A flagelina é reconhecida pelo receptor TLR5, e pelos receptores NLRs, NLRC4/Naip5. Estes últimos induzem ativação de caspase-1 e liberação de IL-1b e IL-18, além da morte do macrófago por piroptose. Para investigar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, MOs peritoneais foram estimulados com flagelina de B. subtilis e S. typhimurium em sua forma livre (capaz de ativar TLR5), ou inserida em vesículas lipídicas (capaz de ativar os NLRs). Demonstramos que ambas as flagelinas citosólicas induzem produção de IL-1b e morte celular, embora a flagelina de S. typhimurium tenha mostrado maior potencial em induzir produção de IL-1b e IL-6 pelos MOs. Verificamos que a produção de IL-1b e lise celular de MOs se mostraram eventos subseqüentes à formação de poros na membrana celular. Embora a liberação de IL-1b após reconhecimento de ambas as flagelinas ser um fenômeno dependente do eixo NLRC4/caspase-1, a morte celular induzida pelas flagelinas citosólicas ocorre na ausência destas moléculas, ao contrário do que prevê a literatura atual. / Flagellin is recognized by TLR5, and NLRs NLRC4/Naip5. The latter induce activation of caspase-1 and release of IL-1b and IL-18, besides the death of macrophages by pyroptosis. To investigate the molecular mechanisms involved in these processes, peritoneal MOs were stimulated with flagellin from B. subtilis and S. typhimurium in its free form (activating TLR5), or inserted into lipid vesicles (able to activate NLRs). We demonstrated that both cytosolic flagellins induce the production of IL-1b and cell death, while the flagellin of S. typhimurium has shown greater potential to induce production of IL-1b and IL-6 by MOs. We found that the production of IL-1b and cell lysis by MOs are subsequent events proven by the formation of pores in cell membranes. Although the release of IL-1b after recognition of both flagellins is a phenomenon dependent on the axis NLRC4/caspase-1, cell death induced by cytosolic flagellin occurs in the absence of these molecules, unlike that provided by the current literature.

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed Feb. 18, 2009). Includes bibliographical references.

A flagelina é reconhecida pelo receptor TLR5, e pelos receptores NLRs, NLRC4/Naip5. Estes últimos induzem ativação de caspase-1 e liberação de IL-1b e IL-18, além da morte do macrófago por piroptose. Para investigar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, MOs peritoneais foram estimulados com flagelina de B. subtilis e S. typhimurium em sua forma livre (capaz de ativar TLR5), ou inserida em vesículas lipídicas (capaz de ativar os NLRs). Demonstramos que ambas as flagelinas citosólicas induzem produção de IL-1b e morte celular, embora a flagelina de S. typhimurium tenha mostrado maior potencial em induzir produção de IL-1b e IL-6 pelos MOs. Verificamos que a produção de IL-1b e lise celular de MOs se mostraram eventos subseqüentes à formação de poros na membrana celular. Embora a liberação de IL-1b após reconhecimento de ambas as flagelinas ser um fenômeno dependente do eixo NLRC4/caspase-1, a morte celular induzida pelas flagelinas citosólicas ocorre na ausência destas moléculas, ao contrário do que prevê a literatura atual. / Flagellin is recognized by TLR5, and NLRs NLRC4/Naip5. The latter induce activation of caspase-1 and release of IL-1b and IL-18, besides the death of macrophages by pyroptosis. To investigate the molecular mechanisms involved in these processes, peritoneal MOs were stimulated with flagellin from B. subtilis and S. typhimurium in its free form (activating TLR5), or inserted into lipid vesicles (able to activate NLRs). We demonstrated that both cytosolic flagellins induce the production of IL-1b and cell death, while the flagellin of S. typhimurium has shown greater potential to induce production of IL-1b and IL-6 by MOs. We found that the production of IL-1b and cell lysis by MOs are subsequent events proven by the formation of pores in cell membranes. Although the release of IL-1b after recognition of both flagellins is a phenomenon dependent on the axis NLRC4/caspase-1, cell death induced by cytosolic flagellin occurs in the absence of these molecules, unlike that provided by the current literature.

