Thèse de doctorat : Physiologie et physiopathologie de l'appareil respiratoire : Paris 12 : 2005. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr.

Thèse--Méd.--Montpellier 1, 1974. N°: 181.

Résumé : L’objectif de la thèse est de considérer différentes sources de biais dans l’analyse du risque de cancer associé à l’exposition externe aux rayonnements ionisants dans la cohorte CEA-AREVA-EDF de travailleurs du nucléaire. Cette cohorte inclut 59004 salariés de ces entreprises surveillés pour une exposition externe aux rayonnements ionisants. La dose externe cumulée des travailleurs a été reconstituée sur la base des résultats de leurs dosimètres individuels. Le premier axe a étudié la possible exposition des travailleurs à l’incorporation de radionucléides. En l’absence de données individuelles, un indicateur basé sur les unités de travail a été défini pour attribuer un niveau de risque de contamination interne à chaque travailleur et a été intégré aux analyses du risque de mortalité par cancer lié aux expositions externes.Le second axe a porté sur les expositions non professionnelles des travailleurs aux rayonnements ionisants, notamment l’exposition environnementale d’origine naturelle et l’exposition médicale due aux examens radiologiques réalisés dans le cadre de la médecine du travail. Des scénarios de doses dues à ces expositions ont été établis, et l’impact de la prise en compte de ces expositions sur le risque de mortalité par cancer a été étudié. Le troisième axe a porté sur les seuils d’enregistrement des dosimètres. Sous ces seuils, les doses sont mal quantifiées. Par le passé, les doses sous le seuil étaient enregistrées comme nulles, entraînant une sous-estimation de la dose reçue. Un historique complet des pratiques dosimétriques dans la cohorte a été réalisé et a permis la création de scenarios d’imputation des doses sous seuil. / The aim of the thesis is to study three potential sources of bias in the analyses on the cancer risk associated with chronic external exposure to low doses of ionizing radiation in the CEA-AREVA-EDF cohort. This cohort includes 59 004 nuclear workers from those companies who were badge-monitored for external exposure to radiation. The first part of this thesis is devoted to potential internal exposure to radionuclides among the workers. Given the lack of available individual data on internal contaminations, a flag attributing for each worker and for each year a potential contamination risk based on workstations was defined and added to the analyses on cancer mortality risk associated with external radiation exposure. The second part of this work focuses on non-occupational exposures to radiation.Nuclear workers are exposed to radiation from environmental and medical sources, in particular from radiological examinations carried out in an occupational health framework. Scenarios characterising non-occupational exposures to radiation were constructed and their impact on the cancer mortality risk associated with occupational exposure was examined. The third part of this thesis addresses dosimeters recording thresholds. Below those thresholds, dose quantification is deemed too imprecise. Historically, below the threshold doses were recorded as null, resulting in systemic dose underestimation. A comprehensive review of the dosimetry practices in the cohort was accomplished and led to the conception of scenarios aiming to impute below the threshold.

