É conhecido que o sistema colinérgico, via receptor nicotínico a7, atua como atenuador do processo inflamatório. O lítio é utilizado no tratamento do transtorno afetivo bipolar e, em microdoses, foi benéfico para o tratamento da doença de Alzheimer. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento crônico com microdoses de lítio para a formação de mediadores inflamatórios em cérebros de camundongos jovens, após injeção intraperitoneal de LPS, e se os receptores a7 estavam envolvidos nesse processo. Após sete meses de tratamento, foi observado que o grupo lítio-LPS apresentou formação da memória espacial, diferentemente do grupo água-LPS. Oito dias após a injeção de LPS, os níveis de IL-6, TNF-a, IL-10 e pGSK-3b/GSK-3b estavam iguais em todos os grupos, evidenciando que o processo inflamatório já estava terminado. Além disso, não houve diferença com relação à densidade de CAT e a7. Não foi possível comprovar ou excluir o efeito anti-inflamatório das microdoses de lítio. Portanto, o desenho experimental deverá ser ajustado. / It is known that the cholinergic system, via a7 nicotinic receptors, acts as attenuator of the inflammatory process. Lithium is used in the treatment of bipolar disorder and microdosing was beneficial for the treatment of Alzheimer\'s disease. The aim of this study was to evaluate the effects of chronic treatment with lithium microdoses for the formation of inflammatory mediators in the brain of young mice after intraperitoneal injection of LPS, and if a7 receptors were involved in this process. After seven months of treatment, animals treated with lithium-LPS presented spatial memory, while water-LPS animals did not. Eight days after the induction of acute inflammation levels of IL-6, TNF-a, IL-10 and pGSK-3b/GSK-3b were the same in all groups, indicating that the inflammatory process had been completed. Still, there was no difference with respect to the density of CAT and a7. It was not possible to confirm or exclude the anti-inflammatory effect of microdoses of lithium. So, the experimental design will be adjusted.

O sistema colinérgico muscarínico desempenha uma função central na memória, mas o papel de cada subtipo de receptor é pouco compreendido separadamente. As toxinas muscarínica (MTs) extraídas da peçonha das serpentes Dendroaspis sp são ferramentas farmacológicas seletivas aos diferentes subtipos de receptores muscarínicos. O subsistema M4 muscarínico modula os processos de consolidação e evocação. Recentemente, tem se dado atenção aos processos subseqüentes à evocação e vários trabalhos demonstraram que a reconsolidação e a extinção da memória compreendem etapas importantes na formação do processo. O objetivo desse trabalho é investigar o envolvimento do subsistema M4 colinérgico muscarínico hipocampal na consolidação, evocação, reconsolidação e extinção da memória, além de investigar os receptores M4 da amígdala basolateral na consolidação e reconsolidação. Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que os receptores M4 mudavam seu papel modulatório entre a consolidação e evocação, portanto, neste trabalho investigamos, também, em que momento do processo de consolidação ocorre essa mudança e se essa alteração é dependente de transcrição gênica. A toxina MT3, antagonista seletiva ao receptor M4, e a escopolamina, antagonista inespecífico, foram as ferramentas farmacológicas utilizadas e seus efeitos foram estudados na tarefa de condicionamento aversivo contextual (CAC) e esquiva inibitória (EI). Quando infundidos no hipocampo antes do treino CAC, ambos os fármacos foram amnésicos sobre a consolidação, entretanto, somente MT3 foi efetiva quando infundida antes do teste, sendo o efeito oposto, facilitatório. Além disso, somente a MT3 intra-hipocampal foi facilitatória sobre a reconsolidação e bloqueou a extinção da tarefa de CAC. Infundidas na amígdala basolateral os antagonistas foram amnésicos sobre a consolidação e a reconsolidação de CAC. Os experimentos com a esquiva inibitória demonstraram que a MT3 intra-hipocampal é amnésica somente quando infundida imediatamente após o treino. Porém, modifica seu efeito quando administrada 90 e 180 minutos após o treino, passando a ser facilitatória. A administração de um inibidor de transcrição gênica (DRB) imediatamente após o treino de EI reverte o efeito facilitatório da MT3 pré-teste. Os resultados sugerem uma modulação positiva do sistema colinérgico muscarínico hipocampal durante a consolidação e a extinção da memória de CAC, porém, uma ação contrária é observada durante a evocação e reconsolidação. Os resultados em conjunto sugerem que os receptores M4 hipocampais sofram alterações plásticas durante o processo de consolidação passando a controlar negativamente a atividade excitatória dos neurônios glutamatérgicos, fenômeno que parece não ocorrer na amígdala basolateral. / The cholinergic muscarinic system plays a central role in learning and memory, yet little is known about the specific roles of each receptor subtype. Muscarinic toxins (MTs) from Dendroaspis snakes venom are selective for muscarinic receptor subtypes. The hippocampus M4 subsystem, for instance, was shown to take part in the modulation of memory consolidation and retrieval. The memory phenomenon, by its turn, is being recently unveiled as a much more complex set of processes than previously thought, encompassing post-retrieval situations such as reconsolidation and