesiva e migratória dos neutrófilos quando na ausência de estímulo por IL-8. Apesar disso, não observamos diferenças quanto à adesão e à migração destes neutrófilos quando estimulados por esta citocina. O líquido sinovial de pacientes com AR em atividade da doença possui alto potencial quimiotático frente a neutrófilos e foram encontrados níveis elevados de IL-8 e ENA-78 tanto neste fluído, como também no sangue periférico. Há aumento da expressão gênica de L-selectina em neutrófilos de pacientes com AR em atividade da doença, mas curiosamente, não encontramos diferenças quanto à expressão desta molécula na superfície dos neutrófilos ou a sua presença no soro. Em destaque, observamos redução significativa de expressão na superfície neutrofílica de L-selectina e LFA-1 em pacientes em remissão da doença. Esses resultados sugerem que a remissão do quadro inflamatório da AR parece estar associada a alterações significantes nas principais quimiocinas atraentes de neutrófilos na circulação destes indivíduos e que são acompanhadas por modificações funcionais dos neutrófilos. Especulamos se estas características podem participar na melhora do quadro clínico em pacientes com artrite reumatoide / Abstract: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that is autoimmune and systemic, and characterized by a symmetric polyarthritis, affecting mainly the wrists, hands and feet. The pathological process that explains RA remains unknown. The induction of an immune response, characteristic of the disease, results from an inflammation of the joints through the infiltration of inflammatory cells that are recruited to the synovial tissue, where they adhere to endothelial cells and transmigrate through the synovial sublayer, forming complexes that produce inflammatory cytokines. These complexes induce hyperplasia of the synovial layer and stimulate the further production of cytokines and enzymes, leading to the degradation of the bone matrix, and resulting in the destruction of affected joints. In the synovial fluid, neutrophils are the main cell type and are attracted to the inflamed joints by chemoattractants, such as LTB4, C5a, IL-8 and TGF-?, and exposed to a variety of local pro-inflammatory cytokines such as IL-1?, TNF -?, GM-CSF, IL-6 and IL-18. Studies have shown that neutrophils play a role in inducing the generation of inflammation, and efforts to understand the mechanisms deployed by neutrophils in this disease may be a key point for the development of pharmacological interventions to ameliorate symptoms and disease severity. Thus, this study evaluated the chemotactic and adhesive properties of neutrophils in patients with RA and the influence of different drugs, currently used in the treatment of this pathology, on these properties. One hundred and twenty-three patients with active RA or in disease remission were enrolled and divided into three groups; patients not treated with drugs specifically for RA (AR nt), patients treated with disease-modifying antirheumatic drugs (AR dm) and patients treated with biological agents (AR ab); healthy individuals were used as controls (Con). Neutrophils were separated from peripheral blood and static adhesion assays and cell chemotaxis assays were performed in vitro. We verified the gene and surface expression of some proteins involved in the adhesive process. Moreover, chemokines involved in the recruitment of neutrophils and L-selectin, a cellular adhesion molecule expressed in leukocytes, were quantified in the serum and synovial fluid of these patients. Neutrophils from the peripheral blood of RA patients with active disease demonstrated no difference in adhesive properties, compared to healthy subjects. Furthermore, patients on therapy with biological agents had increased migratory properties, compared to patients without specific RA treatment. Interestingly, neutrophils from RA patients in remission of disease presented reduced adhesive and migratory capacity in the absence of stimulus. Nevertheless, no differences were observed in these properties with IL-8 stimulus. The synovial fluid of RA patients with active disease has a high chemotactic potential for neutrophils and presented significantly higher levels of IL-8 and ENA-78 in this fluid, as well as in the peripheral blood. An increased gene expression of L-selectin in RA patients with active disease was observed, but interestingly, we found no differences in surface expression or presence in the serum of this molecule. Of note, a significant decrease in the surface