L'exposition aux rayonnements ionisants est une composante inévitable de la vie moderne. Il est bien établi qu'il existe une grande variabilité inter-individuelle de la radiosensibilité chez les individus sains et chez des patients atteints de cancer. Cependant, les mécanismes impliqués dans l'hétérogénéité des réponses biologiques radio-induites ne sont pas encore bien compris, et une approche biologique permettant d’établir de façon fiable le niveau de radiosensibilité reste à développer. Dans cette thèse, nous avons étudié l'ampleur et l'impact de la radiosensibilité individuelle chez les individus sains dans les contextes de dosimétrie d'urgence et de radiothérapie. Nous avons également examiné les différents rôles des télomères dans la prédiction de la radiosensibilité individuelle et des risques pour la santé humaine à long terme (spécifiquement, en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires et/ou les cancers) après irradiation. Tout d'abord, dans le contexte de la dosimétrie dans le cas d'une situation d'urgence (lorsqu’il est nécessaire d’estimer rapidement la dose d’irradiation reçu par un individu), nous avons démontré que l'impact de la radiosensibilité individuelle peut être négligeable en utilisant des mesures globales de fluorescence de γH2AX via cytométrie en flux dans des fibroblastes humains et des lymphocytes à 4 heures après exposition ; cette méthode peut être un outil de biodosimétrie efficace et rapide qui peut aider au tri des personnes irradiées dans une situation d'urgence basées sur les niveaux individuels d'exposition. Dans un second temps, nous avons étudié l'ampleur et l'influence de la radiosensibilité individuelle sur l'induction d'aberrations chromosomiques après une irradiation de 2 Gy de rayons γ, correspondant à une fraction de radiothérapie conventionnelle, dans les lymphocytes d'individus sains. Pour ces analyses, nous définissons la radiosensibilité individuelle par rapport à la fréquence des cassures double-brin (CDB) radio-induite, qui ont été calculées à partir de la quantification des aberrations chromosomiques visualisées par hybridation in situ des télomères et centromères (TC-FISH). Ce marquage améliore et simplifie la technique « gold standard » de dosimétrie biologique (la quantification des chromosomes dicentriques). Nous avons également estimé la radiosensibilité individuelle à l’irradiation carbone, ions lourds utilisés en radiothérapie, et l'efficacité biologique relative (EBR) des ions carbone par rapport à une irradiation γ. Nous avons fourni des courbes dose-réponse pour ces deux types d’irradiations en fonction de la fréquence des CDB radio-induite par exposition à une gamme de doses. De plus, nous avons estimé l'EBR d'un troisième type de rayonnement également utilisé en radiothérapie d'ions lourds (protons) par rapport à une irradiation γ, et nous avons comparé la radiosensibilité individuelle de ces trois types d'irradiation avec énergies différentes. Ensuite, nous avons évalué les rôles des télomères et de leur maintien pour la prédiction de la radiosensibilité individuelle. Nous avons constaté que la longueur moyenne des télomères, en combinaison avec leurs modifications radio-induites, peuvent être un bon prédicteur de la radiosensibilité individuelle. Enfin, nous avons montré comment les télomères pourraient être liés à des risques sanitaires à long terme après une irradiation: nous avons démontré que le raccourcissement des télomères pouvait être un nouveau facteur de prédiction de maladies cardiovasculaires après radiothérapie, et nous avons discuté par la suite, les télomères comme des acteurs clés dans le processus de cancérogenèse radio-induite. En conclusion, nous proposons un modèle présentant la façon dont les télomères pourraient jouer un rôle crucial dans ces deux pathologies radio-induite, et nous délibérons des relations entre le maintien des télomères, les effets biologiques radio-induites, et la radiosensibilité individuelle. / Exposure to ionizing radiation (IR), from both natural and man-made sources, is an inevitable part of modern life. It is well established that there are considerable inter-individual variations in sensitivity to IR among healthy individuals and cancer patients. However, the mechanisms involved in the heterogeneity of biological responses to IR are not well understood, and a reliable biodosimetric and clinical approach to measure and rank radiosensitivity remains to be established. In this thesis, we study the extent and impact of individual radiosensitivity in healthy individuals in the contexts of emergency dosimetry and radiotherapy, and we explore the roles of telomeres in the prediction of individual radiosensitivity and long-term human health risks following IR exposure (specifically, cardiovascular diseases and/or cancer). First, in the context of dosimetry in the event of an emergency situation (when rapid dose estimates of each individual in an irradiated population are needed), we demonstrate that the impact of individual radiosensitivity can be negligible using global cellular measurements of γH2AX fluorescence via flow cytometry in human fibroblasts and lymphocytes at 4 hours post-irradiation; this method could be an effective and rapid biodosimetry tool that can aid in the medical triage of irradiated individuals in an emergency setting based on individual levels of exposure. Second, we study the extent and influence of individual radiosensitivity on the induction of chromosomal aberrations following a routinely administered dose of 2 Gy during conventional fractionated photon radiotherapy (γ-rays) in lymphocytes of healthy individuals. For these analyses, we define individual radiosensitivity based on the frequency of IR-induced DNA double strand breaks (DSBs), which were calculated from the scoring of chromosomal aberrations visualized with telomere/centromere-fluorescence in situ hybridization (TC-FISH). This TC-FISH staining of metaphasic chromosomes enhances the “gold standard technique” of biodosimetry (the dicentric chromosome assay) with the visualization of telomeres and centromeres and thereby provides improved simplicity and sensitivity to the classical cytogenetic assay. We also compare individual radiosensitivity following γ-irradiation to that following carbon irradiation, an up-and-coming ion species currently being used in heavy ion radiotherapy. We provide dose response curves for both γ- and carbon irradiations based on the calculated frequency of IR-induced DNA DSBs at a range of doses, and estimate the relative biological effectiveness (RBE) of carbon irradiation relative to γ-irradiation. We then estimate the RBE of a third type of IR also frequently used in heavy ion radiotherapy (proton beams) in comparison to γ-irradiation, and compare individual radiosensitivity to each of these three types of IR with different IR energies. Third, we evaluate the roles of telomeres and telomere maintenance in the prediction of individual radiosensitivity; we find that inherent mean telomere length in combination with the IR-induced change in mean telomere length may be a strong predictor of individual radiosensitivity. Finally, we show how telomeres could be linked to long-term health risks following IR exposure: we demonstrate that telomere shortening could be a new prognostic factor for cardiovascular disease following radiotherapy, and discuss how telomeres could be key players in the process of radiation-induced carcinogenesis. In conclusion, we deliberate the relationships between telomere maintenance, radiation effects, and individual radiosensitivity, and propose a model of how telomeres could play crucial roles in the development of cardiovascular diseases and the process of IR-induced carcinogenesis.