extinction, each with its particular mechanisms. The scope of this study is to explore the involvement of the hippocampal cholinergic M4 muscarinic subsystem on the consolidation, retrieval, reconsolidation and extinction of memories, moreover to investigate the role of M4 subsystem of basoalteral amygdala on the consolidation and reconsolidation. Last works shown a different modulatory role of hippocampal M4 receptors about consolidation and retrieval processes, therefore This work aims to investigate the muscarinic cholinergic modulation at hippocampal circuits by M4 receptors, along different periods of memory consolidation for an inhibitory avoidance task, and verify if the change effect of pre-test MT3 are dependent of mRNA synthesis. MT3, a very selective M4 antagonist, and the less selective antagonist scopolamine were infused bilaterally into the rat CA1 area, and their effects studied in a contextual fear conditioning task (CFC) and inhibitory avoidance task (IA). When infused immediately after training, both treatments caused disruption of the memory consolidation, however, only MT3 was effective when infused before the test session, and the effect, was the opposite, i.e., memory facilitation. Moreover, only MT3 enhanced the reconsolidation of CFC following its infusion into the hippocampus or blocked its extinction. Infused into the basolateral amygdala, muscarínic antagonists shown an amnestic effect about the consolidation and reconsolidation of CFC memory. In the IA experiments, MT3 infused immediately after training was amnestic upon the consolidation process, while an “opposite effect” –memory facilitation– was observed in the 90-180min time window. The DRB was amnestic too upon the consolidation, showing that the transcriptional process is essential to the memory. Moreover, the DRB reverted the facilitatory effect of pre-test MT3. These results suggest an endogenous positive modulation of the cholinergic muscarinic system present during the consolidation or the extinction of an aversive memory, but an opposite action during memory retrieval or memory reconsolidation. Moreover, these results suggest that M4 receptors are likely expressed at different hippocampal localizations where they underlie different processes and plasticity events, may be over expressed upon glutamatergic excitatory cells.

A cafeína é a substância psicoestimulante mais consumida no mundo todo. Muitos estudos já foram realizados avaliando os seus benefícios sobre as funções cognitivas. Algumas evidências sugerem a participação do sistema colinérgico nos efeitos da cafeína, mas os estudos ainda são incipientes. O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos da administração aguda de cafeína frente ao bloqueio dos receptores colinérgicos muscarínicos pela administração do antagonista não-seletivo escopolamina. Camundongos adultos machos receberam cafeína (10 mg/kg, i.p.) uma vez ao dia durante 4 dias. No quinto dia, a escopolamina (2 mg/kg, i.p.) foi administrada imediatamente após a sessão de treino na tarefa de reconhecimento de objetos. Na tarefa de esquiva inibitória a escopolamina foi administrada 15 minutos antes ou imediatamente após a sessão de treino para avaliar aquisição e consolidação da memória. Na tarefa de reconhecimento de objetos, a cafeína preveniu o comprometimento da memória de reconhecimento pela administração pós-treino de escopolamina. A cafeína também foi efetiva em prevenir o comprometimento da consolidação da memória de curta e longa duração pela administração póstreino de escopolamina. Entretanto, a cafeína só foi efetiva em prevenir o comprometimento da memória pela administração pré-treino da escopolamina quando o teste foi realizado 90 minutos após o treino (memória de curta duração). Esses resultados sugerem que os efeitos preventivos da cafeína observados em modelos de déficit mnemônico podem envolver a participação do sistema colinérgico. / Caffeine is the psychostimulant most consumed worldwide. Many studies have been performed evaluating its benefits on the cognitive functions. There is evidence to suggest the participation of cholinergic system on the effects of caffeine, but studies are still incipient. The aim of this study was to investigate the effects of acute administration of caffeine on memory impairment by the blockade of muscarinic cholinergic receptors. Adult male mice received caffeine (10 mg/kg, i.p.) once daily during 4 consecutive days. On the fifth day, the non selective antagonist for muscarinic receptors, scopolamine (2 mg/kg, i.p.) was administered immediately after training session on the novel object recognition task. In the inhibitory avoidance task, scopolamine was administered 15 minute s prior to or immediately after training session to evaluate acquisition and consolidation of memory. In the novel object recognition task caffeine was effective in preventing the impairment of short- and long-term memory consolidation by post training administration of scopolamine. In the inhibitory avoidance task, caffeine was effective in preventing short-term memory impairment by administration of scopolamine prior to training. When scopolamine was administered after training, caffeine was able to prevent both short- e long-term memory impairments. These results suggest that the preventive effects of caffeine against mnemonic deficits may involve participation of the cholinergic system.

