Le processus visuel débute lorsque les photorécepteurs transforment la lumière en un signal biochimique qui est ensuite traité et transmis via la rétine. Notre groupe s'intéresse à élucider les défauts génétiques et les mécanismes à l'origine de pathologies rétiniennes comme la cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS), conséquence d'un défaut de transmission du signal entre les photorécepteurs et les cellules bipolaires. Cette thèse apporte de nouvelles connaissances sur la physiologie de cette première synapse visuelle. Nous avons identifié quatre nouvelles mutations dans SLC24A1, un échangeur ionique intervenant dans l'homéostasie du calcium dans les bâtonnets, à l'origine de la CNSC de type Riggs. Nous avons également identifié LRIT3 comme étant un nouveau gène impliqué dans la forme complète de CNCS. Nous avons décrit un modèle de souris invalidé pour Lrit3 avec un phénotype visuel similaire à celui des patients. Nous avons confirmé la localisation de LRIT3 aux extrémités dendritiques des cellules bipolaires ON, suggérant un rôle dans la cascade de signalisation mGluR6. Nous avons montré que LRIT3 était nécessaire à la localisation fonctionnelle de TRPM1. Nous avons de plus démontré un rôle additionnel de LRIT3 dans la formation de la synapse du cône n'impactant probablement que faiblement les voies OFF. Nous avons également réussi à détecter LRIT3 par spectrométrie de masse, ouvrant la voie à l'identification de ses partenaires. La meilleur connaissance de la physiologie et de la physiopathologie rétinienne doit mener non seulement à un meilleur diagnostic et conseil génétique des patients mais également au développement de nouvelles approches thérapeutiques. / The first steps in vision occur when rod and cone photoreceptors transform light into a biochemical signal, which gets processed through the retina. Our group investigates genetic causes and mechanisms involved in inherited retinal diseases as congenital stationary night blindness (CSNB), which reflects a signal transmission defect between photoreceptors and bipolar cells. This thesis gives several insights on the retinal physiology at this first visual synapse. We identified four novels mutations in SLC24A1 underlying the Riggs-type of CSNB, which has a role in calcium balance in rods. We subsequently identified a novel gene, LRIT3, which is mutated in the complete form of CSNB. We delivered a knock-out mouse model lacking Lrit3 which displays a phenotype similar to patients. We confirmed the localization of LRIT3 at the dendritic tips of ON-bipolar cells, suggesting a role of LRIT3 in the mGluR6 signaling cascade. We showed that LRIT3 is necessary for the functional localization of TRPM1. We also revealed that LRIT3 has an additional role in formation of the cone synapse but with probably only a minor effect on OFF-pathway functionality. We finally succeeded in immunoprecipitating and detecting LRIT3 by mass spectrometry, opening the way for the identification of LRIT3 partners. Improving knowledge about retinal physiology and physiopathology will lead to a better diagnosis and genetic counseling of the patients and to the development of novel therapeutic approaches.

