Yes / The Cdc42- and Rac-interactive binding motif (CRIB) of coronin binds to Rho GTPases with a preference for GDP-loaded Rac. Mutation of the Cdc42- and Rac-interactive binding motif abrogates Rac binding. This results in increased 1evels of activated Rac in coronin-deficient Dictyostelium cells (corA−), which impacts myosin II assembly. corA− cells show increased accumulation of myosin II in the cortex of growth-phase cells. Myosin II assembly is regulated by myosin heavy chain kinase–mediated phosphorylation of its tail. Kinase activity depends on the activation state of the p21-activated kinase a. The myosin II defect of corA− mutant is alleviated by dominant-negative p21-activated kinase a. It is rescued by wild-type coronin, whereas coronin carrying a mutated Cdc42- and Rac-interactive binding motif failed to rescue the myosin defect in corA− mutant cells. Ectopically expressed myosin heavy chain kinases affinity purified from corA− cells show reduced kinase activity. We propose that coronin through its affinity for GDP–Rac regulates the availability of GTP–Rac for activation of downstream effectors. / This work was supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Sonderforschungsbereich 670 (SFB 670) and Köln Fortune (to A.A.N.). A.M.-T. acknowledges support by the SFB 914, and J.F. acknowledges support by Grant FA330/6-1 within the framework of the DFG priority programme “Principles and Evolution of Actin Nucleator Complexes” (SPP1464). Work in F.R. lab is supported by grants from the Hull York Medical School.

Der aufrechte, bipedale Gang ist eine wesentliche Voraussetzung für ein unabhängiges Leben mit gesellschaftlicher Teilhabe. Das sichere Gehen in einer variablen Umwelt kann im Laufe des Lebens durch verschiedene Faktoren beeinträchtigt werden. Neben altersbedingten, degenerativen Prozessen sind häufig auch erworbene, neurologische Defizite ursächlich für eine gestörte Lokomotorik. Der Schlaganfall stellt dabei die häufigste Ursache einer alltagsrelevanten Einschränkung der Mobilität dar. Es resultieren regelmäßig Einschränkungen, am gesellschaftlichen Leben teilzuhaben, psychosoziale Probleme der Vereinsamung, Depression und eine phobische Komponente der Mobilitätseinschränkung. Ein zentrales Ziel der Rehabilitation nach einem Schlaganfall ist es daher, die Gehfähigkeit und damit eine Unabhängigkeit im Alltag wiederzuerlangen. Grundlegend für die Entwicklung evidenzbasierter Therapieansätze ist das Wissen um neurophysiologische Grundlagen menschlicher Lokomotion sowie kortikaler Reorganisationsprozesse. Dazu bedarf es der Entwicklung von Methoden, die eine Bewertung der kortikalen Bewegungskontrolle in einem möglichst realitätsnahen Kontext ermöglichen. Die funktionelle Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) ist insbesondere bei der Untersuchung des freien Gehens anderen bildgebenden Verfahren aufgrund der Portabilität überlegen. Sie wurde in den letzten zwei Jahrzehnten für die Erforschung neuronaler Korrelate des Ganges zunehmend eingesetzt. Die fNIRS basiert auf der Messung kortikaler Oxygenierungsänderungen bei funktioneller Stimulation. Der spektroskopische Ansatz erlaubt eine grobe Kartierung funktioneller Aktivierung bei einem weiten Spektrum motorischer, aber auch kognitiver Paradigmen. Die vorliegende Arbeit gibt zu Beginn einen ausführlichen Überblick über bisherige fNIRS-Studien, die sich dem kortikalen Beitrag zur menschlichen Lokomotion widmeten. Von den 55 berücksichtigten Arbeiten nutzten bis dato nur 4 Studien portable Geräte. In zwei experimentellen Studien wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit daher untersucht, ob mit Hilfe eines portablen fNIRS-Aufbaus die hämodynamische Reaktion primärer und sekundärer motorischer