Apesar de representarem cerca de 50% de todas as células do encéfalo humano, as células da glia foram negligenciadas pela Doutrina do Neurônio, no início do século XX, por não serem excitáveis e por não se comunicarem como os neurônios. Durante um longo período, os estudos sobre os astrócitos se restringiam a suas funções de suporte do SNC. Atualmente se sabe que os astrócitos expressam receptores para uma variedade de neurotransmissores, como por exemplo, receptores colinérgicos nicotínicos, sugerindo possíveis mecanismos de resposta aos sinais enviados pela atividade neuronal, de modo variável e dinâmico, espontaneamente ou dependente da atividade neuronal e ativado pela alteração dos níveis intracelulares de Ca2+. Entretanto, os mecanismos específicos que explicam como essas células podem ser ativadas e qual sua contribuição para funcionamento do SNC ainda não estão totalmente esclarecidos. A secreção da proteína trófica S100B pelo astrócito pode ser um exemplo de comunicação celular, bem como também marcador biológico para diversas doenças. O nosso grupo já mostrou o envolvimento de diversos sistemas neuronais na modulação da secreção da proteína S100B. Um outro exemplo de comunicação é a liberação de gliotransmissores e a influência aguda astrocítica na transmissão sináptica. O objetivo dessa tese foi investigar se ativação do sistema colinérgico modula a secreção da proteína S100B em culturas primárias de astrócitos. Ainda, investigamos o uso da optogenética para o estudo da gliotransmissão em fatias de hipocampo. As culturas foram tratadas com inibidores da acetilcolinesterase (huperzina-A e tacrina), agonistas (acetiltiocolina, nicotina e carbacol) e antagonistas (mecamilamina e escopolamina) colinérgicos incubados durante 1 e 24 h. Os estudos em optogenética partiram primeiramente da caracterização do sistema cre/lox através da análise da expressão das proteínas de interesse, seletiva para astrócitos, por imunohistoquímica. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a huperzina-A aumentou a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos, assim como o tratamento com nicotina; no segundo, discutiu-se as limitações metodológicas quanto a especificidade das proteínas e alteração da fisiologia dos astrócitos. Os resultados obtidos nessa tese ressaltam para a importância do conhecimento da fisiologia do astrócito, contribuindo para o entendimento de um possível mecanismo de ativação colinérgico dos astrócitos em promover secreção de S100B. Também é preciso ressaltar a relevância de novas metodologias que ajudam a descrever melhor o papel dos astrócitos na atividade sináptica. / Although about half of the brain cells are glial cells, the Neuron Doctrine has neglected them, at the beginning of 20th century, because they were not excitable and also, they were unable to communicate as neurons. For a long time, the studies about astrocytes functions were limited to trophic and metabolic support to neurons by which providing for the homeostasis of the nervous system. A variety of studies have been shown the expression of different neurotransmitters receptors in astrocytes, for instance, nicotinic receptors, suggesting the possibility of astrocytic response to neuronal activity. This response is variable and dynamic and mostly can be activated by changes at the intracellular calcium levels. However, the specific mechanisms of astrocytic Ca2+ excitability and how this process could contribute to CNS functioning are still unclear. The S100B secretion could be an example of cellular communication, as well as biomarker for diverse diseases. S100B is calcium binding protein, produced and secreted mainly by astrocytes. Our group has already demonstrated the relevance of various neuronal systems mediating the S100B secretion. Another astrocytic form of communication could be the release of gliotransmitters and the acute influence at synaptic transmission. The aim of this thesis was to investigate whether cholinergic system activation could modulate S100B secretion in primary astrocytes cultures. Moreover, we investigated the optogenetic properties as a tool for gliotransmission studies in hippocampal slices. The astrocytes cultures were treated with acetylcolinesterase inhibitors (huperzine-A and tacrine), agonists (acetylthiocholine, nicotine and carbachol) and antagonists (mecamylamine and scopolamine) for 1 and 24h. The optogenetic studies were conducted, firstly, from the cre/lox characterization of protein expression, selectively for astrocytes, by immunohistochemistry. The first study results showed that huperzine-A increased S100B secretion, as well as nicotine; in the second study, we have discussed the main methodological limitations concerning the protein specificity and astrocytes physiology changes. These results raise the importance of astrocytes functions investigations, especially S100B secretion, contributing for the first time to the understanding of astrocytes excitability likely trough nicotinic system activation. In addition, it is worthy to note that new methodologies are relevant and can help us in a better description of astrocytes role during synaptic activity and brain functioning.

