Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-13T14:06:52Z No. of bitstreams: 1 2016_LaísdeSousaBarbosa.pdf: 4154597 bytes, checksum: 4c2a3096358cece8e1b4913003b10033 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-28T15:33:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LaísdeSousaBarbosa.pdf: 4154597 bytes, checksum: 4c2a3096358cece8e1b4913003b10033 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-28T15:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LaísdeSousaBarbosa.pdf: 4154597 bytes, checksum: 4c2a3096358cece8e1b4913003b10033 (MD5) / Neste trabalho foi explorado, a partir de uma análise químico-quântica, o rearranjo do tipo McLafferty – modelo mecanístico bastante aplicado na interpretação de surgimento de intermediários no espectro de massa – para os sistemas do 1-nitropropano, 2-pentanona e butirofenona. Esta exploração teórica, através da combinação dos métodos M06/6-311G(d,p)//UHF/LanL2MB, permitiu a construção de um perfil termodinâmico, cinético e eletrônico do referido rearranjo, onde constatou-se que o rearranjo clássico é improvável, cinética e termodinamicamente, quando comparado ao mecanismo em etapas. Através de análises QTAIM foi verificado que o processo de fragmentação depende diretamente da natureza do substituinte X, onde quanto maior a natureza retiradora do grupo, mais instável é o intermediário formado. Esta tendência topologicamente observada, reflete no comportamento cinético e termodinâmico do rearranjo do tipo McLafferty. / In this work we explored, from a quantum-chemical analysis, a McLafferty rearrangement type - mechanistic model widely applied in the interpretation of intermediate rises in the mass spectrum – for systems 1-nitropropane, 2-pentanone and butyrophenone. This theoretical exploration, through the M06/6-311G(d, p)//UHF/LanL2MB, allowed the thermodynamical, kinetical and electronic profile of the rearrangement, where it was found that the classical rearrangement is unlikely, thermodynamically and kinetically, compared to the stepwise mechanism. Through the QTAIM analysis it was found that the fragmentation process depends directly of the substituent X nature, where the higher withdrawing nature of the group, lead to the more unstable intermediate. This topological observed trend reflects the kinetic and thermodynamic behavior of the type McLafferty rearrangement.

Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-02T21:33:20Z No. of bitstreams: 1 2018_MiltonRegodePaulaJunior.pdf: 8442618 bytes, checksum: 6b582db99e5fe3171d556dff5616c008 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-09T18:34:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_MiltonRegodePaulaJunior.pdf: 8442618 bytes, checksum: 6b582db99e5fe3171d556dff5616c008 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-09T18:34:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_MiltonRegodePaulaJunior.pdf: 8442618 bytes, checksum: 6b582db99e5fe3171d556dff5616c008 (MD5) Previous issue date: 2018-10-09 / A Mielofibrose (MF), conhecida também como Metaplasia Mielóide Agnogênica ou Mielofibrose Crônica Idiopática, é a menos frequente das neoplasias mieloproliferativas, sendo uma doença clonal ocasionada pela transformação neoplásica de célula hematopoiética pluripotente acompanhada de alterações reacionais intensas do estroma medular com fibrose colagênica, osteoesclrose e angiogênese. A MF é caracterizada por citopenias e/ou leucocitose, leucoeritroblastose, fibrose progressiva da medula óssea e hematopoiese extramedular com esplenomegalia. A patogênese molecular ainda é desconhecida e envolve várias alterações citogenéticas. O principal objetivo deste estudo foi investigar a presença de rearranjos cromossômicos em pacientes com MF. A análise