expression of neutrophil L-selectin and LFA-1 was observed in patients in remission of disease. Results suggest that the remission of the RA inflammatory state appears to be associated with significant alterations in major neutrophil-attracting chemokines in the circulation of individuals, contributing possibly, to neutrophils function alteration in these individuals and the consequent amelioration of the disease / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Carla Fernanda Franco Penteado, Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:31:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pallis_FlaviaRubia_M.pdf: 1011006 bytes, checksum: e3d5e88e81757d2d836d12cb03176e09 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estado homozigoto para hemoglobina S é denominado anemia falciforme. A inflamação tem papel importante no processo de vaso-oclusivo nesta doença; leucócitos, citocinas pró-inflamatórias e moléculas de adesão estão aumentados no sangue periférico dos pacientes com anemia falciforme. A leucocitose está associada com a morbidade e mortalidade nestes pacientes. Além disso, os neutrófilos de pacientes com anemia falciforme apresentam aumento nas propriedades adesivas e quimiotáticas. No entanto, há poucas evidências sobre as possíveis alterações funcionais dos eosinófilos e na produção de mediadores derivados destas células. Os eosinófilos participam intensamente de processos inflamatórios das vias aéreas, são numericamente maiores e apresentam propriedades adesivas aumentadas na anemia falciforme. Os pulmões são particularmente vulneráveis aos eventos vaso-oclusivos na anemia falciforme e as complicações pulmonares são as principais causas de morte e a segunda causa mais comum de hospitalização em pacientes com esta doença. Atualmente a hidroxiureia é o único medicamento utilizado no tratamento das manifestações clínicas da anemia falciforme, por aumentar os níveis de Hb fetal, reduzindo a polimerização da hemoglobina S, a neutrofilia e algumas complicações associadas ao fenômeno vaso-oclusivo. Considerando a escassez de estudos que avaliaram a participação dos eosinófilos na fisiopatologia da anemia falciforme, este projeto visou comparar as propriedades adesivas, a capacidade quimiotática, a desgranulação e a produção de mediadores em eosinófilos de pacientes com anemia falciforme. Além disso, foi investigado se o tratamento com hidroxiureia interfere nas funções dos eosinófilos. Amostras de sangue periférico de pacientes com anemia falciforme foram analisadas e demonstraram maior número absoluto de eosinófilos comparados aos pacientes sem o tratamento com hidroxiureia e aos indivíduos controle. A adesão basal dos eosinófilos de pacientes tratados com hidroxiureia confirmamos que estas células são mais aderentes a fibronectina que os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme sem o mesmo tratamento e de indivíduos controle. Além disso, não foi observada nenhuma alteração na adesão destas células quando estimulada com quimiocinas (RANTES, Eotaxina, IL-5). A citometria de fluxo foi utilizada para comparar a expressão e ativação das principais moléculas de adesão nestes eosinófilos, e identificou-se um aumento de expressão da subunidade ? da integrina MAC-1 de pacientes com anemia falciforme sem tratamento com hidroxiureia. Os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme em tratamento ou não com hidroxiureia apresentaram maior capacidade de migração espontânea e em resposta aos agentes quimiotáticos (RANTES, Eotaxina, IL-5). Além disso, estes pacientes apresentaram níveis séricos e plasmáticos de RANTES e de Eotaxina-1 elevados. Os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme apresentaram maior desgranulação, consequentemente liberou maior quantidade de peroxidase eosinofílica e de neurotoxina derivada dos eosinófilos que os pacientes que foram tratados com hidroxiureia e aos indivíduos controle, mas a co-incubação com RANTES, Eotaxina e IL-5 não alterou esta resposta. Por fim foi observado aumento na produção de espécies reativas de oxigênio nestes pacientes. No conjunto, nossos resultados sugerem que os eosinófilos contribuem significativamente para o processo de vaso-oclusão observado na anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia is the homozygous state for hemoglobin S. Inflammation plays an important role in the vaso-occlusive process of the disease, where leukocytes, proinflammatory cytokines and adhesion molecules are increased in the peripheral blood of patients with sickle