Areale auf unterschiedliche lokomotorische Aufgaben aufgezeichnet werden können. In der ersten Studie absolvierten 23 gesunde, junge Erwachsene ein Paradigma, das synchron zu einem auditorisch vorgegebenen Rhythmus (RAC= rhythmic auditory cueing) vier Bewegungsbedingungen erforderte: Die Bedingungen unterschieden sich hinsichtlich Lokomotion (auf der Stelle: TRETEN vs. raumgreifend: GEHEN) sowie Regelmäßigkeit (regelmäßig: REG vs. unregelmäßig: UNREG. Durch zusätzlich eingefügte Phasen ruhigen Stehens (PAUSE) ergaben sich für die Analyse der Hirnaktivierung insgesamt 5 Bedingungen. Um den Transfer in den neurorehabilitativen Kontext zu ermöglichen, wurde dieses Paradigma in der zweiten Studie bei 21 Schlaganfallpatienten mit leichter bis moderater Gangstörung angewandt. Die Auswertung erfolgte gruppenspezifisch nach dominant paretischer Seite (LP: dominant linksparetisch; RP: dominant rechtsparetisch). Mit diesen zwei Kohorten galt unser Interesse neben der grundsätzlichen Frage nach der Anwendbarkeit der fNIRS beim freien Gehen vor allem dem differenziellen Einfluss der Lokomotion beziehungsweise der Regelmäßigkeit auf die kortikale Aktivierung. In beiden Studien konnten wir durch signifikante Unterschiede zwischen den gemittelten Bewegungsbedingungen und der Ruhebedingung zeigen, dass es mit beschriebenem Paradigma möglich ist, Aktivierungsänderungen in prämotorischen und motorischen Hirnarealen darzustellen. Für eine zerebrale Genese der gemessenen Änderungen sprechen: die Fokalität, die Richtung der Oxygenierungsänderung (oxy-Hb↑ und deoxy-Hb↓), der Zeitverlauf und auch die relative Größe (oxy-Hb>>deoxy-Hb) der ermittelten Änderungen. Unsere Ergebnisse deuten in Übereinstimmung mit früheren Studien auf eine führende Rolle von SMA, PMC und SMC in der Bewegungssteuerung hin (Harada et al., 2009; Kim et al., 2016; Kurz et al., 2012; Lu et al., 2015; Miyai et al., 2001; Okamoto et al., 2004). Der differenzielle Einfluss der Lokomotion zeigte sich in beiden Studien. Spricht das Ergebnis bei den neurotypischen Probanden für eine höhere kortikale Kontrolle beim ungewohnteren, weniger automatisierten Treten, ist für die Patienten anzunehmen, dass läsionsbedingte Kompensationsmechanismen zu Beeinträchtigungen der Bewegungs-automatisation und damit zu erhöhten kortikalen Aktivierungen führen. Dies ist insbesondere für den sensomotorischen Kortex (SMC) beschrieben (Harada et al., 2009; Stuart et al., 2018). Ungeachtet dessen zeigten sich im Vergleich der mittleren Steigung über die Stimulationsdauer bei beiden Kohorten ähnliche Habituationseffekte während des Gehens. Die Konzentrationsabnahme des oxygenierten Hämoglobins über den Verlauf der Bewegung spricht dafür, dass über den Stimulationszeitraum zunehmend automatisiert ist und anzunehmend stärker subkortikal gesteuert wird. Ferner deuten die Patientenergebnisse daraufhin, dass es trotz der oben genannten Beeinträchtigung grundlegender Automatisationsprozesse zu einer teilweisen Restitution in der chronischen Phase nach Schlaganfall kommen kann. Auch bezüglich des Einflusses des Bewegungsrhythmus unterschieden sich die Patienten von den neurotypischen Probanden. Bei Letzteren ergaben sich für die unrhythmischen Bewegungen hypothesenkonform signifikant größere oxy-Hb Antworten als für die rhythmisch ausgeführten Bewegungen. Wie schon in früheren Studien beschrieben, korrelierte die Aktivitätssteigerung mit dem höheren Anspruch vor allem über den prämotorischen Arealen (d.h. pre-SMA, SMA und den PMC). Bei hoher Heterogenität ergab sich bei den Schlaganfallpatienten ein umgekehrter Effekt. Explorative Analysen der rechtsparetischen Gruppe zeigten eine höhere kortikale Beteiligung bei den rhythmischen Bewegungen. Ein in der Literatur als „CRUNCH-Modell“ beschriebener Mechanismus, der bei einer motorisch induzierten Erschöpfung neuronaler Ressourcen eine Verschiebung der Bewegungskontrolle von kortikal nach subkortikal postuliert, könnte hierfür verantwortlich sein. Diese These wird auch durch die Habituationseffekte, die gleichermaßen bei den Probanden wie auch bei den Patienten während der regelmäßigen Bewegungen gefunden wurden, unterstützt. Um dies datenbasiert zu untersuchen, sind in zukünftigen Studien kinematische Daten zur Korrelation mit den kortikalen Aktivierungsmaßen sinnvoll. Frühere Studien konnten die besondere Rolle prä- und supplementär-motorischer Areale bei der Initiierung lokomotorischer Bewegungen zeigen (Chang et al., 2010; MacKinnon et al., 2007; Varghese, Merino, Beyer, & McIlroy, 2016; Yakovenko & Drew, 2009). Die angestrebte Beurteilung des kortikalen Beitrags bei der Initiierung und Beendigung lokomotorischer Aufgaben bei jungen, gesunden Erwachsenen sowie bei Schlaganfallpatienten gestaltete sich mit unserem methodischen Zugang schwierig. Zukünftige Arbeiten könnten für diese Fragestellung einerseits die Startbewegung isoliert betrachten (Varghese et al., 2016; Watanabe, Ishida, Tanabe & Nojima, 2016) andererseits wäre im Rahmen der Datenaufbereitung die Modellierung der hämodynamischen Antwortfunktion auf diese Fragestellung auszurichten. Mit vorliegenden Studien ist es uns erstmalig gelungen, die Anwendbarkeit der fNIRS beim freien Gehen und den differenziellen Einfluss der Lokomotion (Gehen vs. Treten) und der Regelmäßigkeit (rhythmisch vs. unrhythmisch) sowohl bei jungen, gesunden Probanden als auch bei chronischen Schlaganfallpatienten mit leichter bis moderater Gangstörung darzustellen.:INHALTSVERZEICHNIS 1 BIBLIOGRAFISCHE ZUSAMMENFASSUNG 2 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 3 EINLEITUNG 4 AUFGABENSTELLUNG 5 MATERIALIEN UND METHODEN 5.1 STUDIENDESIGN 5.2 VERSUCHSTEILNEHMER 5.2.1 Probandenstudie 5.2.2 Patientenstudie 5.3. MESSTECHNIK 5.4. DATENVERARBEITUNG UND STATISTISCHE ANALYSEN 6 ERGEBNISSE 6.1 STUDIE 1: PROBANDEN 6.1.1 Zerebrale Oxygenierung bei uneingeschränkter, rhythmisierter Lokomotion bei jungen Erwachsenen 6.1.2 Einfluss von LOKOMOTION und REGULARITÄT auf die kortikale Oxygenierung 6.1.3 Unterschiede zwischen GEHEN und TRETEN (Faktor LOKO) 6.1.3.1 Einfluss von LOKO auf die tonische Antwort 6.1.3.2 Einfluss von LOKO während der Startsequenzen 6.1.3.3 Einfluss von LOKO während der Stoppsequenzen 6.1.3.4 Mittlere Steigung der Oxygenierungsantwort beim GEHEN und TRETEN 6.1.4 Unterschiede zwischen regelmäßigen und unregelmäßigen Bewegungen Faktor REG) 6.1.4.1 Einfluss von REG auf die tonische Antwort 6.1.4.2 Einfluss von REG während der Startsequenzen 6.1.4.3 Einfluss von REG während der Stoppsequenzen 6.1.4.4 Mittlere Steigung der Oxygenierungsantwort bei unterschiedlich rhythmisierten Bewegungen 6.1.5 Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT 6.1.5.1 Die Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT bezogen auf die gesamte Stimulusdauer (Prädiktor TONISCH) 6.1.5.2 Die Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT während der Startsequenz (Prädiktor START) 6.1.5.3 Die Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT während der Stoppsequenz (Prädiktor STOP) 6.2 STUDIE 2: PATIENTEN 6.2.1 Zerebrale Oxygenierung bei uneingeschränkter, rhythmisierter Lokomotion von Schlaganfallpatienten 6.2.2 Einfluss von LOKOMOTION und REGULARITÄT auf die kortikale Oxygenierung 6.2.3 Unterschiede zwischen GEHEN und TRETEN (Faktor LOKO) 6.2.3.1 Einfluss von LOKO auf die tonische Antwort 6.2.3.2 Einfluss von LOKO während der Startsequenzen 6.2.3.3 Mittlere Steigung der Oxygenierungsantwort beim Gehen und Treten 6.2.4 Unterschiede zwischen regelmäßigen und