Les cassures double-brin (DSB) sont des dommages dangereux de l’ADN et représentent un facteur de risque pour la stabilité du génome. Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour les cellules souches adultes, qui sont responsables de la régénération des tissus endommagés et de l'homéostasie tissulaire tout au long de la vie. La régénération musculaire chez l'adulte repose sur les cellules souches musculaires (cellules satellites, SCs) qui possèdent une remarquable capacité de réparation des DSB, mais dont le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Ce projet de thèse consistait à étudier comment la différenciation musculaire est affectée lorsque la réparation des DSB est altérée, et quels sont le(s) mécanisme(s) et les conséquences de ce défaut de réparation sur la régénération musculaire. Au cours de cette étude, il est apparu de façon originale que les facteurs de réparation des DSB peuvent affecter la myogenèse, indépendamment de leur fonction dans la réparation de l'ADN. La présente étude a porté sur le rôle de la protéine kinase dépendante de l'ADN (DNA-PK), un facteur crucial pour la réparation non-homologue des DSBs (NHEJ), au cours de la différenciation musculaire chez la souris. L’étude a ciblé l'activation des SCs et la régénération musculaire in vitro et in vivo et a également abordé la régulation de cette kinase. Le rôle "canonique" de la DNA-PK, et donc du NHEJ, dans les SCs a également été étudié en présence de lésions de l'ADN radio-induites. Le rôle d’ATM, une kinase qui orchestre les réponses cellulaires aux DSB, a également été abordé dans le contexte de la régénération musculaire. Ces résultats confirment la notion émergente du rôle multifonctionnel des protéines de réparation de l’ADN dans d’autres processus physiologiques que la réparation elle-même, ce qui m’a également permis de réaliser une étude bibliographique. Ce travail i) identifie de nouveaux régulateurs de la myogenèse et ii) contribue à la compréhension de la résistance des cellules souches musculaires au stress génotoxique. Ces résultats pourraient avoir des implications dans l'amélioration des thérapies cellulaires de la dysfonction musculaire en agissant sur les régulateurs nouvellement découverts. / DNA double-strand breaks (DSBs) are dangerous DNA damages and a risk factor for genome stability. The maintenance of genome integrity is crucial for adult stem cells that are responsible for regeneration of damaged tissues and tissue homeostasis throughout life. Muscle regeneration in the adult relies on muscle stem cells (satellite cells, SCs) that have a remarkable DSB repair activity, but the underlying mechanism is not known. The aims of the present PhD project were to investigate how muscle differentiation is affected when DSB repair is impaired, and which are the mechanism(s) and the consequences on muscle regeneration. During this study, a novel possibility has arisen, namely that DSB repair factors affects myogenesis independently of their DNA repair activity, suggesting a novel function, not previously anticipated, of these factors. The present study has addressed the role of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), a crucial factor in non-homologous end-joining (NHEJ) repair of DSBs, in muscle differentiation in the mouse. Studies have targeted SC activation and muscle regeneration in vitro and in vivo and also addressed the regulation of this kinase. In parallel the more “canonical” role of DNA-PK, and thereby of NHEJ, has been investigated in SCs via radiation-induced DNA damage. The role of ATM, a kinase that orchestrates cellular responses to DSBs in muscle regeneration has also been addressed. These results support the emerging notion of multifunctional repair proteins in a variety of physiological processes beyond the repair process itself, on which I have conducted a bibliographical study. This work i) identifies novel regulators of myogenesis, and ii) helps understanding the resistance of muscle stem cells to genotoxic stress. It has potential implications for improving cellular therapies for muscle dysfunction by acting on the newly discovered regulators.