cromossômica por microarranjos (CMA) permitiu ampliar o alcance e a sensibilidade na detecção de deleções e duplicações submicroscópicas para a compreensão de seus papéis que podem influenciar o diagnósitico, prognóstiico e evolução da MF e tem revelado alterações associadas à MF. Foram selecionados 16 pacientes, sendo 13 com mielofibrose primária e 3 pacientes com MF pós TE (MF pós trombocitemia Essencial). Em todos eles foi realizada uma investigação de alterações cromossômicas submicroscópicas por meio da CMA utilizando a plataforma Affymetrix CytoScan™750k (Affymetrix, EUA) e CytoScan HD. A citogenética convencional revelou anormalidades cromossômicas em 3 dos 16 casos (18,75%), enquanto que a análise de microarranjos cromossômicos detectou variações no número de cópias (CNV) ou segmentos de perda de heterozigose (LOH) em 10 de 16 (62,5%) pacientes. Estes incluíram 48 LOHs, 14 deleções, uma trissomia e uma duplicação. Dez pacientes apresentaram anormalidades cromossômicas múltiplas, variando de duas a treze CNVs ou LOHs. As alterações incluíam um total de 6196 genes, sendo 69 já associados com cânceres e 17 descritos em neoplasias hematológicas. Considerando que a maioria das CNV identificadas foram menores do que a resolução do cariotipo e a alta freqüência de LOHs em nosso estudo, propomos que as plataformas de microarranjo cromossômico que combinem oligos e polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) devem ser investigadas como um teste genético de primeira linha para auxiliar o diagnóstico em pacientes com mielofibrose. / Myelofibrosis (PM), also known as Agnogenic Myeloid Metaplasia or Idiopathic Chronic Myelofibrosis, is the least frequent of myeloproliferative neoplasms. It is characterized by a clonal disease caused by the neoplastic transformation of pluripotent hematopoietic cells accompanied by intense reactional alterations of the medullary stroma with collagen fibrosis, osteosclerosis and angiogenesis. It is characterized by cytopenias and / or leukocytosis, leukoeritroblastosis, progressive fibrosis of the bone marrow and extramedullary hematopoiesis with splenomegaly. Molecular pathogenesis is still unknown and involves several cytogenetic changes. The main goal of this study was to investigate the presence of chromosomal rearrangements in patients with MF Chromosome Microarray Analysis (CMA) has allowed increasing the sensitivity in the detection of submicroscopic deletions and duplications and the understanding of their roles in the pathogenic processes and has revealed alterations associated with MF. Sixteen patients were selected, 13 of whom had primary myelofibrosis and 3 patients with myelofibrosis pos- ET. In all of them, an investigation of submicroscopic chromosomal alterations was performed using the Affymetrix CytoScan ™ 750k (Affymetrix, USA) and CytoScan HD platform. Conventional cytogenetics revealed chromosomal abnormalities in 3 of the 16 cases (18.7%), whereas the analysis of chromosomal microarrays detected variations in number of copies (CNV) or loss of heterozygosity change (LOH) in 10 of 16 (66,5%) patients. These included 48 LOHs, 14 deletions, one trisomy and one duplication. Ten patients had multiple chromosomal abnormalities, ranging from two to thirteen CNVs or LOHs. The alterations encompassed a total of 6196 genes, 69 asociated to cancers and 17 described in hematological malignancies. Considering that most of the CNVs identified were smaller than the resolution of the karyotype and the high frequency of LOHs in our study, we propose that chromosomal microarray platforms that combine oligos and single nucleotide polymorphism (SNP) should be used as a genetic test of the first line to aid the diagnosis in patients with myelofibrosis.

Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

O presente trabalho divide-se em três capítulos: Capítulo I - Nova síntese de ?-xiloidona: rearranjo de Claisen em hidroxinaftoquinonas; Capítulo II - Síntese e estudo de reatividade de promissores núcleos heteroaromáticos subexplorados pela química medicinal; Capítulo III - Análise computacional de similaridade e propriedades físico-químicas dos núcleos heterocíclicos do capítulo II. O capítulo I descreve uma nova rota para a síntese de ?-xiloidona, um produto natural relacionado ao lapachol, subexplorado pela química medicinal. Esta rota é baseada no rearranjo propargílico de Claisen, a partir da reação de lausona com 3-cloro-3- metilbutino sob catálise de CuCl2/I2.Este capítulo também descreveu a síntese de um derivado furano naftoquinoidal, o qual pode ser utilizado como precursor de ?- duniona, via rearranjo de Claisen aril-alílico. Além da realização desta metodologia substituindo o 3-cloro-3-metilbutino por cinco diferentes alcinos. Este novo processo ofereceu como vantagens principais o menor custo dos catalisadores empregados, os rendimentos melhorados e o reduzido número de etapas reacionais em relação as rotas descritas na literatura para obtenção de?-xiloidona. O Capítulo II apresenta o desenvolvimento de métodos sintéticos novos e eficazes para 3 núcleos heterocíclicos (naftiridinona, pirazolopiridinona e dihidropirrolopirazinona) pouco explorados pela química medicinal porém com potencial para descoberta de fármacos. Buscando abranger metodologias orientadas pela diversidade, neste capítulo foi realizado um estudo preliminar de reatividade destes núcleos frente diferentes abordagens, tanto frente métodos diretos de arilação quanto metodologias clássicas de modificação de anéis aromáticos. Além disso, no capítulo III foram realizados estudos de similaridade para a obtenção de padrões estruturais que possam ser aplicados em programas de descoberta de fármacos assim como o estudo de propriedades físico-químicas dos núcleos do capítulo II. Todo este trabalho permitiu desenvolver 10 moléculas inéditas na literatura, bem como novas metodologias para a síntese de compostos previamente descritos. / The present work is divided in two chapters: Chapter I - New synthesis of ? - xiloidone: Claisen rearrangement of hydroxynaphthoquinones; Chapter II - Synthesis and reactivity study of promising heteroaromatic coresunderstudied by medicinal chemistry; Chapter III - Similarity and physic-chemical properties analysis of the heterocyclic cores from chapter II. Chapter I describes a newsynthetic route to?- xiloidona, which isa natural product related to lapachol and understudied by medicinal chemistry. This route is based on propargyl Claisen rearrangement from the reaction of lawsone and 3-chloro-3- methylbutynemediated by CuCl2/I2. This chapter also describes the synthesis of a furan derivative which can be used as?- dunnione precursor. Also this methodology had been applied replacing the 3-chloro- 3-methyllbutynefor five different alkynes. This new process is associated with lower cost, improved yields and reduced number of reaction steps when compared to the literature. The chapter II aimed at the development of synthetic methods to obtain 3 heterocyclic cores(naphthyridinone, pyrazolopyridinoneand dihydropyrrolopyrazinone)with drug discovery potential but also understudied by medicinal chemistry. Diversity-oriented methodologies had been performedresulting in a reactivity study of these cores across severalsynthetic approaches. Furthermore, the chapter III described the similarity studies that were conducted aiming to obtain structural patterns that can be applied in drug discovery programs. This work describes the development of 10 non-published molecules as well as new methodologies for the synthesis of these previously described compounds.