Macrophages associés aux tumeurs (TAMs) sont étroitement liés à l'initiation et la croissance tumorale, l'angiogenèse, l'invasion et les métastases tumorale, la résistance au traitement anti-cancéreux et sont associées à un mauvais pronostic dans de nombreux cancers. La radiothérapie est un des traitements les plus importants antitumoraux et a été montré pour pouvoir moduler les fonctions TAMs. Cependant, les mécanismes moléculaires dans l'activation des macrophages induite par irradiation sont largement inconnues. Dans cette étude, nous avons démontré que les rayonnements ionisants (IR) induit une activation des macrophages de type M1 in vitro et in vivo, qui est associée à une inhibition de la croissance tumorale induite par IR. Nous révélons que la protéine X induit par IR est essentiels dans le déclenchement de l'activation des macrophages. Nous confirmons l'importance de ces résultats en montrant que la sur-expression de la protéine X est liée à une augmentation des macrophages de type M1 chez les patients rectales suivants radiothérapie néo-adjuvante. L'accumulation des macrophages de type M1 est associée à une réponse antitumorale améliorée. Ce travail dévoile des rôles importants de la protéine X dans l'activation des macrophages IR-induite et constitue une base pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer l’efficacité de la radiothérapie par modulation de l'activation des macrophages. / Tumour-associated macrophages (TAMs) are closely related to tumour initiation and growth, angiogenesis, tumour invasion and metastasis, anti-cancer treatment resistance and are associated with poor prognosis in many cancers. Radiotherapy is among the most important anti-tumour therapies and has been shown to modulate TAMs functions. However, molecular mechanisms underlying irradiation-induced macrophage activation are largely unknown. In this study, we demonstrated that ionizing radiation (IR) induces macrophage M1 activation both in vitro and in vivo, which is associated with IR-induced tumour growth inhibition. We reveal that IR-induced X protein is critical in triggering macrophage activation. We confirm the significance of these findings by showing that up-regulation of X protein is related with increased M1 macrophages infiltration in rectal patients following neo-adjuvant radiotherapy. Accumulation of M1 macrophages is associated with an improved anti-tumour response. This work unveils important roles of X protein in IR-induced macrophages activation and provides basis for the development of new therapeutic strategies to enhance radiotherapy efficacy through modulating macrophage activation.

O tratamento de indivíduos que apresentam leishmaniose, seja ela cutânea ou visceral, é usualmente problemático, uma vez que os medicamentos utilizados na prática clínica são altamente tóxicos, requerem administração parenteral e nem sempre promovem a cura dos pacientes. Torna-se clara, portanto, a necessidade de se pesquisar novos fármacos com potencial leishmanicida. O objetivo da presente Tese de Doutorado foi caracterizar a atividade do tamoxifeno, composto utilizado no tratamento do câncer de mama há décadas, contra diferentes espécies de Leishmania in vitro e in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. As concentrações inibitórias de tamoxifeno para 50% de culturas de parasitas tanto de cepas de laboratório como de isolados recentes de pacientes variaram de 5 a 20 mM. Além disso, nossos resultados mostraram que a aplicação intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de citrato de tamoxifeno por duas semanas levou à redução significativa no tamanho das lesões e das úlceras na base da cauda de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis, bem como à diminuição da carga parasitária. Diferentes modelos de infecção animal comprovaram ainda a eficácia de tamoxifeno contra L. (L.) chagasi e L (V.) braziliensis. Apesar da atividade deste fármaco estar diretamente relacionada à inibição da ligação de estrógeno ao seu receptor, ele exibe efeitos moduladores da atividade de proteínas sinalizadoras em concentrações próximas às efetivas contra Leishmania. Primeiramente verificamos que tamoxifeno foi capaz de induzir rapidamente a alcalinização de vacúolos de macrófagos peritoniais contendo amastigotas de L. (L.) amazonensis, sendo este um efeito observado em períodos curtos e longos de incubação com a droga. Esta alcalinização parece não estar diretamente relacionada à morte dos parasitas pela alteração imediata das condições ideais do meio necessário à sobrevivência das formas amastigotas, mas sim ligada ao aumento do efeito leishmanicida de tamoxifeno, uma vez que este composto apresentou-se mais ativo na faixa de pH neutro a moderadamente alcalino. Outro alvo investigado foi a biossíntese de isoprenóides de promastigotas. Células tratadas com tamoxifeno apresentaram redução global na biossíntese de farnesol, geraniol, dolicol, ergosterol e ubiquinona após marcação metabólica com [14C]-leucina, indicando que tamoxifeno não interfere especificamente na síntese de cada um destes produtos. Iniciamos também a investigação dos efeitos do tamoxifeno no metabolismo de ceramidas em Leishmania adotando a estratégia de marcação metabólica de promastigotas com C6-NBD-ceramida. Verificamos