cell anemia. Leukocytosis is associated with morbidity and mortality in these patients. Moreover, neutrophils from sickle cell patients show increased chemotactic and adhesive properties. However, there is little evidence about the possible functional changes in eosinophils and production of mediators derived from these cells. The eosinophils are involved in airway inflammatory processes and are numerically larger and have increased adhesive properties in sickle cell anemia. The lungs are particularly vulnerable to vaso-occlusive events in sickle cell anemia and pulmonary complications are the leading causes of death and second most common cause of hospitalization in these patients. Hydroxyurea is currently the only drug used to treat the clinical manifestations of sickle cell anemia by increasing the levels of fetal hemoglobin, reducing the hemoglobin S polymerization, neutrophils and some complications associated with vaso-occlusive phenomenon. Considering the scarcity of studies that have evaluated the role of eosinophils in the pathophysiology of sickle cell anemia, this project aimed to compare the adhesive properties, chemotaxis capacity, degranulation and production of mediators in eosinophils of patients with sickle cell anemia. Furthermore, we investigated whether treatment with hydroxyurea interferes with the function of eosinophils. Blood samples from patients with sickle cell anemia were analyzed and showed higher absolute number of eosinophils compared with patients without treatment with hydroxyurea and control subjects. The basal adhesion of eosinophils from patients treated with hydroxyurea confirmed that these cells are more adhesive to fibronectin than eosinophils of patients with sickle cell disease without the same treatment and control subjects. Moreover, there was no change in the adhesion of these cells when stimulated with chemokines (RANTES, Eotaxin, IL-5). Flow cytometry was used to compare the expression and activation of major adhesion molecules in these eosinophils, and we identified an increased expression of ? subunit of integrin Mac-1 in patients with sickle cell disease without treatment with hydroxyurea. Eosinophils from patients with sickle cell disease, treated or not with hydroxyurea, had a higher capacity for spontaneous migration and chemotaxis in response to chemotactic agents (RANTES, Eotaxin, IL-5). Moreover, these patients had higher serum and plasma RANTES and Eotaxin-1. Eosinophils from patients with sickle cell anemia had increased degranulation and a consequently higher amount of released eosinophil peroxidase and eosinophil-derived neurotoxin than patients who were treated with hydroxyurea and control subjects, but the co-incubation with RANTES, Eotaxin and IL-5 did not alter this response. Finally, there was an increased production of reactive oxygen species in these patients. Overall, our results suggest that eosinophils contribute significantly to the process of vasoocclusion observed in sickle cell anemia / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Ciências Médicas

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T12:17:17Z No. of bitstreams: 1 hervaldelacerdabonfante.pdf: 995668 bytes, checksum: 748fb8eea98b5b0a025cf634a825ef38 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:55:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hervaldelacerdabonfante.pdf: 995668 bytes, checksum: 748fb8eea98b5b0a025cf634a825ef38 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hervaldelacerdabonfante.pdf: 995668 bytes, checksum: 748fb8eea98b5b0a025cf634a825ef38 (MD5) Previous issue date: 2008-05-15 / Este estudo teve o objetivo de avaliar o uso de hidroxicloroquina (HCQ) em pacientes com osteoartrite (OA) primária e sintomática de joelhos analisando a resposta clínica através de índices funcionais como o Western Ontario and McMaster Universities Index (WOMAC), o índice algo funcional de Lequesne e a escala visual analógica (EVA). Por outro lado, avaliou a dosagem sérica das quimiocinas monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), interleukin-8 (IL-8), interferon gamma-inducible protein-10 (IP-10) e monokyne induced by interferon-gamma (MIG) e a influência do uso da HCQ nestas dosagens. Concluíram o estudo 29 pacientes com diagnóstico de OA sintomática de joelhos que foram divididos em 2 grupos, 16 pacientes utilizaram HCQ na dosagem de 400mg/dia e 13 receberam placebo. O estudo teve a duração de 16 semanas. Dois grupos controle foram incluídos nesse estudo, o primeiro constituído de 