Uma das principais dificuldades enfrentadas na dependência à cocaína está relacionada aos sintomas de abstinência, como ansiedade, desejo e irritabilidade. Estes efeitos podem durar meses ou anos após a interrupção do consumo prolongado, fazendo com que o indivíduo volte a procurá-la. Os efeitos recompensadores da cocaína levam a alterações neurobiológicas do sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, que se origina na área tegmental ventral e se projeta para o núcleo accumbens, e córtex pré-frontal, áreas intimamente ligadas ao desenvolvimento da dependência. Esses neurônios dopaminérgicos recebem estímulos dos neurônios colinérgicos que contribuem para os aspectos cognitivos da dependência. Devido à complexidade neurobilógica envolvida durante a abstinência, pouco se sabe sobre as alterações no sistema colinérgico muscarínico durante este período no encéfalo, objetivo deste estudo. Para tal, camundongos machos adultos Swiss-Webster foram submetidos à cocaína em padrão agudo em binge (3×30 mg/kg/dia) e cronicamente por escalonamento de dose em binge por 14 dias (3×15 mg/kg/dia nos dias 1-4; 3×20 mg/kg/dia nos dias 5-8; 3×25 mg/kg/dia nos dias 9-12; e 3×30 mg/kg/dia nos dias 13 e 14). A atividade locomotora de cada animal foi avaliada em campo aberto (CA), onde permaneceram no aparato por 60 minutos entre cada administração. Após o período de exposição os animais permaneceram 14 dias em abstinência, a fim de avaliar a ansiedade no labirinto em cruz elevado (LCE). Em seguida os animais foram eutaniasiados, sendo o córtex pré-frontal (CPF), o estriado e o hipocampo dissecados e armazenados a -80ºC para a análise dos receptores dopaminérgicos D1 e D2, receptores colinérgicos muscarínicos M1, M2, M3, M4 e M5 (mAChRs) e moléculas colinérgicas (acetilcolinesterase, AChE; colina acetiltransferase, ChAT e transportador vesicular de acetilcolina, VAChT) por Western Blotting (n=6). Os resultados comportamentais mostraram maior atividade locomotora nos animais tratados com cocaína no tratamento agudo ou crônico, quando comparado ao basal. Mais ainda, a sensibilização comportamental foi detectada a partir do segundo dia de administração de cocaína. No teste de LCE, realizado 14 dias após a interrupção da administração de cocaína, não foi observada diferença estatística entre os animais previamente expostos à cocaína e grupo controle. No CPF observou-se diminuição de D2R, M1 mAChRs e aumento M2 e M4 mAChRs no tratamento agudo; no tratamento crônico houve diminuição de M1 e M5 mAChRs e ChAT. No estriado observou-se aumento de D1R, M1 e M2 mAChRs, ChAT no tratamento agudo; e aumento D1R, VAChT, ChAT e diminuição D2R, M1 e M2 mAChRs no tratamento crônico. Já no hipocampo observou-se aumento de D1R, D2R, M2 mAChRs, VAChT e diminuição M1 mAChRs no tratamento agudo; e aumento de D1R, VAChT e diminuição D2R, M1 mAChRs no tratamento crônico. Nossos resultados mostram envolvimento de processo de neuroplasticidade, tanto no sistema dopaminérgico quanto no colinérgico muscarínico, em ambos os protocolos utilizados, mesmo após 14 dias de abstinência. / Una de las dificultades enfrentadas en la dependencia de cocaína son los síntomas de abstinencia, como ansiedad, deseo y irritabilidad. Estos efectos pueden durar meses o años después de la interrupción del consumo prolongado, haciendo que el individuo vuelva a consumirlo. Los efectos recompensadores de la cocaína causa alteraciones neurobiológicas del sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, que se origina en el área tegmental ventral y se proyecta hacia el núcleo accumbens y córtex pré-frontal, áreas íntimamente ligadas al desenvolvimiento de la dependencia. Esas neuronas dopaminérgicas reciben estímulos de neuronas colinérgicas la cual contribuyen para los aspectos cognitivos de la dependencia. Debido a la complejidad neurobiológica involucrada durante la abstinencia, poco se sabe sobre las alteraciones del sistema colinérgico muscarínico durante este periodo en el encéfalo, objetivo de este estudio. Por tanto, ratones adultos macho Swiss-Webster fueron sometidos a cocaína en dosis padrón agudo en binge (3×30 mg/kg/día) y crónicamente por escalonamiento de dosis en binge por 14 días (3×15 