Contrairement aux mammifères, la rétine des amphibiens et des poissons croît tout au long de la vie de l’animal grâce à l’activité de cellules souches neurales présentes dans une région de neurogenèse continue appelée zone marginale ciliaire (ZMC). Leur caractérisation moléculaire et la compréhension des mécanismes qui sous-tendent leur activité et leur maintenance pourraient trouver des applications majeures dans le traitement par thérapie cellulaire des patients atteints de pathologies neurodégénératives de la rétine. Au cours de ma thèse, je me suis principalement penché sur deux problématiques majeures : quelle est l’origine ontologique de ces cellules souches adultes et comment se maintiennent-elles au cours de la rétinogenèse embryonnaire ? J’ai abordé ces deux questions via l’analyse descriptive et fonctionnelle de deux gènes, Hes1 et Hes4, identifiés dans mon laboratoire comme des marqueurs spécifiques des cellules souches rétiniennes. Ces gènes codent pour des répresseurs transcriptionnels de type bHLHO. L’étude de leur dynamique d’expression au cours du développement montre que ces gènes marquent un territoire restreint, situé initialement à la frontière entre l'épithélium pigmenté rétinien (EPR) présomptif et la rétine neurale, dont l’évolution au cours du temps suggère qu’il est à l’origine de la cohorte des cellules souches adultes. Ces résultats permettent pour la première fois de proposer que ces dernières seraient ségrégées très tôt au cours de l’embryogenèse rétinienne des cellules destinées à se différencier. Je me suis ensuite posé la question du rôle de Hes1/4 dans la maintenance de ces cellules souches présomptives. Mes expériences de gain de fonction suggèrent que ces gènes contribuent de façon autonome cellulaire (i) à les empêcher de se différencier vers un destin EPR ou neuronal, (ii) à les maintenir en prolifération et (iii) à ralentir leurs divisions. Enfin, j’ai également travaillé à positionner les gènes Hes1/4 dans le réseau de signalisation qui contrôle les cellules souches rétiniennes en étudiant leur régulation par les voies Wnt, Hedgehog et Notch. L’ensemble de mes données me permet de proposer un modèle selon lequel les facteurs Hes1/4, sous contrôle positif de la voie Wnt, permettent au cours du développement la maintenance à l’état indifférencié et en prolifération lente d’une population cellulaire destinée à former la cohorte des cellules souches adultes de la ZMC. / The retina of fish and amphibian contains genuine neural stem cells located at the most peripheral edge of the ciliary marginal zone (CMZ). However, their cell-of-origin as well as the mechanisms that sustain their maintenance during development are presently unknown. We identified Hes1 and Hes4 (previously named XHairy1 and XHairy2, respectively), genes encoding bHLHO transcriptional repressors, as stem cell specific markers of the CMZ that are positively regulated by the canonical Wnt pathway and differentially regulated by Hedgehog signalling. We found that during retinogenesis, Hes1/4 labels a small territory, located first at the pigmented epithelium (RPE)/neural retina (NR) border and latter in the retinal margin, that likely gives rise to adult retinal stem cells. Our gain of function experiments show that Hes1/4 cell autonomously prevent retinal precursor cells from commitment towards retinal fates and maintain them in a proliferative state. Besides, our data highlight for the first time that Hes1/4 may also constitute crucial regulators of cell cycle kinetics. Hes1/4 gain of function indeed significantly slow down cell division, mainly through the lengthening of G1 phase. As a whole, we propose that Hes1/4 maintain particular stemness features in a cellular cohort dedicated to constitute the adult retinal stem cell pool, by keeping it in an undifferentiated and slowly proliferative state along embryonic retinogenesis.

La rétine numérique programmable est un imageur qui combine fonctions d'acquisition et de traitement de l'image au sein de chaque pixel. L'objectif de notre travail consiste à utiliser ce circuit dans un système de détection et d'analyse du mouvement en se conformant à ses capacités de calcul et de mémorisation limitées. Nous présentons d'abord trois méthodes de détection du mouvement adaptées à nos contraintes : un calcul de fond par une moyenne récursive classique ; un estimateur statistique, le filtre Σ-

La Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) est la principale cause de cécité chez les personnes de plus de 55 ans. Dans ses premiers stades, les patients peuvent ne pas ressentir de déficience visuelle. Aux stades avancés, la forme humide et la forme sèche doivent être distinguées. La forme humide est définie par la croissance de nouveaux vaisseaux sous la rétine. La forme sèche se caractérise par des atrophies souvent appelées atrophies géographiques des photorécepteurs et de l'épithélium pigmentaire de la rétine. Dans les deux formes, la rétine centrale peut être détruite par une dégénérescence substantielle des photorécepteurs accompagnée d'une perte de vision importante. Au cours des dernières années, l'autofluorescence du fond d'œil (Fundus AutoFluorescence (FAF)) a montré que l'imagerie pouvait être utile pour la DMLA, en particulier pour la DMLA de type sec au niveau du diagnostic, de la documentation des changements, de l'identification de la progression de la maladie, et du suivi des nouvelles thérapies. Les images autofluorescentes de la rétine sont obtenues avec un angiographe équipé d'un laser de 488 nm de longueur d'onde (ophtalmoscope à balayage laser (Scanning Laser Ophthalmoscope (SLO)). L'autofluorescence est émise par la présence d'un pigment (lipofuscine), qui est un bon indicateur de l'activité de la rétine. Les images FAF sont capturées avec un SLO dans une séquence de 15-20 images, chacune ayant un faible rapport signal / bruit et un faible contraste. L'objectif de la thèse est le développement d'outils pour le traitement automatique des images FAF. Ces outils apporteront une aide importante aux spécialistes dans le diagnostic et le suivi de la maladie.