La kinase dépendante des cyclines 5 (Cdk5) est un facteur de sensibilité aux inhibiteurs de PARP et aux rayonnements ionisants (RI), elle est nécessaire pour le point de contrôle du cycle cellulaire en phase S. Cependant, elle n’est pas directement impliquée dans la réparation des cassures de brin d’ADN, suggérant un rôle dans les étapes plus précoces de la signalisation des dommages. Nous rapportons ici que des cellules HeLa déplétées pour Cdk5 (Cdk5 KD) montrent une grande sensibilité aux RI surtout lorsqu'elles sont irradiées en phase S, au 5-Fluoro-Uracile, à la 6-Thioguanine et à une exposition chronique à l'hydroxyurée (HU). Les cellules Cdk5 KD montrent une altération de la dynamique de la phase S causée par une vitesse de réplication plus lente et une réduction des origines actives par mégabase d'ADN. En revanche, après un traitement au HU, ces cellules sortent plus rapidement du blocage en phase S. Ceci s’accompagne d’une déficience de la phosphorylation de RPA-32 sur les sérines 29 et 33 et de SMC1 sur la sérine 966 ainsi que d’une réduction du niveau de dommages de l'ADN évalués par le test des comètes alcalines, de l’intensité du signal gamma-H2AX, des foyers RPA, Rad51 et RPA sur les sérines 4 et 8 ainsi que du niveau d'échanges de chromatides sœurs. Des essais kinase in vitro couplés à la spectrométrie de masse ont montré que Cdk5 peut phosphoryler RPA-32 sur ses sérines 23, 29, et 33. De plus, des niveaux inférieurs d’expression de Cdk5 ont été associés à une meilleure survie sans métastases chez des patientes atteintes d’un cancer du sein et à une réduction de la survie des cellules de tumeurs du sein déplétées pour Cdk5 après un traitement aux RI et en présence d’un inhibiteur de PARP. Globalement, ces résultats montrent que Cdk5 est nécessaire pour la réplication basale et l'activation du point de contrôle en phase S en réponse à un stress réplicatif, ouvrant des perspectives cliniques intéressantes pour améliorer la destruction des cellules tumorales dans certaines populations de patientes atteintes de cancer du sein grâce à des agents qui génèrent un stress réplicatif. / Cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) is a determinant of sensitivity to PARP inhibitors and ionizing radiation (IR) and is required for the intra-S DNA damage checkpoint. It is not however directly implicated in strand break repair suggesting a role in the earlier steps of checkpoint activation. We report here that Cdk5-Depleted (Cdk5-KD) HeLa cells show higher sensitivity to IR when irradiated in S-Phase, and to chronic hydroxyurea (HU) exposure, 5-Fluorouracil and 6-Thioguanine. Cdk5-KD cells show altered basal S-Phase dynamics caused by a slower replication velocity and fewer active origins per megabase of DNA, however they show a faster recovery from an HU block. This was accompanied by impaired RPA-32 priming serine 29 and serine 33 phosphorylations and SMC1-Serine 966 phosphorylation as well as lower levels of DNA damage assessed by the alkaline Comet assay, gamma-H2AX signal intensity, RPA and Rad51 foci and RPA-32 serine 4 and serine 8 phosphorylation and levels of sister chromatid exchanges. In vitro kinase assays coupled with mass spectrometry showed that Cdk5 can phosphorylate RPA-32 on serines 23, 29, and 33. In addition lower Cdk5 levels were associated with longer metastasis free survival in breast cancer patients and lower cell survival in Cdk5 depleted breast tumor cells after treatment with IR and a PARP inhibitor. Taken together, these results show that Cdk5 is necessary for basal replication and replication stress checkpoint activation and opens up interesting clinical opportunities to enhance tumor cell killing in certain populations of breast cancer patients through agents that generate replication stress.