mg/kg/día en los días 1-4; 3×20 mg/kg/día en los días 5-8; 3×25 mg/kg/día en los días 9-12; y 3×30 mg/kg/día en los días 13 e 14). La actividad locomotora de cada animal fue evaluada en el test de campo abierto (CA), donde permanecieron por 60 minutos entre cada administración. Después del periodo de exposición los animales permanecieron 14 días de abstinencia, a fin de evaluar la ansiedad en el labirinto de cruz elevado (LCE). En seguida los animales fueron eutanasiados, donde el córtex pré-frontal (CPF), estriado y hipocampo fueron disecados y almacenados a -80ºC para analizar los receptores dopaminérgicos D1 e D2, receptores colinérgicos muscarínicos M1, M2, M3, M4 y M5 (mAChRs) y moléculas colinérgicas (acetilcolinesterasa, AChE; colina acetiltransferasa, ChAT y transportador vesicular de acetilcolina, VAChT) por Western Blotting (n=6). Los resultados comportamentales mostraron mayor actividad locomotora en los animales tratados con cocaína en tratamiento agudo y crónico, comparado al control. Por otra parte, la sensibilización comportamental fue detectado a partir de segundo día de administración de cocaína. En la prueba de LCE, realizado después de 14 días de interrupción de la administración de cocaína, no fue observado diferencia estadística entre los animales previamente expuestos a la cocaína y el grupo control. En CPF se observó disminución de D2R, M1 mAChRs y aumento de M2 y M4 mAChRs en tratamiento agudo; en el tratamiento crónico mostro disminución de M1 y M5 mAChRs y ChAT. En el estriado se observó aumento de D1R, M1 y M2 mAChRs, ChAT en el tratamiento agudo; aumento D1R, VAChT, ChAT y disminución de D2R, M1 y M2 mAChRs en el tratamiento crónico. Por último, en el hipocampo se observó aumento de D1R, D2R, M2 mAChRs, VAChT y disminución M1 mAChRs en el tratamiento agudo; aumento de D1R, VAChT y disminución D2R, M1 mAChRs en el tratamiento crónico. Nuestros resultados muestran envolvimiento de procesos de neuroplasticidad, tanto en el sistema dopaminérgico como el sistema colinérgico muscarínico, en ambos protocolos utilizados, después de 14 días de abstinencia.

Uma das principais dificuldades enfrentadas na dependência à cocaína está relacionada aos sintomas de abstinência, como ansiedade, desejo e irritabilidade. Estes efeitos podem durar meses ou anos após a interrupção do consumo prolongado, fazendo com que o indivíduo volte a procurá-la. Os efeitos recompensadores da cocaína levam a alterações neurobiológicas do sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, que se origina na área tegmental ventral e se projeta para o núcleo accumbens, e córtex pré-frontal, áreas intimamente ligadas ao desenvolvimento da dependência. Esses neurônios dopaminérgicos recebem estímulos dos neurônios colinérgicos que contribuem para os aspectos cognitivos da dependência. Devido à complexidade neurobilógica envolvida durante a abstinência, pouco se sabe sobre as alterações no sistema colinérgico muscarínico durante este período no encéfalo, objetivo deste estudo. Para tal, camundongos machos adultos Swiss-Webster foram submetidos à cocaína em padrão agudo em binge (3×30 mg/kg/dia) e cronicamente por escalonamento de dose em binge por 14 dias (3×15 mg/kg/dia nos dias 1-4; 3×20 mg/kg/dia nos dias 5-8; 3×25 mg/kg/dia nos dias 9-12; e 3×30 mg/kg/dia nos dias 13 e 14). A atividade locomotora de cada animal foi avaliada em campo aberto (CA), onde permaneceram no aparato por 60 minutos entre cada administração. Após o período de exposição os animais permaneceram 14 dias em abstinência, a fim de avaliar a ansiedade no labirinto em cruz elevado (LCE). Em seguida os animais foram eutaniasiados, sendo o córtex pré-frontal (CPF), o estriado e o hipocampo dissecados e armazenados a -80ºC para a análise dos receptores dopaminérgicos D1 e D2, receptores colinérgicos muscarínicos M1, M2, M3, M4 e M5 (mAChRs) e moléculas colinérgicas (acetilcolinesterase, AChE; colina acetiltransferase, ChAT e transportador vesicular de acetilcolina, VAChT) por Western Blotting (n=6). Os resultados comportamentais mostraram maior atividade locomotora nos animais tratados com cocaína no tratamento agudo ou crônico, quando comparado ao basal. Mais ainda, a sensibilização