Pour explorer le monde qui nous entoure nous bougeons sans cesse les yeux alternant entre des mouvements rapides ``les saccades'' et des moments d'immobilisation ``les fixations''. Quels sont les facteurs guidant ces mouvements oculaires? Comment les interpréter et les évaluer quantitativement? Cette thèse aborde ces questions lors de l'exploration libre de scènes naturelles, sous deux aspects: la modélisation et le recueil de données comportementales avec des enregistrements oculométriques. Le modèle proposé s'inspire fortement de la biologie et propose de prédire les régions dites saillantes (qui attirent les yeux) en utilisant un certain nombre de caractéristiques visuelles de bas niveaux, selon une démarche de traitement ascendante (``bottom-up'') compatible avec le contexte choisi d'exploration libre des scènes naturelles. Bien qu'il s'agisse de l'exploration de scènes statiques, un modèle dynamique spatio-temporel est également proposé considérant les séquences temporelles alternant les phases de stabilisation durant les fixations et les phases de déplacement durant les saccades. Les données comportementales et les données physiologiques ont permis l'établissement du modèle, ses évolutions et améliorations successives, puis sa validation. Ainsi, nous montrons que bien que la couleur soit présente partout et apparaisse dans plusieurs modèles de la littérature, celle-ci influence peu les mouvements oculaires des sujets. De même nous montrons que programmer plusieurs saccades en parallèle à partir d'un point de fixation comme cela a été montré dans des expériences de recherche de cible n'est pas compatible avec les données comportementales. Cette thèse propose aussi de nombreux outils méthodologiques pour comparer des données comportementales à des données issues d'un modèle et propose également une manière de tester l'importance relative de plusieurs caractéristiques visuelles de bas niveau sur la prédiction des mouvements oculaires.

Chez l'Homme, le vieillissement de la rétine peut aboutir à des pathologies telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) ou la rétinopathie diabétique (RD). Il semble qu'une alimentation riche en acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC), notamment en oméga-3 comme l'EPA et le DHA, soit potentiellement protecteur vis-à-vis du développement de la DMLA et de l'insulinorésistance (IR), principal facteur de risque de la RD. Dans ce contexte, nous avons tenter d'évalué 1- l'impact de facteurs endogènes et environnementaux générateurs de stress oxydatif, de produits terminaux de glycation (PTG) ou d'insulinorésistance sur la fonction et le vieillissement de la rétine, et 2- l'adaptation de la rétine à un régime riche en AGPI-LC oméga-3 dans modèle murin de vieillissement de la rétine humaine, la souris ApoB100,LDLR-/-.Les animaux soumis à un stress oxydatif et à des PTG présentent une altération de la fonction rétinienne associée à une accumulation de cellules microgliales et/ou macrophages dans la rétine externe. L'IR induit une modulation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, l'inflammation et dans la synthèse de facteurs nucléaires. Une alimentation riche en AGPI-LC oméga-3 induit une amélioration de l'incorporation d'acides gras oméga-3 dans la rétine et la modulation du gène codant le récepteur aux LDL dans la rétine neurosensorielle.En conclusion, nos travaux montrent une adaptation de la rétine d'une part à des conditions propices au vieillissement de la rétine et l'insulinorésistance, et d'autre part à un régime alimentaire riche en acides gras oméga-3 et pauvre en oméga-6, reconnu comme protecteur du vieillissement de la rétine