Macrophages associés aux tumeurs (TAMs) sont étroitement liés à l'initiation et la croissance tumorale, l'angiogenèse, l'invasion et les métastases tumorale, la résistance au traitement anti-cancéreux et sont associées à un mauvais pronostic dans de nombreux cancers. La radiothérapie est un des traitements les plus importants antitumoraux et a été montré pour pouvoir moduler les fonctions TAMs. Cependant, les mécanismes moléculaires dans l'activation des macrophages induite par irradiation sont largement inconnues. Dans cette étude, nous avons démontré que les rayonnements ionisants (IR) induit une activation des macrophages de type M1 in vitro et in vivo, qui est associée à une inhibition de la croissance tumorale induite par IR. Nous révélons que la protéine X induit par IR est essentiels dans le déclenchement de l'activation des macrophages. Nous confirmons l'importance de ces résultats en montrant que la sur-expression de la protéine X est liée à une augmentation des macrophages de type M1 chez les patients rectales suivants radiothérapie néo-adjuvante. L'accumulation des macrophages de type M1 est associée à une réponse antitumorale améliorée. Ce travail dévoile des rôles importants de la protéine X dans l'activation des macrophages IR-induite et constitue une base pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer l’efficacité de la radiothérapie par modulation de l'activation des macrophages. / Tumour-associated macrophages (TAMs) are closely related to tumour initiation and growth, angiogenesis, tumour invasion and metastasis, anti-cancer treatment resistance and are associated with poor prognosis in many cancers. Radiotherapy is among the most important anti-tumour therapies and has been shown to modulate TAMs functions. However, molecular mechanisms underlying irradiation-induced macrophage activation are largely unknown. In this study, we demonstrated that ionizing radiation (IR) induces macrophage M1 activation both in vitro and in vivo, which is associated with IR-induced tumour growth inhibition. We reveal that IR-induced X protein is critical in triggering macrophage activation. We confirm the significance of these findings by showing that up-regulation of X protein is related with increased M1 macrophages infiltration in rectal patients following neo-adjuvant radiotherapy. Accumulation of M1 macrophages is associated with an improved anti-tumour response. This work unveils important roles of X protein in IR-induced macrophages activation and provides basis for the development of new therapeutic strategies to enhance radiotherapy efficacy through modulating macrophage activation.