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T15:06:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado Paola Cristina Resende Silva.pdf: 1538372 bytes, checksum: 8c68a244d3e53f424ddb574f985bcad8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T15:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado Paola Cristina Resende Silva.pdf: 1538372 bytes, checksum: 8c68a244d3e53f424ddb574f985bcad8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Globalmente, as infecções causadas pelos vírus Influenza constituem um importante desafio para a Saúde Pública. Os vírus Influenza B pertencem à família Orthomyxoviridae, seu genoma viral é constituído por um RNA de fita simples e polaridade negativa. O processo de drift antigênico favorece o contínuo aparecimento de novas variantes virais, o que demanda a reformulação anual da vacina. No início década de 80, foi observada a divergência do vírus Influenza B em duas linhagens antigênica e filogeneticamente distintas: B/Victoria/2/87-like (Vic87) e B/Yamagata/16/88-like (Yam88), que tem co-circulado em diferentes países na última década. O objetivo deste estudo consiste na identificação e caracterização molecular das linhagens de Influenza B circulantes em diferentes regiões brasileiras durante as epidemias de 2004 a 2008, com base no sequenciamento dos genes Hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA). Ainda, padronizamos a metodologia de Eletroforese em Gel com Gradientes Desnaturantes (DGGE), visando à rápida tipagem dos vírus B. Diferentes substituições nos genes da HA e NA foram encontradas. Evidenciamos a co-circulação de ambas as linhagens no período estudado, contudo, não observamos a ocorrência de rearranjo gênico e nem a emergência de cepas resistentes aos inibidores de neuraminidase, com base nos genes investigados. No período 2006-2008, observamos a adequada concordância entre as cepas circulantes e as cepas vacinais preconizadas para uso no Hemisfério Sul. Entretanto, o mesmo não foi verdadeiro para o período 2004-2005. Finalmente, o protocolo de DGGE desenvolvido pode ser eficientemente utilizado para fins de rápida tipagem das linhagens de Influenza B. Os achados deste estudo contribuem para a melhor compreensão sobre a variabilidade dos vírus Influenza B e os mecanismos envolvidos na sua evolução molecular, bem como o padrão de circulação das linhagens virais no Brasil e sua correspondência com as vacinas para Influenza, anualmente administradas no Hemisfério Sul. Este conjunto de informações são de grande relevância para a contínua adequação e implementação das políticas e estratégias voltadas ao controle e prevenção de infecções por Influenza na nossa população. / Worldwide, Influenza infections are a major Public Health issue. Influenza B virus is classified into the Orthomyxoviridae family, the viral genome consists of a single strand RNA and negative polarity. Because of antigenic drift, novel viral variants are continuously rising, what demands the annual review of vaccine formulation. In the early 80´s, was observed the divergence of Influenza B into two distinct antigenic and phylogenetic lineages – B/Victoria/2/87-like (Vic87) and B/Yamagata/16/88-like (Yam88), was observed. In some countries, these strains have been co-circulating in the last 10 years. The aim of this study was to investigate the circulation patterns of Vic87 and Yam88 among different Brazilian regions during the 2004-2008 epidemics, based on haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) sequencing. Moreover, a Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) protocol was standardized for rapid typing of Flu B typing into Yam88-like and Vic87-like strains. Different Aminoacid substitutions in the HA and NA were encountered. Along the studied period, our findings showed that both viral lineages have been co-circulating in Brazil. Moreover, no evidence of reassortant nor NA inhibitor-resistant viruses was found. From 2006 to 2008, an adequate match between vaccine and circulating strains was met. However, it was not true for 2004-2005 years. Finally, our DGGE protocol can be successfully used as a rapid Flu B strain typing test. Our findings contribute for a better figure of Flu B genetic variability and its molecular evolution mechanisms, in addition to the circulation patterns of Flu B lineages in Brazil, and their respective association with the vaccine strains used in the Southern Hemisphere. Altogether, these are pivotal information to continuously tailor and implement Public Health policies on behalf of the control and prevention of Influenza infections.