10 indivíduos que não possuíam OA de joelhos, com idade superior a 60 anos (controle idoso), não apresentavam queixas álgicas, nem evidência clínica ou radiológica de OA de joelhos e o segundo formado por 10 indivíduos adultos jovens sadios com idade inferior a 40 anos (controle jovem). As quimiocinas MCP-1, IL-8, IP-10 e MIG foram dosadas no soro, utilizando o método de citometria de fluxo (cytometric bead array). A dosagem destas quimiocinas foi repetida após quatro meses nos 29 pacientes com OA. Quanto aos resultados, não houve diferença significativa entre os grupos com OA nos índices de WOMAC, Lequesne e na EVA. Com relação a dosagem de quimiocinas, não houve diferença entre os pacientes com OA antes e após o tratamento com HCQ. O grupo formado por adultos jovens apresentou dosagem menor das quimiocinas IP-10 (p = 0,02), MCP-1 (p = 0,04), MIG (p < 0.0001) e IL-8 (p < 0.0001) em relação aos dois grupos de pacientes e ao grupo controle idoso. Concluiu-se que a HCQ utilizada por 4 meses, não alterou os níveis séricos das quimiocinas MCP-1, IL-8, IP-10 e MIG em pacientes com OA sintomática de joelhos, entretanto os pacientes com OA e os indivíduos com idade superior a 60 anos apresentaram níveis séricos de todas as quimiocinas estudadas maiores que o grupo jovem, sendo mais evidente nas dosagens de MCP-1 e IL-8 no grupo com OA quando comparado com o grupo jovem, demonstrando que ocorre um aumento dos níveis séricos de quimiocinas com o envelhecimento.Ficou caracterizada a importância da obesidade na OA, não só pela grande prevalência neste estudo, como pela diferença estatisticamente significativa do índice de massa corporal (IMC) entre o grupo idoso sem evidências clínicas de OA de joelhos e o grupo com OA (p < 0.001).Este trabalho foi o primeiro a Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. fazer a correlação entre OA de joelhos e quimiocinas séricas antes e após uso de HCQ. Novos estudos são necessários, inclusive com análise do líquido sinovial, devido a possibilidade de que as alterações das estruturas articulares ocorridas na OA possam estar associadas com elevação dos níveis de quimiocinas apenas na articulação e não no soro. / This study assessed the clinical and biological responses of patients with primary and symptomatic knee osteoarthritis (OA) to hydroxychloroquine. (HCQ) Clinical impact was assessed through Western Ontario and McMaster Universities Index (WOMAC), Lequesne-algofunctional index, and visual analog scale (VAS). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), interleukin-8 (IL 8), interferon-gamma-inducible protein-10 (IP-10), and monokine induced by interferon-gamma (MIG) serum levels were obtained for assessment of the biological impact. 29 patients diagnosed with symptomatic knee OA were divided in two groups: 16 received HCQ 400mg/day and 13 received placebo. The study lasted 16 weeks. Two control groups were formed: the first one composed of 10 asymptomatic subjects over 60 years of age, without any clinico-radiological evidence of knee OA (elderly controls), and the second one composed of 10 healthy adults under 40 years of age (young controls). Serum levels of MCP-1, IL-8, IP-10, and MIG chemokines were measured through cytometry (cytometric bead array) at baseline in all groups, and after four months in the 29 OA patients. WOMAC, Lequesne, and VAS results did not significantly differ among the groups. Chemokine levels before and after treatment with chloroquine did not differ in OA patients. The young controls had lower levels of IP-10 (p = 0.02), MCP-1 (p = 0.04), MIG (p < 0.0001), and IL-8 (p < 0.0001), compared to the other two groups. Hydroxychloroquine for four months did not alter serum levels of MCP-1, IL-8, IP-10 and MIG chemokines in symptomatic patients with knee OA. However, OA patients and elderly controls had higher levels of all chemokines studied as compared to young controls (chiefly MCP-1 and IL-8 in the OA group compared with young controls), pointing to an increase in the serum levels of chemokines with aging. Obesity was shown to influence OA, not only because of the high prevalence found, but also because of the statistically significant difference in body mass index (BMI) found between elderly controls and the OA group (p < 0.001). This is the first study to correlate knee OA with serum chemokines before and after chloroquine use. Because joint damage might lead to joint limited chemokine increase without any serum change, further studies involving synovial fluid analysis are warranted.