unregelmäßigen Bewegungen (Faktor REG) 6.2.4.1 Einfluss von REG auf die tonische Antwort 6.2.4.2 Einfluss von REG während der Startsequenzen 6.2.4.3 Einfluss von REG während der Stoppsequenzen 6.2.4.4 Mittlere Steigung der Oxygenierungsantwort bei unterschiedlich rhythmisierter Lokomotion 6.2.5 Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT 6.2.5.1 Die Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT bezogen auf die gesamte Stimulusdauer (Prädiktor TONISCH) 6.2.5.2 Die Interaktion von LOKOMOTION und REGULARITÄT während der Startsequenz (Prädiktor START) 7 DISKUSSION 7.1 ANWENDBARKEIT DER FUNKTIONELLEN NIRS ZUR UNTERSUCHUNG KORTIKALER AKTIVIERUNGSMUSTER BEIM FREIEN GEHEN 7.2 UNTERSCHIEDE DER KORTIKALEN HÄMODYNAMIK BEI GEWOHNTER UND UNGEWOHNTER LOKOMOTION 7.2.1 Kortikale Kontrolle der Lokomotion bei jungen, gesunden Erwachsenen 7.2.2 Kortikale Kontrolle der Lokomotion bei Schlaganfallpatienten 7.3 EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER BEWEGUNGSRHYTHMIK AUF DIE KORTIKALE AKTIVITÄT 7.3.1 Kortikale Aktivität bei regelmäßigen und unregelmäßigen Bewegungen bei jungen, gesunden Erwachsenen 7.3.2 Kortikale Aktivität bei regelmäßigen und unregelmäßigen Bewegungen bei Schlaganfallpatienten 7.4 PRÄ- UND SUPPLEMENTÄR-MOTORISCHE AKTIVITÄT BEIM INITIIEREN UND BEENDEN UNGEWOHNTER LOKOMOTORISCHER AUFGABEN 7.4.1 Kortikale Aktivität beim Starten und Stoppen der Lokomotion bei jungen, gesunden Erwachsenen 7.4.2 Kortikale Aktivität beim Starten und Stoppen der Lokomotion bei Schlaganfallpatienten 8 ZUSAMMENFASSUNG 9 LITERATURVERZEICHNIS 10 APPENDIX

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique,... Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire. Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale). Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes. Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc. Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.

Dans ce travail, une nouvelle série de complexes d'Al(III) portant des ligands tridentates pyridine-bis(naphtolate) ortho-substitués ({ONOSiR3}2-, SiR3 = SiPh3, SiMe2tBu) et deux complexes d´Y(III) portant un nouveau ligand tridentate pyridine-bis(phénolate) ortho-substitués avec un group cumyle {ONOMe,Cumyl}2- ont été préparés. Leurs structures ont été élucidées à l'état solide par une étude de diffraction des rayons X et en solution par la spectroscopie par résonance magnétique multinucléaire. Des études préliminaires sur les performances catalytiques des complexes d'Al(III) et d'Y(III) dans la ROP du rac-lactide et de la β-butyrolactone sont décrits. D'autres études ont été aussi reportées sur des réactions en utilisant des quantités stoechiométriques des lactides avec des complexes homochiraux Al(III)-lactate ou Al(III){β-alkoxy ester} dont sont des complexes modèles des premiers intermédiaires et des espèces actives impliquées dans les étapes d´initiation et de propagation de la polymérisation de lactides et β-lactones. / A series of new Al(III) complexes bearing silyl ortho-substituted 2,6-bis(naphtholate)-pyridine tridentate ligands ({ONOSiR3}2-, SiR3 = SiPh3, SiMe2tBu) and two monomeric Y(III) complexes bearing a new cumyl ortho-substituted 2,6-bis(phenolate)-pyridine tridentate ligand {ONOMe,Cumyl}2 have been prepared and structurally characterized in solution and in the solid-state. Preliminary studies on the catalytic performances of the compounds in the ROP of racemic lactide and β-butyrolactone are described. Also, details of the reactions of chiral Al-lactate and -{β-alkoxy ester} complexes which are close models/mimics of the first intermediates and active species involved in the initiation and propagation steps of the ROP of lactides and β-lactones with stoichiometric amounts of lactide.