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T13:13:42Z No. of bitstreams: 1 2014_PollyannaAlmeidaCostadosSantos.pdf: 3822000 bytes, checksum: bf7c29f498ed44424aa1ba40647463b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-26T11:49:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_PollyannaAlmeidaCostadosSantos.pdf: 3822000 bytes, checksum: bf7c29f498ed44424aa1ba40647463b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-26T11:49:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_PollyannaAlmeidaCostadosSantos.pdf: 3822000 bytes, checksum: bf7c29f498ed44424aa1ba40647463b4 (MD5) / O espectro óculo-aurículo-vertebral (OAVS) caracteriza-se por malformações congênitas envolvendo o primeiro e segundo arcos branquiais, de origem genética, ambiental ou uma associação de ambas, que ocorrem durante a sétima semana de gestação. Os pacientes podem apresentar dermóides epibulbares ou lipodermóides, apêndices pré-auriculares, anotia ou microtia, assimetria mandibular e anormalidades nas vértebras cervicais. O objetivo deste estudo foi identificar genes ou regiões cromossômicas relacionadas a OAVS utilizando as técnicas de MLPA e análise cromossômica por microarray. Foram estudados 27 casos, sendo 20 isolados e sete familiais. Foram testados dez pacientes por MLPA, utilizando sondas para os genes GSC, PPM1A, WNT5B, NKD2, OTX2, DAAM, SIX1, SIX6, GSC2, MAPK1 e BAPX1, sendo que todos apresentaram resultados normais. Pela análise cromossômica por microarray, foram testados 26 pacientes. Dentre eles, 14 (53,8%) não apresentaram anormalidades além daquelas já descritas como CNVs polimórficas. Os outros 12 pacientes apresentaram rearranjos cromossômicos diversos: del22q11.2, del12q24.21, LOH 3p26.3-14.3, del2p25.3 e dup2p25.3, dup4q21.1, dup20p12.3-12.2, dup1q31.1 e dup10q23.31, dup11p15.5, LOH 12q15-q22, dup12p12.1, dup6q21. Dentre os microrrearranjos encontrados, três foram de novo, um de herança materna e um de herança paterna. Nos outros sete pacientes a origem do rearranjo ainda não foi determinada. As alterações cromossômicas identificadas são não recorrentes reforçando a heterogeneidade da síndrome. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The oculo-auriculo-vertebral spectrum (OAVS), is characterized by malformations involving the first and second branchial arches, and can be genetic and/or caused by environmental effects that occur during the seventh week of pregnancy. Patients may present epibulbar or lipodermoids, preauricular tags, anotia or microtia, mandibular asymmetry and abnormalities of cervical vertebrae. The aim of this study was to identify genes or chromosomal regions related to OAVS using MLPA and chromosome microarray analysis. Twenty-seven cases were studied, being 20 sporadic and seven familial. Ten patients were tested by MLPA, using probes for GSC, PPM1A, WNT5B, NKD2, OTX2, DAAM, SIX1, SIX6, GSC2, MAPK1 and BAPX1 genes, and all presented normal results. Twenty-six patients were tested by chromosome microarray analysis. Among these, 14 (53.8 %) had no chromosomal abnormalities other than already described polymorphic CNVs. The other 12 patients showed various chromosome rearrangements: del22q11.2, del12q24.21, LOH 3p26.3-14.3, del2p25.3 and dup2p25.3, dup4q21.1, dup20p12.3-12.2, dup1q31.1 and dup10q23.31, dup11p15.5, LOH 12q15-q22, dup12p12.1, dup6q21. Between these rearrangements, , three were de novo, one maternally inherited and one paternally inherited. In the other seven patients the origin of the rearrangements have not been determined yet. The chromosome abnormalities identified are non-recurrent, reinforcing the heterogeneity of the syndrome.

O presente trabalho divide-se em três capítulos: Capítulo I - Nova síntese de ?-xiloidona: rearranjo de Claisen em hidroxinaftoquinonas; Capítulo II - Síntese e estudo de reatividade de promissores núcleos heteroaromáticos subexplorados pela química medicinal; Capítulo III - Análise computacional de similaridade e propriedades físico-químicas dos núcleos heterocíclicos do capítulo II. O capítulo I descreve uma nova rota para a síntese de ?-xiloidona, um produto natural relacionado ao lapachol, subexplorado pela química medicinal. Esta rota é baseada no rearranjo propargílico de Claisen, a partir da reação de lausona com 3-cloro-3- metilbutino sob catálise de CuCl2/I2.Este capítulo também descreveu a síntese de um derivado furano naftoquinoidal, o qual pode ser utilizado como precursor de ?- duniona, via rearranjo de Claisen aril-alílico. Além da realização desta metodologia substituindo o 3-cloro-3-metilbutino por cinco diferentes alcinos. Este novo processo ofereceu como vantagens principais o menor custo dos catalisadores empregados, os rendimentos melhorados e o reduzido número de etapas reacionais em relação as rotas descritas na literatura para obtenção de?