A prevalência de doenças respiratórias alérgicas tem aumentado, embora de origem multifatorial, a atividade física parece representar um importante contribuinte. Objetivo: Nós hipotetizamos que o condicionamento aeróbio (AC) prévio à sensibilização com OVA, poderia reduzir a inflamação das vias aéreas, através de um desbalanço via Th1/Th2 ou da citocina regulatória (IL-10). Métodos: camundongos BALB/c foram divididos em 4 grupos (n=8): não treinados e não-sensibilizados (controle), treinados e não-sensibilizados (AC), não treinados e sensibilizados-OVA (OVA) e o grupo treinado e sensibilizado (OV+AC). O condicionamento aeróbio foi realizado em esteira ergométrica adaptada para camundongos por 8 semanas, seguidos de sensibilização por OVA ou soro fisiológico. Foram avaliadas a inflamação celular das vias aéreas e peribrônquica, títulos IgE e IgG1, expressão de Th1 (IL-2 e IFN-), Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), citocina regulatória (IL -10), PGE2 e remodelamento das vias aéreas. No peribrônquico a expressão de eotaxina, RANTES, ICAM-1, VCAM-1, TGF- e VEGF. Resultados: Os grupos controle e AC tiveram resultados semelhantes nas avaliacões (p> 0,05). O grupo OVA apresentou células inflamatórias nas vias aéreas e região peribrônquica, remodelamento e um aumento da IgG1 e títulos IgE (p <0,05). Apresentou um aumento na expressão de citocinas Th2, mas não Th1, assim como, aumento na expressão de IL-10, ICAM-1, VCAM-1, RANTES, TGF- e VEGF também foram observadas. O grupo OVA+AC apresentou uma menor migração de eosinófilos e linfócitos para as vias aéreas inferiores e titulação de IgG1 e IgE (p<0,05) e menor expressão de citocinas Th2, porém, os níveis Th1 não foram alterados. A inibição da expressão de IL-10, ICAM-1, VCAM-1, RANTES, TGF- e VEGF, assim como, o remodelamento das vias aéreas, também foi observado no grupo OVA+AC (p<0,05). Conclusão: Nossos resultados sugerem que a melhora do condicionamento aeróbio inibi a sensibilização e a inflamação alérgica / Prevalence of allergic respiratory diseases has increased and although its origin likely multifactorial, reduced physical activity seems to represent an important contributor. Objective: We hypothesize that an improvement in aerobic conditioning (AC) previous to OVA sensitization would reduce airway inflammation via either an imbalance Th1/Th2 pathway or regulatory cytokine (IL-10). Methods: BALB/c mice were divided in 4 groups (n=8): non-trained and non-sensitized (Control), AC and non-sensitized (AC), non-trained and OVA-sensitized (OVA), and AC and OVA (OVA+AC). AC was performed in a treadmill (8 weeks) followed by either OVA or saline sensitization. It was evaluated airway and peribronchial cell inflammation, specific OVA-IgE and -IgG1 titers, expression of Th1 (IL-2 and IFN-), Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) or regulatory (IL-10) cytokines, PGE2 and airway remodeling. Peribronchial expression of eotaxin, RANTES, ICAM-1, VCAM-1, TGF- and VEGF was also evaluated. Results: AC and control groups had similar results in all evaluated outcome (p>0,05) OVA sensitization induced airway and peribronchial cell inflammation and remodeling and an increase in the IgG1 and IgE titers (p<0,05). An increase in the expression of Th2 but not Th1 cytokines was well as an increase in the expression of IL-10, ICAM-1, VCAM-1, RANTES, TGF- and VEGF was also observed. OVA+AC group presented a lower migration of eosinophils and lymphocytes to the airways and lower titer of IgG1 and IgE (p<0,05). OVA+AC group also presented lower expression of Th2 cytokines however Th1 levels were unchanged. A lower expression of IL-10, ICAM-1, VCAM-1, RANTES, TGF- and VEGF as well as airway remodeling was also observed in OVA+AC group (p<0,05). Conclusion: Our results suggest that improvement in aerobic conditioning inhibit allergic sensitization and inflammation