comportamental foi detectada a partir do segundo dia de administração de cocaína. No teste de LCE, realizado 14 dias após a interrupção da administração de cocaína, não foi observada diferença estatística entre os animais previamente expostos à cocaína e grupo controle. No CPF observou-se diminuição de D2R, M1 mAChRs e aumento M2 e M4 mAChRs no tratamento agudo; no tratamento crônico houve diminuição de M1 e M5 mAChRs e ChAT. No estriado observou-se aumento de D1R, M1 e M2 mAChRs, ChAT no tratamento agudo; e aumento D1R, VAChT, ChAT e diminuição D2R, M1 e M2 mAChRs no tratamento crônico. Já no hipocampo observou-se aumento de D1R, D2R, M2 mAChRs, VAChT e diminuição M1 mAChRs no tratamento agudo; e aumento de D1R, VAChT e diminuição D2R, M1 mAChRs no tratamento crônico. Nossos resultados mostram envolvimento de processo de neuroplasticidade, tanto no sistema dopaminérgico quanto no colinérgico muscarínico, em ambos os protocolos utilizados, mesmo após 14 dias de abstinência. / Una de las dificultades enfrentadas en la dependencia de cocaína son los síntomas de abstinencia, como ansiedad, deseo y irritabilidad. Estos efectos pueden durar meses o años después de la interrupción del consumo prolongado, haciendo que el individuo vuelva a consumirlo. Los efectos recompensadores de la cocaína causa alteraciones neurobiológicas del sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, que se origina en el área tegmental ventral y se proyecta hacia el núcleo accumbens y córtex pré-frontal, áreas íntimamente ligadas al desenvolvimiento de la dependencia. Esas neuronas dopaminérgicas reciben estímulos de neuronas colinérgicas la cual contribuyen para los aspectos cognitivos de la dependencia. Debido a la complejidad neurobiológica involucrada durante la abstinencia, poco se sabe sobre las alteraciones del sistema colinérgico muscarínico durante este periodo en el encéfalo, objetivo de este estudio. Por tanto, ratones adultos macho Swiss-Webster fueron sometidos a cocaína en dosis padrón agudo en binge (3×30 mg/kg/día) y crónicamente por escalonamiento de dosis en binge por 14 días (3×15 mg/kg/día en los días 1-4; 3×20 mg/kg/día en los días 5-8; 3×25 mg/kg/día en los días 9-12; y 3×30 mg/kg/día en los días 13 e 14). La actividad locomotora de cada animal fue evaluada en el test de campo abierto (CA), donde permanecieron por 60 minutos entre cada administración. Después del periodo de exposición los animales permanecieron 14 días de abstinencia, a fin de evaluar la ansiedad en el labirinto de cruz elevado (LCE). En seguida los animales fueron eutanasiados, donde el córtex pré-frontal (CPF), estriado y hipocampo fueron disecados y almacenados a -80ºC para analizar los receptores dopaminérgicos D1 e D2, receptores colinérgicos muscarínicos M1, M2, M3, M4 y M5 (mAChRs) y moléculas colinérgicas (acetilcolinesterasa, AChE; colina acetiltransferasa, ChAT y transportador vesicular de acetilcolina, VAChT) por Western Blotting (n=6). Los resultados comportamentales mostraron mayor actividad locomotora en los animales tratados con cocaína en tratamiento agudo y crónico, comparado al control. Por otra parte, la sensibilización comportamental fue detectado a partir de segundo día de administración de cocaína. En la prueba de LCE, realizado después de 14 días de interrupción de la administración de cocaína, no fue observado diferencia estadística entre los animales previamente expuestos a la cocaína y el grupo control. En CPF se observó disminución de D2R, M1 mAChRs y aumento de M2 y M4 mAChRs en tratamiento agudo; en el tratamiento crónico mostro disminución de M1 y M5 mAChRs y ChAT. En el estriado se observó aumento de D1R, M1 y M2 mAChRs, ChAT en el tratamiento agudo; aumento D1R, VAChT, ChAT y disminución de D2R, M1 y M2 mAChRs en el tratamiento crónico. Por último, en el hipocampo se observó aumento de D1R, D2R, M2 mAChRs, VAChT y disminución M1 mAChRs en el tratamiento agudo; aumento de D1R, VAChT y disminución D2R, M1 mAChRs en el tratamiento crónico. Nuestros resultados muestran envolvimiento de procesos de neuroplasticidad, tanto en el sistema dopaminérgico como el sistema colinérgico muscarínico, en ambos protocolos utilizados, después de 14 días de abstinencia.