Les nombres aléatoires ont été de tous temps utilisés pour des jeux de hasard, plus récemment pour créer des codes secrets et ils sont aujourd'hui nécessaire à l'exécution de programmes informatiques. Les générateurs de nombres aléatoires sont maintenant bien éloignés de simples dés à lancer et sont constitués de circuits électroniques ou d'algorithmes. Ceci pose des problèmes quant à la reconnaissance du caractère aléatoire des nombres générés. De plus, de la même manière ou autrefois les dés étaient pipés pour augmenter les chances de gagner, il est aujourd'hui possible d'influencer la sortie des générateurs de nombres aléatoires. Ce sujet est donc toujours d'actualité avec des exemples récents très médiatisés. Ceci concernait en effet la console de jeu PS3 qui génère un nombre aléatoire constant où la distribution de clefs secrètes redondantes sur internet. Ce mémoire présente l'étude de plusieurs générateurs ainsi que diverses manières de les perturber. Il montre ainsi des faiblesses inhérentes à leurs conceptions et des conséquences possibles de leur défaillance sur des composants de sécurité. Ces travaux ont de plus permis de mettre en évidence l'importance des problématiques concernant le test des nombres aléatoires ainsi que des retraitements corrigeant des biais dans ces nombres.

L'objectif de cette thèse est de contribuer à l'estimation des risques radio-induits aux faibles débits dedose. Ce travail s'appuie sur la cohorte des travailleurs du nucléaire CEA-AREVA NC aprèsprolongation du suivi jusqu'en 2004. Une revue études épidémiologiques chez les travailleurs dunucléaire a été réalisée durant la première année de thèse. Une quantification de la relation doseréponsea été effectuée pour le risque de pathologies cancéreuses et non cancéreuses par différentesméthodes statistiques. Les facteurs modifiants la relation dose-réponse pour le risque de leucémieassocié à la dose ont été étudiés. Combinée à d'autres cohortes de travailleurs du nucléaire, cette étudepermettra de quantifier plus précisément les risques associés à de faibles doses chroniques, afin devalider les hypothèses actuelles du système de radioprotection.

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR.

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR. / Deinococcus radiodurans is a Gram-positive bacterium known for its extreme resistance to a broad variety of DNA damaging agents. Among these, Ionizing Radiations and desiccation are the most harmful for the cell, since they introduce breaks in the genome. Double Strand Breaks (DSB) are particularly hazardous for the cell and they need to be repaired very efficiently, in order to avoid mutations leading to altered, if not lethal, phenotypes. Homologous Recombination (HR) is the most efficient mechanism by which DSBs are repaired. D. radiodurans is able to completely restore its genome in only 3 hours, and it accomplishes the entire process through the RecFOR pathway. In order to be repaired, DSBs first need to be recognized. The protein believed to be responsible for this important step that takes place soon after the damage occurs in the cell, is RecN. RecN is recruited at the early stages of DNA repair and in vivo studies have demonstrated its propensity to localize to discrete foci. In vitro studies also suggest that RecN possesses a DNA end-joining activity previously observed for SMC proteins (such as cohesin), which are structurally related to RecN. Several structural studies have been carried out on the SMC-like protein, Rad50, but so far no structural information is available for RecN. The work presented here focused on the structural characterization of RecN and its constitutive domains. We obtained crystal structures of three partially overlapping constructs of RecN and Small Angle X-ray Scattering was performed on the individual domains and the full-length protein. The study of RecN in solution complemented our crystallographic study and enabled us to build a reliable, atomic model of the full-length protein. Mutations were designed and the mutant RecN proteins were produced in order to characterize the ATP hydrolysis activity of RecN, which is a conserved feature of this family of proteins. Extensive biochemical studies were carried out on wild-type and mutants of both the full-length protein and the single domains, in order to determine the role and function of each of the domains. Our results led us to propose a model for how RecN might recognize DSBs, tether two broken DNA ends and prepare the DNA for subsequent repair by the RecFOR machinery.