INTRODUÇÃO: A urticária crônica é caracterizada pelo aparecimento de placas eritêmato-edematosas, pruriginosas, que perduram por mais de seis semanas. A etiologia é desconhecida na maioria dos pacientes sendo definida como idiopática (UCI). A desregulação imunológica na UCI pode ser devido a distúrbios na produção de citocinas e quimiocinas. OBJETIVOS: Avaliar o perfil citocinas e quimiocinas em pacientes submetidos ao teste de soro autólogo (ASST) avaliando os soros, a expressão de RNAm e a expressão intracelular de células mononucleares do sangue periférico (CMN) induzidas por estímulos policlonais. METODOLOGIA: Pacientes com UCI (n=37) foram selecionados do Ambulatório de Dermatologia do HC-FMUSP e submetidos ao ASST. O grupo controle foi constituído por indivíduos saudáveis (n=33). Os níveis séricos de citocinas e quimiocinas foram determinados por citometria de fluxo ou por ELISA e a expressão de RNAm de citocinas foi determinada por Real-Time PCR. RESULTADOS: Uma elevação dos níveis séricos de TNF-, IL-6, IL-1, IL-12p70 e IL-10 foi detectada nos pacientes com UCI comparados ao grupo controle, independente da resposta ao ASST. A secreção in vitro de citocinas por CMN estimuladas por fitohemaglutinina (PHA) mostrou aumento da produção de IL-2 nos pacientes com UCI e de IL-17A e IL-10 no grupo ASST positivo em relação ao grupo controle. A expressão de RNAm para IL-10 em CMN, foi diminuída no grupo ASST negativo comparado ao grupo controle. Além disto, um aumento da capacidade linfoproliferativa ao mitógeno Pokeweed foi observado nos pacientes ASST positivo em relação aos indivíduos controles. Os níveis séricos de CXCL8, CCL2, CXCL10 e CXCL9 foram encontrados elevados nos pacientes com UCI em relação aos controles. A secreção de quimiocinas in vitro, foi observado aumento dos níveis basais de CCL2 pelas CMN dos pacientes em relação aos controles, que se elevaram em resposta a enterotoxina A de Staphylococcus aureus (SEA). Já o estímulo com PHA promoveu aumento na produção de CXCL8 e CCL5 pelas CMN dos pacientes. A expressão intracelular de CXCL8 foi detectada principalmente nas células CD14+. A intensidade média de fluorescência (MFI) e a porcentagem da expressão de CXCL8 em CD14+ nos níveis basais e estimulados com SEA encontram-se diminuídos nos pacientes com UCI comparado ao grupo controle. A expressão intracelular de CCL2 em células CD14+ mostrou uma queda na porcentagem dos níveis basais somente nos pacientes ASST negativo em relação ao grupo controle. Além disto, em condições basais de cultura houve um aumento na porcentagem da expressão de CCR5 em células T CD8+ de pacientes com UCI, em função do aumento no grupo ASST positivo. CONCLUSÕES: Os resultados enfatizam o conceito de desequilíbrio imunológico na UCI, independente da resposta ao ASST, evidenciado pelo aumento na secreção de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias. Estes dados sugerem que na UCI, os linfócitos e monócitos estão ativados, os quais podem contribuir para a imunopatogênese da doença / INTRODUCTION: Chronic urticaria is skin disorder characterized by recurrent and transitory itchy weals occurring regularly for more than 6 weeks. The aetiology is not identified in most patients being considered as idiopathic (CIU). The immunological dysregulation in CIU could be due to a disturbed cytokines and chemokines production. OBJECTIVES: To evaluate the pattern of cytokine and chemokine in CIU patients who undergone autologous serum skin test (ASST), assessing sera, mRNA expression and intracellular expression of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) through the secretion upon induced by policlonal stimuli. METHODS: CIU patients (n=37) were selected from the Dermatological Outpatient Clinic of the Hospital das Clínicas de São Paulo (HC-FMUSP) and submitted to the ASST. The control group consisted of healthy subjects (n=33). Cytokine and chemokine levels were assessed by flow cytometer and ELISA and mRNA expression was analyzed by Real-Time PCR. RESULTS: Elevated levels of TNF-, IL-6, IL-1, IL-12p70 and IL-10 were observed in sera from CIU patients compared to healthy control group. CIU patients also showed increased IL-2 production by PBMC stimulated with phytohemagglutinin (PHA). Moreover, it was observed higher IL-17A and IL-10 levels in the ASST+ group compared to control group. The IL-10 mRNA expression was diminished in the ASST- group compared to control group. Furthermore, an increased lymphoproliferative response to Pokeweed mitogen was observed in the ASST+ patients compared to healthy