que promastigotas de Leishmania são capazes de incorporar eficientemente ceramida conjugada ao fluoróforo NBD. Em nossos ensaios, a incubação de promastigotas tanto com os inibidores clássicos da via de biossíntese de esfingolipídios como com tamoxifeno resultou na alteração do perfil de incorporação dos precursores utilizados. O tratamento com tamoxifeno aumentou a biossíntese de glucosilceramida acetilada, elevou os níveis de ceramida acilada e diminuiu a biossíntese de fosfoesfingolipídios de promastigotas de L. (L.) amazonensis. Finalmente, nossos dados mostraram ainda que tamoxifeno permeabiliza a membrana plasmática de promastigotas de L. (L.) amazonensis e, a partir de estudos por microscopia eletrônica de transmissão, verificamos que este fármaco alterou a estrutura mitocondrial dos parasitas e provocou intensa vacuolização do citoplasma. Os resultados apresentados neste trabalho configuram o primeiro relato da atividade de tamoxifeno contra Leishmania e justificam a realização de futuros testes deste fármaco como uma alternativa na quimioterapia da leishmaniose. / The treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis is challenging, since the drugs used are frequently ineffective, very toxic and require parenteral administration. Therefore, the discovery of new drugs with leishmanicidal activity is in pressing need. The objective of this thesis was to characterize the activity of tamoxifen, a drug used in the treatment of breast cancer for decades, against Leishmania spp. in vitro and in vivo, and to identify its possible mechanism of action. The inhibitory concentrations of tamoxifen for 50% of parasite cultures, from reference strains and recent isolates from patients, ranged from 5 to 20 mM. Moreover, we showed that the intraperitoneal administration of 20 mg/kg/day tamoxifen citrate for two weeks led to significant reductions in the lesion and ulcer sizes and parasite burden in L. (L.) amazonensis-infected BALB/c mice. Additionally, the administration of tamoxifen in two other models of animal infection proved its effectiveness against L. (L.) chagasi and L (V.) braziliensis. In an attempt to characterize tamoxifens mechanism of action against Leishmania, we found that this drug was able to induce a rapid alkalinization of macrophage vacuoles containing L. (L.) amazonensis amastigotes. This phenomenon does not appear to be related to the death of the parasites, but rather is linked to an increased antileishmanial effect of tamoxifen. Another target investigated was the interference of tamoxifen in the biosynthesis of isoprenoids. Treated cells showed an overall reduction in the biosynthesis of farnesol, geraniol, dolichol, ergosterol and ubiquinone after metabolic labeling with [14C]-leucine, indicating that tamoxifen does not interfere specifically in the synthesis of those products. We have also studied the effects of tamoxifen on Leishmania ceramide metabolism. The strategy adopted was the metabolic labeling of promastigotes with C6-NBD-ceramide. Our results showed that Leishmania is able to incorporate NBD-ceramide. The incubation of promastigotes with classical inhibitors of sphingolipid biosynthesis as well as with tamoxifen resulted in striking modifications in the pattern of sphingolipid biosynthesis. L. (L.) amazonensis promastigotes treated with tamoxifen showed increased biosynthesis of acetylated glucosylceramide and acyl-ceramide and decreased synthesis of phosphosphingolipids. Finally, our data showed that tamoxifen induced the permeabilization of the promastigote plasma membrane and, based on studies using transmission electron microscopy, we found that this drug altered the mitochondrial structure and caused intense cytoplasmic vacuolization. The results presented here comprise the first report of the activity of tamoxifen against Leishmania and offer support for future trials to evaluate tamoxifen as an alternative for leishmaniasis chemotherapy.

O tratamento de indivíduos que apresentam leishmaniose, seja ela cutânea ou visceral, é usualmente problemático, uma vez que os medicamentos utilizados na prática clínica são altamente tóxicos, requerem administração parenteral e nem sempre promovem a cura dos pacientes. Torna-se clara, portanto, a necessidade de se pesquisar novos fármacos com potencial leishmanicida. O objetivo da presente Tese de Doutorado foi caracterizar a atividade do tamoxifeno, composto utilizado no tratamento do câncer de mama há décadas, contra diferentes espécies de Leishmania in vitro e in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. As concentrações inibitórias de tamoxifeno para 50% de culturas de parasitas tanto de cepas de laboratório como de isolados recentes de pacientes variaram de 5 a 20 mM. Além disso, nossos resultados mostraram que a aplicação intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de citrato de tamoxifeno por duas semanas levou à redução significativa no tamanho das lesões e das úlceras na base da cauda de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis, bem como à diminuição da carga parasitária. Diferentes modelos de infecção animal comprovaram ainda a eficácia de tamoxifeno contra L. (L.) chagasi e L (V.) braziliensis. Apesar da atividade deste fármaco estar diretamente