-xiloidona. O Capítulo II apresenta o desenvolvimento de métodos sintéticos novos e eficazes para 3 núcleos heterocíclicos (naftiridinona, pirazolopiridinona e dihidropirrolopirazinona) pouco explorados pela química medicinal porém com potencial para descoberta de fármacos. Buscando abranger metodologias orientadas pela diversidade, neste capítulo foi realizado um estudo preliminar de reatividade destes núcleos frente diferentes abordagens, tanto frente métodos diretos de arilação quanto metodologias clássicas de modificação de anéis aromáticos. Além disso, no capítulo III foram realizados estudos de similaridade para a obtenção de padrões estruturais que possam ser aplicados em programas de descoberta de fármacos assim como o estudo de propriedades físico-químicas dos núcleos do capítulo II. Todo este trabalho permitiu desenvolver 10 moléculas inéditas na literatura, bem como novas metodologias para a síntese de compostos previamente descritos. / The present work is divided in two chapters: Chapter I - New synthesis of ? - xiloidone: Claisen rearrangement of hydroxynaphthoquinones; Chapter II - Synthesis and reactivity study of promising heteroaromatic coresunderstudied by medicinal chemistry; Chapter III - Similarity and physic-chemical properties analysis of the heterocyclic cores from chapter II. Chapter I describes a newsynthetic route to?- xiloidona, which isa natural product related to lapachol and understudied by medicinal chemistry. This route is based on propargyl Claisen rearrangement from the reaction of lawsone and 3-chloro-3- methylbutynemediated by CuCl2/I2. This chapter also describes the synthesis of a furan derivative which can be used as?- dunnione precursor. Also this methodology had been applied replacing the 3-chloro- 3-methyllbutynefor five different alkynes. This new process is associated with lower cost, improved yields and reduced number of reaction steps when compared to the literature. The chapter II aimed at the development of synthetic methods to obtain 3 heterocyclic cores(naphthyridinone, pyrazolopyridinoneand dihydropyrrolopyrazinone)with drug discovery potential but also understudied by medicinal chemistry. Diversity-oriented methodologies had been performedresulting in a reactivity study of these cores across severalsynthetic approaches. Furthermore, the chapter III described the similarity studies that were conducted aiming to obtain structural patterns that can be applied in drug discovery programs. This work describes the development of 10 non-published molecules as well as new methodologies for the synthesis of these previously described compounds.

O tratamento padrão para pacientes com câncer de reto localmente avançado consiste no uso de quimioradioterapia neoadjuvante (QRTn), seguida por cirurgia. Uma fração significativa dos pacientes responde completamente ao tratamento e no momento da reavaliação não apresenta evidência clínica nem radiológica de doença. Uma abordagem alternativa, Watch and Wait, propõe não operar imediatamente esses pacientes e submetê-los a um protocolo de observação frequente, a fim de evitar as morbidades associadas à cirurgia. No entanto, a avaliação da resposta ao tratamento ainda é um desafio, devido à subjetividade da avaliação clínica e a ausência de exames radiológicos suficientemente sensíveis e específicos para garantir a ausência de células tumorais residuais ou capazes de detectar a recorrência precoce da doença. DNA circulante contendo alterações genéticas específicas do tumor (ctDNA) pode ser encontrado na fração livre de células do sangue e tem sido utilizado para monitorar a dinâmica tumoral em tumores sólidos. Avanços recentes das tecnologias de sequenciamento permitem a identificação eficiente e rápida e a um custo relativamente baixo de alterações genéticas em tumores individuais, superando o problema imposto pela ausência de alterações genéticas recorrentes nesses tumores. Essas alterações podem ser utilizadas como biomarcadores personalizados para monitorar a resposta ao tratamento, detectar doença residual e a recidiva precoce do tumor. O objetivo deste trabalho foi identificar e estudar biomarcadores personalizados em pacientes com câncer de reto localmente avançado tratados com QRTn e avaliar a capacidade desses biomarcadores para monitorar a dinâmica tumoral, e auxiliar na definição da conduta cirúrgica e na detecção da recidiva precoce da doença. Biópsias de seis pacientes com adenocarcinoma de reto distal (cT2- 3N0-1M0), foram coletadas prospectivamente pré-tratamento. O DNA genômico extraído a partir das biópsias foi usado para construir bibliotecas tipo mate-pair para o sequenciamento do genoma completo, utilizando a plataforma SOLiD. Rearranjos inter e intracromossômicos foram identificados utilizando programas computacionais desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa e em seguida foram validados utilizando PCR e sequenciamento Sanger. Foram validadas, pelo menos, três variações estruturais para cada paciente. Amostras de plasma foram coletadas no momento do diagnóstico, depois da QRTn e durante o seguimento. DNA circulante total foi extraído a partir das amostras de plasma e ensaios personalizados foram desenvolvidos para monitorar a presença de variações estruturais através de PCR Digital. ctDNA foi detectado em todas amostras de plasma pré-tratamento de pacientes com tumores T3. A detecção desses biomarcadores apresentou boa correlação com a resposta ao tratamento, no entanto, esta abordagem não foi sensível o suficiente para detectar doença residual. Para dois pacientes que desenvolveram doença metastática foi verificado um aumento nos níveis de ctDNA com pelo menos 36 semanas antes do diagnóstico clínico de doença metastática, sendo possível correlacionar os níveis de ctDNA detectados em coletas subsequentes com a resposta ao tratamento sistêmico de segunda linha. Este estudo, embora de caráter exploratório, gerou dados relevantes e suficientes para justificar a realização de estudos adicionais para avaliar a aplicação dos biomarcadores personalizados na definição da conduta cirúrgica e no acompanhamento de pacientes com câncer de reto tratados com QRTn. / The standard treatment for patients with locally advanced rectal cancer comprises in neoadjuvant chemo radiotherapy (nCRT), followed by surgery. A significant fraction of these patients show complete response to the treatment and at the time of reassessment, there are no clinical and nor radiological evidence of residual tumor. An alternative approach, Watch and Wait, proposes not to immediately operate these patients, but to submit them to a protocol of frequent observation in order to avoid the morbidities associated with radical surgery. However, assessment of treatment response remains a significant challenge due to the subjectivity of the clinical examination and to the lack of sufficiently sensitive tools to ensure the absence of tumor cells or to detect early disease recurrence. Circulating DNA carrying tumor-specific genetic alterations (circulating tumor DNA - ctDNA) can be found in the cell-free fraction of the blood and has been successfully used to monitor the tumor dynamics in solid tumors. Recent advances in sequencing technologies have enabled the rapid and cost effective identification of genetic alterations in individual tumors, overcoming the problem imposed by the absence of recurrent genetic alterations in these tumors. These alterations can be used as personalized biomarkers to monitor treatment response, detect residual disease and early tumor recurrence. The purpose of this work was to identify and validate the use of personalized biomarkers for patients with locally advanced rectal cancer treated with nCRT and to evaluate the ability of these biomarkers to monitor the tumor dynamics, to define surgical approach and to detect early recurrence of the disease. Pre-treatment biopsies from 6 patients with cT2-3N0-1M0 distal rectal adenocarcinoma were prospectively collected. Genomic DNA extracted from the biopsies was used to construct mate-pair libraries for whole genome sequencing using SOLiD platform. Inter and intrachromosomal rearrangements were identified using an in-house bioinformatics pipeline and validated using PCR amplification and Sanger sequencing. At least three structural variations were validated for each patient. Plasma samples were collect at diagnosis, after nCRT and follow-up. Circulating DNA was obtained from the plasma samples and personalized assays were designed to monitor the presence of structural variations using Droplet Digital PCR. ctDNA was detected in all pre-treatment plasma samples for patients with T3 tumors. The detection of these biomarkers showed a good correlation with the treatment response, nonetheless, the approach was not sensitive enough to detect residual disease. In two patients who developed metastatic disease, an increase in ctDNA levels was observed at least 36 weeks before clinical detection of metastatic disease, and it was possible to correlate the level of ctDNA in subsequent plasma samples with response to the second-line treatment. This study, although exploratory, generated relevant and sufficient data to support additional studies to evaluate the use of personalized biomarkers in the surgical management and follow-up of rectal cancer patients treated with nCRT.