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido mundialmente. Sua ação farmacológica consiste em bloquear os receptores de adenosina A1 e A2A. A administração crônica de cafeína previne déficits cognitivos decorrentes da idade e em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Esses efeitos preventivos são também observados pela administração do antagonista seletivo do receptor de adenosina A2A. Nesse trabalho investigou-se a participação dos receptores de adenosina A1 e A2A na prevenção dos déficits cognitivos induzidos por escopolamina. Também foi investigado se a manipulação dos receptores A2A teria algum impacto na memória em camundongos naive. Para isso, foram utilizadas três tarefas comportamentais que avaliaram três tipos de memória: a tarefa de reconhecimento de objetos (RO), a esquiva inibitória (EI) e o labirinto em Y. A administração intraperitoneal de escopolamina (1,0 mg/kg) prejudicou o desempenho da memória de curto prazo nas três tarefas utilizadas. O antagonista de receptores A1 (DPCPX, 1,0 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia induzida por escopolamina no RO e na EI, enquanto o antagonista de receptores A2A (SCH 58261, 0,5 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia em todos os testes. Além disso, ambos os antagonistas não apresentaram efeitos sobre a memória ou a locomoção em animais naive. Também foi observado que a ativação dos receptores A2A, a partir da administração de CGS 21680 (0,1 mg/kg, i.p.) antes da sessão de treino, foi suficiente para provocar prejuízos na memória em animais naive também nas três tarefas, e este efeito foi prevenido por meio da administração de SCH 58261 (0,5 mg/kg, i.p.). Por fim, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de CGS 21680 (50 nmol) também prejudicou o desempenho dos animais na tarefa de RO. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação dos receptores A2A é suficiente para provocar déficits de memória e ainda sugerem que os receptores A1 também participam de maneira seletiva no controle dos déficits de memória relacionados ao sistema colinérgico. / Caffeine, a non-selective adenosine receptor antagonist, prevents memory deficits, an effect mimicked by adenosine A2A receptor (A2AR), but not receptor A1 (A1R), antagonists upon aging and Alzheimer´s disease. We tested if A2AR were also necessary for the memory impairment upon direct perturbation of the cholinergic system with scopolamine and if A2AR activation was sufficient to trigger memory deficits in naive mice using 3 tests, to probe for short-term memory, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The intra-peritoneal (i.p.) administration of scopolamine (1.0 mg/kg) impaired short-term memory performance in 3 tests, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The scopolamine-induced amnesia was prevented by the A2AR (SCH 58261, 0.5 mg/kg, i.p.) as well as by A1R antagonist (DPCPX, 1 mg/kg, i.p.) in all tests, except for the modified Y-maze, and both antagonists were devoid of effects on memory or locomotion in naive rats. Notably, the activation of A2AR with CGS 21680 (0.1 mg/kg, i.p.) before the training session was sufficient to trigger memory impairment in the 3 tests in naive mice, and effect prevented by SCH 58261 (0.5 mg/kg, i.p.). Furthermore, the intracerebroventricular administration of CGS 21680 (50 nmol) also impaired recognition memory in the object recognition task. These results show that A2AR are necessary and sufficient to trigger memory impairment and they further suggest that A1R might also be selectively engaged to control the cholinergic driven memory impairment.

O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo pertencente à família Cyprinidae, o qual vem sendo estudado em diferentes áreas científicas. Essa espécie apresenta genes evolutivamente conservados, diversos sistemas de neurotransmissão já caracterizados e um amplo repertório comportamental , os quais podem ser modulados por diversas drogas. Portanto, a presente tese tem por objetivo estudar parâmetros bioquímicos em peixe-zebra com ênfase nos sistemas de sinalização purinérgico e colinérgico, bem como avaliar o comportamento de animais submetidos à tarefa do open tank e investigar os efeitos promovidos pelo tratamento com taurina no modelo de exposição aguda ao etanol. Nós demonstramos que o tratamento agudo (1h) com taurina nas concentrações de 150 e 400 mg/L aumentou a hidrólise de AMP e levou a uma diminuição significativa na desaminação de adenosina em membranas cerebrais, sendo que o último efeito também foi observado nos ensaios in vitro. Entretanto, não foram observados efeitos sobre a hidrólise dos nucleotídeos tri e difosfatados, promovida pelas NTPDases. Estudos relacionados à hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP em cérebro, fígado e coração de peixe-zebra demonstraram um perfil diferencial nos respectivos tecidos. O efeito distinto promovido por inibidores apontou que diferentes membros das NTPDases poderiam estar contribuindo para a atividade enzimática detectada, o que foi sugerido por estudos de bioinformática e ensaios de expressão gênica. Além disso, verificamos que, no modelo de exposição aguda ao etanol, a taurina foi capaz de prevenir as alterações promovidas pelo álcool sobre a atividade da AChE e das defesas antioxidantes enzimáticas. Contudo, o pré-tratamento com taurina demonstrou ser mais efetivo na prevenção do estresse oxidativo, visto que, diferentemente do co-tratamento, aumentou o conteúdo total de tióis reduzidos cerebral e diminuiu o dano lipídico. A fim de caracterizar o repertório comportamental espaço-temporal dos animais no teste do open tank, nós elaboramos um protocolo que avaliava o efeito do confinamento prévio a estímulos naturalísticos (ambientes claro, escuro e transparente). Os resultados demonstraram que os peixes previamente confinados em um ambiente naturalmente aversivo (claro) apresentaram uma habituação intrasessão mais rápida em comparação aos grupos escuro e transparente, avaliada pelas transições e tempo de permanência na região superior do aparato. O perfil exploratório espaço-temporal foi analisado através de plots