Over the last decade there has been a substantial research effort directed toward understanding recidivism and risk prediction among adult sex offenders. In contrast, the juvenile sex offender field has received much less empirical attention. Consequently, there are very few risk assessment instruments designed for use with young persons who have committed sexual offences. Available measures do not appear to take into account the higher rates of non-sexual recidivism typical of this population. This thesis aimed to identify risk factors for sexual and non-sexual recidivism among juvenile sex offenders (JSOs) and explore their utility in the context of a risk assessment instrument. In Study One, a meta-analysis was conducted on JSO research to examine risk factors for sexual recidivism. The meta-analysis involved 17 studies and 22 predictor constructs. Seven variables emerged as reliable predictors of sexual recidivism: an index sexual offence involving a stranger victim, a history of physical abuse in the offender's background, the presence of sexual deviance, a non-contact index sexual offence, sexually offending against a greater number of victims, a history of sexual offending, and a history of non-sexual offending. In Study Two, a meta-analysis was performed on JSO research to identify risk factors for non-sexual recidivism. The meta-analysis involved 14 studies and 19 predictor constructs. Six variables emerged as reliable predictors of non-sexual recidivism: a history of non-sexual offending, a history of sexual abuse (negative relationship), the presence of an antisocial orientation, an index sexual offence involving a child victim (negative relationship), a history of physical abuse in the offender's background, and the use of threats/force in the index sexual offence. Taken together, the two meta-analyses were able to identify risk factors specific to sexual recidivism (e.g., sexual deviance) and non-sexual recidivism (e.g., antisocial orientation) as well as risk factors common to both outcomes (e.g., a history of non-sexual offending). These studies therefore made an original and significant contribution to the understanding of recidivism among JSOs. Based upon the meta-analyses, Study Three involved the construction of a risk assessment checklist that could be easily scored from file information. The Juvenile Risk Assessment Checklist (J-RAC) contained 11 items based upon the most consistent operationalisations of the predictors that emerged from the meta-analyses. The J-RAC is unique in the JSO risk assessment field as it contains two scales designed to provide separate estimates of the risk of youth engaging in further sexual and non-sexual recidivism, respectively. The J-RAC was scored based on file information from 82 youth who had been found guilty of sexual offences and referred to a treatment service in Queensland, Australia. The majority of the items possessed good inter-rater reliabilities and the two scales both possessed high inter-rater reliabilities. An existing JSO risk assessment instrument, the Juvenile Sex Offender Assessment Protocol Version 2 (J-SOAP-II; Prentky & Righthand, 2003), was also administered and the J-RAC possessed significant correlations with the majority of the J-SOAP-II scales. The J-RAC was also found to significantly discriminate between juveniles in detention and juveniles in the community, with those in detention found to be at higher risk on both scales. Thus, the reliability, convergent validity, and discriminant validity of the J-RAC was established. Consistent with current adult sex offender recidivism theory, the findings demonstrated the distinct roles of sexual deviance and antisocial orientation in the prediction of sexual and non-sexual recidivism of JSOs, respectively. The current thesis goes some way towards advancing a theory of juvenile sex offender recidivism by drawing upon the variables that emerged as reliable risk factors in the two meta-analyses. While the J-RAC could not yet be considered an actuarial instrument capable of assigning low, medium and high risk levels, the results of the research conducted in this thesis are encouraging. The utility of the J-RAC may be further enhanced through the aid of prospective research that incorporates substantial numbers of juvenile recidivists.