relacionada à inibição da ligação de estrógeno ao seu receptor, ele exibe efeitos moduladores da atividade de proteínas sinalizadoras em concentrações próximas às efetivas contra Leishmania. Primeiramente verificamos que tamoxifeno foi capaz de induzir rapidamente a alcalinização de vacúolos de macrófagos peritoniais contendo amastigotas de L. (L.) amazonensis, sendo este um efeito observado em períodos curtos e longos de incubação com a droga. Esta alcalinização parece não estar diretamente relacionada à morte dos parasitas pela alteração imediata das condições ideais do meio necessário à sobrevivência das formas amastigotas, mas sim ligada ao aumento do efeito leishmanicida de tamoxifeno, uma vez que este composto apresentou-se mais ativo na faixa de pH neutro a moderadamente alcalino. Outro alvo investigado foi a biossíntese de isoprenóides de promastigotas. Células tratadas com tamoxifeno apresentaram redução global na biossíntese de farnesol, geraniol, dolicol, ergosterol e ubiquinona após marcação metabólica com [14C]-leucina, indicando que tamoxifeno não interfere especificamente na síntese de cada um destes produtos. Iniciamos também a investigação dos efeitos do tamoxifeno no metabolismo de ceramidas em Leishmania adotando a estratégia de marcação metabólica de promastigotas com C6-NBD-ceramida. Verificamos que promastigotas de Leishmania são capazes de incorporar eficientemente ceramida conjugada ao fluoróforo NBD. Em nossos ensaios, a incubação de promastigotas tanto com os inibidores clássicos da via de biossíntese de esfingolipídios como com tamoxifeno resultou na alteração do perfil de incorporação dos precursores utilizados. O tratamento com tamoxifeno aumentou a biossíntese de glucosilceramida acetilada, elevou os níveis de ceramida acilada e diminuiu a biossíntese de fosfoesfingolipídios de promastigotas de L. (L.) amazonensis. Finalmente, nossos dados mostraram ainda que tamoxifeno permeabiliza a membrana plasmática de promastigotas de L. (L.) amazonensis e, a partir de estudos por microscopia eletrônica de transmissão, verificamos que este fármaco alterou a estrutura mitocondrial dos parasitas e provocou intensa vacuolização do citoplasma. Os resultados apresentados neste trabalho configuram o primeiro relato da atividade de tamoxifeno contra Leishmania e justificam a realização de futuros testes deste fármaco como uma alternativa na quimioterapia da leishmaniose. / The treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis is challenging, since the drugs used are frequently ineffective, very toxic and require parenteral administration. Therefore, the discovery of new drugs with leishmanicidal activity is in pressing need. The objective of this thesis was to characterize the activity of tamoxifen, a drug used in the treatment of breast cancer for decades, against Leishmania spp. in vitro and in vivo, and to identify its possible mechanism of action. The inhibitory concentrations of tamoxifen for 50% of parasite cultures, from reference strains and recent isolates from patients, ranged from 5 to 20 mM. Moreover, we showed that the intraperitoneal administration of 20 mg/kg/day tamoxifen citrate for two weeks led to significant reductions in the lesion and ulcer sizes and parasite burden in L. (L.) amazonensis-infected BALB/c mice. Additionally, the administration of tamoxifen in two other models of animal infection proved its effectiveness against L. (L.) chagasi and L (V.) braziliensis. In an attempt to characterize tamoxifens mechanism of action against Leishmania, we found that this drug was able to induce a rapid alkalinization of macrophage vacuoles containing L. (L.) amazonensis amastigotes. This phenomenon does not appear to be related to the death of the parasites, but rather is linked to an increased antileishmanial effect of tamoxifen. Another target investigated was the interference of tamoxifen in the biosynthesis of isoprenoids. Treated cells showed an overall reduction in the biosynthesis of farnesol, geraniol, dolichol, ergosterol and ubiquinone after metabolic labeling with [14C]-leucine, indicating that tamoxifen does not interfere specifically in the synthesis of those products. We have also studied the effects of tamoxifen on Leishmania ceramide metabolism. The strategy adopted was the metabolic labeling of promastigotes with C6-NBD-ceramide. Our results showed that Leishmania is able to incorporate NBD-ceramide. The incubation of promastigotes with classical inhibitors of sphingolipid biosynthesis as well as with tamoxifen resulted in striking modifications in the pattern of sphingolipid biosynthesis. L. (L.) amazonensis promastigotes treated with tamoxifen showed increased biosynthesis of acetylated glucosylceramide and acyl-ceramide and decreased synthesis of phosphosphingolipids. Finally, our data showed that tamoxifen induced the permeabilization of the promastigote plasma membrane and, based on studies using transmission electron microscopy, we found that this drug altered the mitochondrial structure and caused intense cytoplasmic vacuolization. The results presented here comprise the first report of the activity of tamoxifen against Leishmania and offer support for future trials to evaluate tamoxifen as an alternative for leishmaniasis chemotherapy.