Titre: La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine. Le But : Les espèces d'oxygène réactives sont non seulement produites à la suite de la blessure cellulaire, mais servent aussi des molécules faisantes des signes pour une variété de processus critiques, en incluant mitosis et de mort de cellule. Nous avons auparavant dit que la blessure à RGC axons incite un éclatement de superoxyde dans le corps de cellule, probablement de l'origine mitochondrial (Lieven et al, 2006). Nous décrivons maintenant une méthode pour refléter des espèces d'oxygène réactives dans la rétine de l'animal vivant en utilisant un confocal le lisant rapidement du laser ophthalmoscope a appelé la Rétine de Heidelberg Angiograph 2 (HRA2) équipé avec les lasers doubles. La méthodolologie : Après les études préliminaires en utilisant d'autres indicateurs (hydroethidium; HEt) pour les espèces d'oxygène réactives, nous avons essayé de refléter des espèces d'oxygène réactives dans le dans le modèle de vivo l'utilisation 5-(et 6)-chloromethyl-2', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate, l'acétyle ester (le CM-H2DCFDA). Un nerf optique de Longs-Evans rats a été écrasé intraorbitalement, en épargnant la circulation retinal. Dans certains rats colliculi supérieur de Longs rats Evans avait été auparavant exposé via craniotomy et surposé avec Gelfoam saturé avec le vert indocyanine (ICG). Aux points de temps variables les animaux ont été injectés intraveineusement ou intravitreally avec HEt ou le CM-H2DCFDA et reflétés avec fluorescein et-ou les filtres d'ICG en utilisant le HRA2. Les résultats: Nous avons démontré le foyer brillant multiple de fluorescence dans la couche de cellule de ganglion quand nous avons rétrogradement étiqueté d'ICG bilatéralement, en indiquant qu'ICG était un colorant rétrogradement transporté qui pourrait être découvert avec le HRA2. Après axotomy et l'injection intravitreal de CM-H2DCFDA, il y avait la fluorescence brillante dans le canal fluorescein dans quelques cellules dans la couche de cellule de ganglion, en accord avec la production d'une ou plusieurs espèces d'oxygène réactives. Les conclusions : RGCs peut être identifié et les niveaux d'espèces d'oxygène réactives mesurés en utilisant une fréquence double confocal Mots-clés : cellules ganglionnaires de la rétine; especes oxygenique radiculaire; la visualisation; / Title: Imaging Reactive Oxygen Species in RGCs In vivo Purpose: Reactive oxygen species not only are generated as a result of cellular injury, but also serve as signaling molecules for a variety of critical processes, including mitosis and cell death. We previously reported that injury to RGC axons induces a burst of superoxide within the cell body, probably of mitochondrial origin (Lieven et al, 2006). We now describe a method for imaging of reactive oxygen species within the retina of the living animal using a confocal scanning laser ophthalmoscope called the Heidelberg Retina Angiograph 2 (HRA2) equipped with dual lasers. Methods: Following preliminary studies using other indicators (hydroethidium; HEt) for reactive oxygen species, we attempted to image reactive oxygen species in the in vivo model using 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA). The resultant images were quantified using ImageJ. One optic nerve of Long-Evans rats was crushed intraorbitally, sparing the retinal circulation. In some rats the superior colliculi of Long-Evans rats had been previously exposed via craniotomy and overlaid with Gelfoam saturated with indocyanine green (ICG). At varying time points the animals were injected intravenously or intravitreally with HEt or CM-H2DCFDA and imaged with fluorescein and/or ICG filters using the HRA2. Results: We demonstrated multiple bright foci of fluorescence in the ganglion cell layer when we retrogradely labeled with ICG bilaterally, indicating that ICG was a retrogradely transported dye that could be detected with the HRA2. Following axotomy and intravitreal injection of CM-H2DCFDA, there was bright fluorescence in the fluorescein channel in a few cells in the ganglion cell layer, consistent with production of one or more reactive oxygen species. There was no cross-talk between the fluorescein and ICG channels when detecting ICG or CM-H2DCFDA, respectively. Conclusions: Retrograde labeled RGCs can be identified and levels of reactive oxygen species measured using a dual frequency confocal scanning laser ophthalmoscope. Keywords RGCs, oxidative radical, imaging