<p>Small GTP-binding proteins are molecular switches that serve as important regulators of numerous cellular processes. In animal and plant cells, the Rho family of small GTPases participate in e.g. organisation of the actin cytoskeleton, production of reactive oxygen species through the NADPH oxidase complex, regulation of gene expression. The three most extensively studied subgroups of the Rho GTPase family are Cdc42, Rho and Rac. One of the mechanisms by which animal Rac and Cdc42 GTPases regulate actin filament organisation is through activation of the ARP2/3 complex, a multimeric protein complex which induces branching and nucleation/elongation/polymerisation of actin filaments. Activation of the ARP2/3 complex by Rac and Cdc42 is mediated through the proteins WAVE and WASP, respectively.</p><p>In a search for Ras-like GTPases in Arabidopsis, we identified a family of genes with similarity to Rac GTPases. Screens of cDNA and genomic libraries resulted in the finding of 11 genes named ARACs/AtRACs. Genes encoding Rho, Cdc42 or Ras homologues were not identified. Expression analysis of AtRAC1 to AtRAC5 indicated that AtRAC1, AtRAC3, AtRAC4 and AtRAC5 are expressed in all parts of the plant, whereas AtRAC2 is preferentially expressed in root, hypocotyl and stem.</p><p>The AtRAC gene family can be divided into two main groups based on sequence similarity, gene structure and post-translational modification. AtRAC group II genes contain an additional exon, caused by the insertion of an intron which disrupts the C-terminal geranylgeranylation motif. Instead, group II AtRACs contain a putative motif for palmitoylation. Phylogenetic analyses indicated that the division of plant RACs into group I and group II occurred before the split of monocotyledonous and dicotyledonous plants. Analyses of the genes neighbouring AtRAC genes revealed that several of the plant RAC genes have been created through duplications.</p><p>The restricted/tissue-specific expression pattern of AtRAC2 led us to do a more detailed expression analysis of this gene. A 1.3 kb fragment of the upstream (regulatory) sequence of AtRAC2 directed expression of GUS or GFP to developing primary xylem in root, hypocotyl, leaves and stem. In root tips, the onset GUS staining or GFP fluorescence regulated by the AtRAC2 promoter slighty preceded the appearance of secondary cell walls. In stems, GUS staining coincided with thickening of xylem cell walls. Transgenic plants expressing constitutively active AtRAC2 displayed defects in the polar growth of leaf epidermal cells, indicating that AtRAC2 may be able to regulate the actin cytoskeleton. Surprisingly, an AtRAC2 T-DNA insertion mutant did not show any observable phenotypes. GFP fusion proteins of wild type and constitutively active AtRAC2 were both localised to the plasma membrane. The data suggest that AtRAC2 is involved in development of xylem vessels, likely through regulation of the actin cytoskeleton or NADPH oxidase.</p><p>The role of RAC GTPases in regulation of the actin cytoskeleton in plants is well documented. However, although the ARP2/3 complex had been identified in plants/Arabidopsis, the mechanisms regulating this complex were unknown. Through database searches, we identified three Arabidopsis genes, AtBRK1, AtNAP and AtPIR, which encoded proteins with similarity to subunits of a protein complex shown to regulate the activity of WAVE1 in mammalian cells. T-DNA inactivation mutants of AtNAP and AtPIR displayed morphological defects on epidermal cells undergoing polar expansion, such as trichomes and leaf pavement cells. The phenotypes were similar to those observed for ARP2/3 complex mutants, suggesting that AtNAP and AtPIR act in the same pathway as the ARP2/3 complex in plants. The actin cytoskeleton in atnap and atpir mutants was less branched than in wild type plants; instead, actin filaments aggregated in thick actin bundles.</p><p>Finally, we have recently discovered a small gene family encoding putative WAVE homologues. In mammalian cells, Rac activates WAVE1 through binding to PIR121 or Sra1 (the mammalian homologues of AtPIR). The discovery of a putative WAVE regulatory complex as well as putative WAVE homologues in Arabidopsis suggests that plant RAC GTPases regulate organisation of the actin cytoskeleton during polar growth at least partly through the ARP2/3 complex, using an evolutionarily conserved mechanism.</p>

Small GTP-binding proteins are molecular switches that serve as important regulators of numerous cellular processes. In animal and plant cells, the Rho family of small GTPases participate in e.g. organisation of the actin cytoskeleton, production of reactive oxygen species through the NADPH oxidase complex, regulation of gene expression. The three most extensively studied subgroups of the Rho GTPase family are Cdc42, Rho and Rac. One of the mechanisms by which animal Rac and Cdc42 GTPases regulate actin filament organisation is through activation of the ARP2/3 complex, a multimeric protein complex which induces branching and nucleation/elongation/polymerisation of actin filaments. Activation of the ARP2/3 complex by Rac and Cdc42 is mediated through the proteins WAVE and WASP, respectively. In a search for Ras-like GTPases in Arabidopsis, we identified a family of genes with similarity to Rac GTPases. Screens of cDNA