subjects. Seric levels of CXCL8, CCL2, CXCL10 and CXCL9 were higher in CIU patients. Regarding the in vitro chemokines secretion, it was detected higher basal levels of CCL2 in CIU patients, which was increased by Staphylococcus aureus enterotoxin A (SEA). Stimulation with PHA increased the CXCL8 and CCL5 production by CIU mononuclear cells. The main source of CXCL8 was the CD14+ cells. CIU CD14+ cells showed decreased mean fluorescence intensity and percentage of CXCL8 expression with and without SEA stimuli. The percentage of CD14+ producing CCL2 was lower in ASST- patients compared to healthy control subjects. Furthermore, in the absence of stimuli the percentage of CCR5-expressing CD8+ T cells was higher in CIU patients, mainly due to an increased expression by the ASST+ group. CONCLUSIONS: These results indicate an immunological dysregulation in CIU, without association to ASST response, which was evidenced by the increased production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. The data suggest a higher activation of monocytes and lymphocytes in CIU, which may contribute to its immunopathogenesis

Orientador: Maria Heloísa de Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - UniversidadeEstadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amarante_FernandaGambogiBraga_D.pdf: 4196475 bytes, checksum: 56f21492faf4255d8c10af9a3b41018c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Pacientes com a forma juvenil da paracoccidioidomicose (PCM) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada por teste de hipersensibilidade do tipo tardio negativo e proliferação linfocitária deficiente a antígenos do fungo e pela produção de citocinas do tipo TH2 como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-?. Além disso, um aspecto comum desta forma da doença é o número elevado de eosinófilos no sangue periférico, que retorna a valores normais após o tratamento antifúngico. O papel dos eosinófilos na PCM nunca foi investigado. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade funcional de eosinófilos de 15 pacientes com a forma juvenil da PCM. Para tanto eosinófilos isolados do sangue periférico de pacientes (antes e durante o tratamento antifúngico) e de doadores sadios (controles) foram avaliados quanto a: capacidade quimiotática em resposta ao RANTES, eotaxina e IL-5; capacidade de adesão a células endoteliais pulmonares; expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos (CD80, CD86, MHC de classe II, TLR-2 e TLR-4), de moléculas de adesão (CD11a, CD11b, CD49d e CD54), de receptores de IgE (CD23 e FC?RI?), marcadores de ativação (CD69) e do receptor CCR3; atividade fungicida direta contra leveduras de P. brasiliensis e expressão gênica de citocinas, quimiocinas e proteínas de grânulos. Também foi realizada a dosagem dos níveis séricos de constituintes dos grânulos citotóxicos (MBP, EPO, ECP e EDN) e das quimiocinas CCL5, eotaxina, CXCL9, CXCL10 em pacientes antes e durante o tratamento antifúngico e controles. Biópsias de linfonodos e fígados dos pacientes foram analisadas quanto a expressão de RANTES, eotaxina, MBP, IL-25 e IDO. Os resultados mostraram eosinofilia periférica em 86,7% dos casos, altos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis e concentração sérica elevada de proteína C reativa. A resposta quimiotática à eotaxina, a adesão a HLECs e a expressão do RNAm para IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 e CXCL8 foi maior nos eosinófilos de pacientes comparados aos controles. Eosinófilos de pacientes, assim como de controles, foram capazes de matar leveduras de P. brasiliensis. Maior frequência de eosinófilos CD69+ e TLR2+ e menor frequência de eosinófilos CD80+, MHC de classe II+, TLR-4+, CD23+ e CD11a+ foi observada em pacientes comparado aos controles. O acompanhamento dos pacientes durante o tratamento antifúngico mostrou a redução número de eosinófilos do sangue periférico, da concentração sérica de proteína C reativa, dos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis, dos níveis séricos de proteínas citotóxicas e quimiocinas, além de aumento da capacidade migratória em resposta à eotaxina. Adicionalmente, eosinófilos de pacientes apresentam redução da expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos, de ativação, de moléculas de adesão, do receptor de IgE CD23 e do receptor CCR3 durante o tratamento antifúngico. Nas lesões causadas pelo fungo em linfonodos e fígado foi detectada marcação positiva para MBP, eotaxina, RANTES, IL-25 e IDO. Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar que os eosinófilos dos pacientes com a forma juvenil da PCM encontram-se ativados (alta expressão do CD69) e poderiam estar contribuindo para a intensa resposta inflamatória que caracteriza a fase inicial da forma juvenil da PCM e prejudica a resposta de eliminação do fungo. Após o tratamento antifúngico, observou-se uma diminuição dos parâmetros analisados, exceto a capacidade quimiotática dos eosinófilos que aumentou devido, provavelmente, a redução de inibidores da quimiotaxia como o CXCL9 e CXCL10 / Abstract: Patients with juvenile form of paracoccidioidomycosis (PCM) have a depressed cellular immune response as shown by negative delayed-type hypersensitivity, suppressed lymphocyte proliferation to P. brasiliensis antigens, and production of TH2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-?. Furthermore, a common feature of this disease is the large number of eosinophils in the peripheral blood that returns to normal values after antifungal treatment. The role of eosinophils in PCM has never been investigated. This study aimed to evaluate the phenotypic and functional characteristics of eosinophils of 15 patients with the juvenile form of PCM. Eosinophils of patients isolated from peripheral blood (before and during the antifungal treatment) and of healthy donors (controls) were evaluated for: chemotactic response to RANTES, eotaxin and IL-5; adhesion to human lung endothelial cells (HLECs); expression of antigen recognition and presentation molecules (CD80, CD86, MHC class II, TLR2 and TLR-4), adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD49d and CD54), IgE receptors (CD23 and FC?RI?), activation marker (CD69) and CCR3; direct fungicidal activity against P. brasiliensis yeast cells and gene expression of cytokines, chemokines and protein granules. We also assessed serum levels of granules cytotoxic molecules (MBP, EPO, ECP and EDN) and chemokines (CCL5, eotaxin, CXCL9, CXCL10) in patients before and during the antifungal treatment and controls. Lymph nodes and liver biopsies of patients were stained for RANTES, eotaxin, MBP, IL-25 and IDO. The results showed peripheral eosinophilia in 86.7% of cases, high titers of antibodies to P. brasiliensis and high concentration of C-Reactive Protein. The chemotactic response to eotaxin, adhesion to HLECs and expression of mRNA for IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 and CXCL8 was higher in eosinophils of patients than in controls. Eosinophils of patients as well as of controls were able to kill P. brasiliensis yeast cells. A higher frequency of eosinophil CD69+ and TLR2+ and lower frequency of eosinophil CD80+, MHC class-II+, TLR-4+, CD23+ and CD11a+ was found in patients compared to controls. Patient's follow-up showed a reduction in the number of eosinophils in peripheral blood, serum concentration of C-Reactive protein, anti-P. brasiliensis antibodies, serum levels of cytotoxic proteins and chemokines, in addition to increased migration capacity. Moreover, eosinophils of patients exhibited reduced expression CD80, MHC class-II, TLR-4, CD23, CD11a, CD11b, CD23, CD69 and CCR3 during the antifungal treatment. Immunohistochemistry staining showed strong expression of MBP, eotaxin, RANTES, IL-25 and IDO in liver and lymph nodes biopsies from PCM patients. In conclusion, this study demonstrated that eosinophils are strongly activated (high CD69 expression) and could contribute to the intense inflammatory response that characterize the initial phase of juvenile form of PCM response and impairs the elimination of the fungus. After antifungal treatment, there was a decrease of all parameters except the chemotactic ability of eosinophils which increased, probably due to reduction of inhibitors of chemotaxis such as CXCL9 and CXCL10 / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

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