Les nétrines sont une petite famille de protéines de guidage axonal qui peuvent attirer des axones ou en repousser d’autres lors du développement neuronal. Lors du développement de la rétine, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont attirés vers une source de nétrines au niveau du disque optique leur permettant de quitter la rétine et de former le nerf optique. Afin de pouvoir caractériser le rôle des nétrines dans le système visuel adulte, nous avons investigué l’expression des nétrines et leurs récepteurs dans la rétine de souris adulte. Alors qu’aucune expression de la nétrine-1 n’a été détectée dans la rétine adulte, l’expression de la nétrine-3 a été abondamment détectée au niveau des CGR et des cellules amacrines. Nous démontrons aussi que les récepteurs des nétrines sont exprimés dans la rétine adulte. Alors que DCC semble être confiné au niveau des axones des CGR, néogénine est retrouvé dans les dendrites des CGR et des cellules horizontales. Quant aux protéines de la famille des récepteurs homologues à UNC-5, UNC5B a été détecté dans les somas des CGR et UNC5C dans les cellules de Müller. La découverte que nétrine-3 et ses récepteurs sont abondamment exprimés dans plusieurs types cellulaires de la rétine adulte leur suggère un rôle dans le fonctionnement du système visuel mature. / The netrins are a small family of axonal guidance proteins that can attract or repulse growing axons during neural development. During development of the retina, retinal ganglion cells (RGCs) axons are attracted by a netrin source at the optic disc that permits them to exit the retina and form the optic nerve. To characterise the role of netrins in the adult visual system, we investigated the expression of netrins and their receptors in the adult mouse retina. While expression of netrin-1 has not been detected in the adult retina, netrin- 3 has been abundantly found in RGCs amacrine cells. We also demonstrate that netrin receptors are expressed in the adult retina. DCC was found to be restricted in RGCs axons and neogenin in dendrites of RGCs and horizontal cells. UNC5B proteins were detected at RGC soma and UNC5C proteins in the Müller cells. The finding that netrin-3 and its receptors are abundantly expressed in many cell types of the adult retina suggests a funtional role for them in the mature visual system.

Les cellules ganglionnaires transfèrent l'information visuelle de l’œil au cerveau, sous une forme encore débattue. Leurs réponses aux stimuli visuels sont non-linéaires, corrélées entre neurones, et une partie de l'information est présente au niveau de la population seulement. J'étudie d'abord la structure des réponses de population. Les cellules du cortex sont influencées par l'activité globale des neurones avoisinants, mais ces interactions manquaient encore de modèle. Je décris un modèle de population qui reproduit le couplage entre neurones et activité globale. Je montre que les neurones de la rétine de salamandre dépendent de l'activité globale de manière surprenante. Je décris ensuite une méthode pour caractériser la sensibilité de populations de neurones de la rétine de rat à des perturbations d'un stimulus. J'utilise des expériences en boucle fermée pour explorer sélectivement l'espace des perturbations autour d'un stimulus donné. Je montre que les réponses à de petites perturbations peuvent être décrites par une linéarisation de leur probabilité. Leur sensibilité présente des signes de codage efficace. Enfin, je montre comment estimer la sensibilité des réponses d'une population de neurones à partir de leur structure. Je montre que les machines de Boltzmann restreintes (RBMs) sont des modèles précis des corrélations neurales. Pour mesurer le pouvoir de discrimination des neurones, je cherche une métrique neurale telle que les réponses à des stimuli différents soient éloignées, et celles à un même stimulus soient proches. Je montre que les RBMs fournissent des métriques qui surpassent les métriques classiques pour discriminer de petites perturbations du stimulus. / Ganglion cells form the output of the retina: they transfer visual information from the eye to the brain. How they represent information is still debated. Their responses to visual stimuli are highly nonlinear, exhibit strong correlations between neurons, and some information is only present at the population level. I first study the structure of population responses. Recent studies have shown that cortical cells are influenced by the summed activity of neighboring neurons. However, a model for these interactions was still lacking. I describe a model of population activity that reproduces the coupling between each cell and the population activity. Neurons in the salamander retina are found to depend in unexpected ways on the population activity. I then describe a method to characterize the sensitivity of rat retinal neurons to perturbations of a stimulus. Closed-loop experiments are used to explore selectively the space of perturbations around a given stimulus. I show that responses to small perturbations can be described by a local linearization of their probability, and that their sensitivity exhibits signatures of efficient coding. Finally, I show how the sensitivity of neural populations can be estimated from response structure. I show that Restricted Boltzmann Machines (RBMs) are accurate models of neural correlations. To measure the discrimination power of neural populations, I search for a neural metric such that responses to different stimuli are far apart and responses to the same stimulus are close. I show that RBMs provide such neural metrics, and outperform classical metrics at discriminating small stimulus perturbations.

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