and genomic libraries resulted in the finding of 11 genes named ARACs/AtRACs. Genes encoding Rho, Cdc42 or Ras homologues were not identified. Expression analysis of AtRAC1 to AtRAC5 indicated that AtRAC1, AtRAC3, AtRAC4 and AtRAC5 are expressed in all parts of the plant, whereas AtRAC2 is preferentially expressed in root, hypocotyl and stem. The AtRAC gene family can be divided into two main groups based on sequence similarity, gene structure and post-translational modification. AtRAC group II genes contain an additional exon, caused by the insertion of an intron which disrupts the C-terminal geranylgeranylation motif. Instead, group II AtRACs contain a putative motif for palmitoylation. Phylogenetic analyses indicated that the division of plant RACs into group I and group II occurred before the split of monocotyledonous and dicotyledonous plants. Analyses of the genes neighbouring AtRAC genes revealed that several of the plant RAC genes have been created through duplications. The restricted/tissue-specific expression pattern of AtRAC2 led us to do a more detailed expression analysis of this gene. A 1.3 kb fragment of the upstream (regulatory) sequence of AtRAC2 directed expression of GUS or GFP to developing primary xylem in root, hypocotyl, leaves and stem. In root tips, the onset GUS staining or GFP fluorescence regulated by the AtRAC2 promoter slighty preceded the appearance of secondary cell walls. In stems, GUS staining coincided with thickening of xylem cell walls. Transgenic plants expressing constitutively active AtRAC2 displayed defects in the polar growth of leaf epidermal cells, indicating that AtRAC2 may be able to regulate the actin cytoskeleton. Surprisingly, an AtRAC2 T-DNA insertion mutant did not show any observable phenotypes. GFP fusion proteins of wild type and constitutively active AtRAC2 were both localised to the plasma membrane. The data suggest that AtRAC2 is involved in development of xylem vessels, likely through regulation of the actin cytoskeleton or NADPH oxidase. The role of RAC GTPases in regulation of the actin cytoskeleton in plants is well documented. However, although the ARP2/3 complex had been identified in plants/Arabidopsis, the mechanisms regulating this complex were unknown. Through database searches, we identified three Arabidopsis genes, AtBRK1, AtNAP and AtPIR, which encoded proteins with similarity to subunits of a protein complex shown to regulate the activity of WAVE1 in mammalian cells. T-DNA inactivation mutants of AtNAP and AtPIR displayed morphological defects on epidermal cells undergoing polar expansion, such as trichomes and leaf pavement cells. The phenotypes were similar to those observed for ARP2/3 complex mutants, suggesting that AtNAP and AtPIR act in the same pathway as the ARP2/3 complex in plants. The actin cytoskeleton in atnap and atpir mutants was less branched than in wild type plants; instead, actin filaments aggregated in thick actin bundles. Finally, we have recently discovered a small gene family encoding putative WAVE homologues. In mammalian cells, Rac activates WAVE1 through binding to PIR121 or Sra1 (the mammalian homologues of AtPIR). The discovery of a putative WAVE regulatory complex as well as putative WAVE homologues in Arabidopsis suggests that plant RAC GTPases regulate organisation of the actin cytoskeleton during polar growth at least partly through the ARP2/3 complex, using an evolutionarily conserved mechanism.

The common type of myxoid soft tissue sarcomas is myxofibrosarcoma. Clinically, increased tumor grading and staging are frequently observed in myxofibrosarcomas after relentless local recurrences, which may eventually lead to metastatic diseases. However, metastatic myxofibrosarcomas are often refractory to current treatment strategies and constitute the primary cause of sarcoma-related death. Immunohistochemistry staining was applied to analyze myxoid tumors of soft tissue in our previous studies, and p21 protein (Cdc42/Rac)-activated kinase 1 (PAK1) was identified to be significantly upregulated in myxoid soft tissue sarcomas. The PAK1 is a pivotal serine/threonine kinase, which integrates stimuli from various signaling pathways to regulate cell survival, mitosis and cytoskeletal remodeling, etc. We first examined the endogenous PAK1 mRNA and total PAK1 protein levels in various myxoid sarcoma cell lines, including OH931, NMFH1 and NMFH2. This initial screening detected that upregulated PAK1 expression in OH931 and NMFH1, whereas downregulated PAK1 in NMFH2 cells. By wound healing and matrigel transwell assay, we further found that transfection of the expression plasmid carrying wild-type PAK1 gene or PAK1 T423E mutant promoted cell migration and invasion abilities in NMFH2 cells. On the other hand, knockdown of the PAK1 gene by short hairpin RNA interference inhibited the migration rate and invasion ability in NMFH1 cells. By 5-bromo-2-deoxyuridine assay and colony formation assay, we found that either exogenous expression of PAK1 protein or knockdown of PAK1 gene affected cell proliferation and transformation. Interestingly, immunofluorescence demonstrated that treatment with hepatocyte growth factor induced phosphorylation of PAK1 (Thr212) and promoted its nuclear import in NMFH2 cells. In summary, PAK1 plays oncogenic roles in myxoid sarcoma carcinogenesis.