Le système ubiquitine-protéasome représente une plateforme de signalisation cellulaire chez les eucaryotes et joue un rôle majeur dans la coordination des processus cellulaires. Des progrès récents suggèrent que l’ubiquitination joue un rôle important dans les phénomènes de séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un processus permettant la localisation d’une quantité accrue de protéines dans un compartiment subcellulaire, afin de réaliser une fonction biologique. En effet, il a été démontré que l’ubiquitination joue un rôle central dans les mécanismes qui gouvernent la LLPS durant la formation des granules de stress dans le cytoplasme ou les foci de réparation de l’ADN dans le noyau. D’autre part, chez la levure, des travaux ont montré que le protéasome est capable de s’assembler sous forme de granules dans le cytoplasme suite à un stress métabolique. Toutefois, les mécanismes par lesquels le système ubiquitine-protéasome ainsi que ses régulateurs contrôlent les processus de LLPS restent à déterminer. Dans la première étude de cette thèse, nous avons investigué le mécanisme d’action de la déubiquitinase USP16, qui a été suggérée comme un régulateur négatif de la LLPS, empêchant la formation des foci de réparations de dommages à l’ADN. Cependant, nos résultats démontrent que USP16 est majoritairement cytoplasmique et que seulement une entrée forcée de USP16 dans le noyau empêche la formation des foci de réparation des cassures double brin induites par des radiations ionisagntes et ce en favorisant la déubiquitination de l’histone H2A. De plus, aucune translocation nucléaire de USP16 n’a été observée durant le cycle cellulaire ou suite à des dommages à l’ADN. Nos travaux montrent que USP16 est activement exclue du noyau via son signal d’export nucléaire et régulerait indirectement la LLPS menant à la formation des foci de réparation de l’ADN. Dans la deuxième étude, nous décrivons le comportement dynamique des protéines du protéasome lors d’une LLPS induite par un stress métabolique. Nos résultats indiquent que le protéasome forme des foci distincts dans le noyau des cellules humaines en réponse à une privation de nutriments. Nous avons constaté que ces foci sont enrichis en ubiquitine conjuguée et nous avons démontré que le récepteur d’ubiquitine Rad23B ainsi que l’absence des acides aminés non essentiels sont des éléments clés nécessaires à l’assemblage de ces foci du iv protéasome. De plus, des expériences de survie cellulaire montrent que la présence de ces foci est associée à la mort des cellules par apoptose. En conclusion, nos travaux mettent en lumière l’importance du système ubiquitine-protéasome dans la formation et la régulation des foci cellulaires suite à une LLPS. De même, cette étude aidera également à approfondir notre compréhension sur les mécanismes qui gouvernent l’homéostasie des protéines, la survie cellulaire et le développement du cancer. / The ubiquitin-proteasome system represents a major cell-signaling platform in eukaryotes and plays a pivotal role in the coordination of cellular processes. Recent studies provided evidence that ubiquitination plays a role in liquid-liquid phase separation (LLPS), a process that results in the localization of highly increased levels of a protein in a defined subcellular compartment, in order to achieve a biological function. Indeed, ubiquitination has been shown to play a central role in the mechanisms that govern LLPS and subsequent formation of stress granules in the cytoplasm or the DNA repair foci in the nucleus. On the other hand, several studies have shown that the proteasome itself is able to form granules in the cytoplasm following metabolic stress in yeasts. However, the mechanisms by which the ubiquitin-proteasome system and its regulators control LLPS processes remain to be determined. In the first study of this thesis, we investigated the mechanism of action of USP16 deubiquitinase, which has been suggested as a negative regulator of LLPS preventing the formation of DNA damage repair foci. However, our results demonstrate that USP16 is predominantly cytoplasmic and that only enforced nuclear entry of USP16 prevents the formation of repair foci after double strand breaks induced by ionizing radiation, and this by promoting the deubiquitination of histone H2A. In addition, no nuclear translocation of USP16 was observed during cell cycle or following DNA damage. Our study shows that USP16 is actively excluded from the nucleus via its nuclear export signal and would indirectly regulate LLPS that lead to DNA repair foci. In the second study, we describe the dynamic behavior of proteasome proteins during metabolic stress, a process that involves LLPS. Our results indicate that the proteasome forms distinct foci in the nucleus of human cells in response to nutrients deprivation. We found that these foci are enriched with conjugated ubiquitin and demonstrated that the ubiquitin receptor Rad23B as well as the absence of nonessential amino acids are the key elements necessary for the assembly of these proteasome foci. In addition, cell survival experiments show that the presence of these foci is associated with cell death by apoptosis. In conclusion, our work has shed new light on the importance of the ubiquitin-proteasome system in the formation and regulation of cell foci following LLPS. Likewise, this vi study will also help deepen our understanding of the mechanisms leading to protein homeostasis, cell survival and cancer development.