Vascular smooth muscle cell migration is a significant contributor to many aspects of heart disease, and specifically atherosclerosis. Tissue damage in the arteries can result in the formation of a fatty streak. Smooth muscle cells (SMC) can then migrate to this site to form a fibrous cap, stabilizing the fatty plaque. Since cardiovascular disease is the leading cause of death in developed countries, this function of SMC is an essential area of study. The formation of lamellipodia and circular dorsal ruffles were studied in this project as indicators that cell migration is occurring. The roles of the proteins p53, Rac, caldesmon and PTEN were investigated with regards to these actin-based structures. The tumour suppressor p53 is often reported to cause apoptosis, senescence or cell cycle arrest when stress is placed on a cell, but has recently been shown to regulate cell migration as well. It was determined in this project that p53 could inhibit the formation of both lamellipodia and circular dorsal ruffles. It was also shown that this could occur directly through an inhibition of the GTPase Rac. Previous studies have shown that p53 can upregulate caldesmon, a protein which is known to bind to and stabilize actin filaments while inhibiting Arp2/3-mediated branching. It was confirmed that p53 could upregulate caldesmon, and that caldesmon could inhibit the formation of lamellipodia and circular dorsal ruffles. The phosphorylation of caldesmon by p21-associated kinase (PAK) or extracellular signal-related kinase (Erk) was shown to effectively reverse the ability of caldesmon to inhibit these structures. The role of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) was also studied with regards to this signalling pathway. PTEN was shown to inhibit lamellipodia and circular dorsal ruffles through its lipid phosphatase activity. It was concluded that p53 can inhibit the formation of lamellipodia and circular dorsal ruffles in vascular SMC, and that this occurs through Rac, caldesmon and PTEN. / Thesis (Master, Biochemistry) -- Queen's University, 2011-06-10 13:15:37.081

INTRODUCTION: Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn (PPHN) is defined as the failure of normal circulatory relaxation in the lungs at birth. Hypoxia is known to impede postnatal disassembly of the actin cytoskeleton in pulmonary arterial (PA) myocytes. Actin polymerization (APM), regulated by Rho GTPases, stabilizes force generation. We studied basal and thromboxane (TP)-induced APM and contraction in normoxic and hypoxic PA myocytes and rings. We also examined the downstream signaling pathways regulating hypoxia and TP-induced APM, and the role that actin plays in TP receptor internalization. METHODS: Smooth muscle myocytes from 2nd to 6th generation PAs of newborn piglets were cultured and exposed to hypoxia (10% O2) or normoxia (21% O2) for 72 hrs, then challenged with 10-6M TP-agonist U46619. APM was quantified by laser-scanning cytometry and stress fiber isolation. Downstream signaling pathways of TP receptor were studied by immunoprecipitation, Rhotekin-RBD and PAK-PBD affinity precipitation, Western blot, immunofluoresence and ELISA. Isometric force to serial concentrations of U46619 was measured in resistant PAs from PPHN and 3-day control swine. RESULTS: Hypoxia induced 2-fold APM via alpha- and gamma-actin isoforms, which contributed to increase U46619-induced contraction. Hypoxia decreased TP association with G12/13 in favor of Gαq. Basal RhoA and Cdc42 activity increased in hypoxia, while Rac activity decreased. U46619-challenge did not further alter RhoA activity in hypoxic cells, but increased Cdc42 and Rac activity. Hypoxia increased phosphorylation of LIMK and PAK, unaltered by U46619. Association of Cdc42 with N-WASp decreased in hypoxia, but increased after U46619 exposure. Jasplakinolide significantly stabilized gamma filaments, increasing force generation; cytochalasin D depolymerized all actin isoforms, which attenuated contractile force. Both actin-modifying agents prevented TP endocytosis in NM, while normalizing TP internalization in HM. CONCLUSIONS: PA myocytes exhibit marked RhoA- and Rac-dependent APM in hypoxia. The additional APM response to U46619 challenge is independent of RhoA, but requires Cdc42 signaling. Hypoxia induces APM in PA myocytes, particularly causing an increase in filamentous alpha- and gamma-actin that contributes to increased U46619-induced force generation, a characteristic of PPHN. Dynamic actin also facilitates internalization of the TP receptor. Determining the mechanism that controls TP-mediated APM maybe beneficial as a potential target for PPHN.