representativos, sendo proposto um etograma descritivo para a tarefa do open tank. A partir do repertório comportamental determinado, o efeito promovido pelo pré-tratamento com taurina nas alterações comportamentais induzidas pelo etanol foi investigado. Nossos achados demonstraram que o etanol diminuiu a atividade locomotora dos animais, sendo que as concentrações de taurina testadas (42, 150 e 400 mg/L) preveniram essa modificação. Contudo, o pré-tratamento com 150 mg/L de taurina não preveniu as alterações na exploração da área superior do aparato, sugerindo que diferentes mecanismos poderiam estar envolvidos na resposta comportamental observada. Em suma, nossos resultados possibilitam uma maior compreensão das respostas neuroquímicas e comportamentais em peixe-zebra, contribuindo para novas estratégias relacionadas a estudos translacionais. / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost fish that belongs to the Cyprinidae family, which has been studied in different scientific areas. This species has evolutively conserved genes, several neurotransmitter systems characterized, and a wide behavioral repertoire, which may be modulated by distinct drugs. Thus, this thesis aims to study biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the purinergic and cholinergic signaling, as well as to evaluate the behavior of animals in the open tank task and to investigate the effects of taurine treatment in the acute ethanol exposure model. We showed that acute taurine treatment (1h) at 150 and 400 mg/L increased the AMP hydrolysis and significantly decreased the adenosine deamination in brain membranes. The latter effect was also observed in the enzyme assays performed in vitro. However, the tri and diphosphonucleoside hydrolysis promoted by NTPDases was unaffected by taurine. Studies related to ATP and ADP hydrolysis in zebrafish brain, liver, and heart demonstrated a differential profile in the respective tissues. The distinct effect promoted by inhibitors pointed that different NTPDase members could play a role in the enzyme activity detected, as suggested by bioinformatic analysis and gene expression assays. Moreover, we observed that, in the acute ethanol exposure model, taurine prevents the alterations induced by ethanol in AChE and in enzymatic antioxidant defenses activities. However, taurine pretreatment has shown to be more effective in the prevention of oxidative stress, considering that, differently from the cotreatment, it increased the total reduced thiol content and decreased lipid peroxidation in zebrafish brain. To characterize the spatio-temporal behavioral repertoire of animals subjected to the open tank task, we described a protocol which evaluated the effect promoted by the previous confinement using natural stimuli (bright, dark, and transparent environments). The results showed that fish previously confined into an aversive environment (brightly one) presented a faster intra-session habituation response when compared to dark and transparent groups, evaluated by transitions and time spent in the top area of the tank. The spatio-temporal exploratory profile was assessed by representative plots with the proposal of a descriptive ethogram to the behavioral task. Considering these behaviors, the effect promoted by taurine pretreatment on the behavioral changes induced by ethanol was investigated. Our findings demonstrated that ethanol significantly decreased the locomotor activity and that the taurine concentrations tested (42, 150, and 400 mg/L) prevented this modification. Nevertheless, the pretreatment with 150 mg/L taurine did not prevent the alterations on the exploratory profile for the top area of apparatus, suggesting that different mechanisms could be involved in the behavioral response observed. In conclusion, our data help to a better understanding of the neurochemical and behavioral responses in zebrafish, contributing for new strategies related to translational studies.

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido mundialmente. Sua ação farmacológica consiste em bloquear os receptores de adenosina A1 e A2A. A administração crônica de cafeína previne déficits cognitivos decorrentes da idade e em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Esses efeitos preventivos são também observados pela administração do antagonista seletivo do receptor de adenosina A2A. Nesse trabalho investigou-se a participação dos receptores de adenosina A1 e A2A na prevenção dos déficits cognitivos induzidos por escopolamina. Também foi investigado se a manipulação dos receptores A2A teria algum impacto na memória em camundongos naive. Para isso, foram utilizadas três tarefas comportamentais que avaliaram três tipos de memória: a tarefa de reconhecimento de objetos (RO), a esquiva inibitória (EI) e o labirinto em Y. A administração intraperitoneal de escopolamina (1,0 mg/kg) prejudicou o desempenho da memória de curto prazo nas três tarefas utilizadas. O antagonista de receptores A1 (DPCPX, 1,0 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia induzida por escopolamina no RO e na EI, enquanto o antagonista de receptores A2A (SCH 58261, 0,5 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia em todos os testes. Além disso, ambos os antagonistas não apresentaram efeitos sobre a memória ou a locomoção em animais naive. Também foi observado que a ativação dos receptores A2A, a partir da administração de CGS 21680 (0,1 mg/kg, i.p.) antes da sessão de treino, foi suficiente para provocar prejuízos na memória em animais naive também nas três tarefas, e este efeito foi prevenido por meio da administração de SCH 58261 (0,5 mg/kg, i.p.). Por fim, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de CGS 21680 (50 nmol) também prejudicou o desempenho dos animais na tarefa de RO. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação dos receptores A2A é suficiente para provocar déficits de memória e ainda sugerem que os receptores A1 também participam de maneira seletiva no controle dos déficits de memória relacionados ao sistema colinérgico. / Caffeine, a non-selective adenosine receptor antagonist, prevents memory deficits, an effect mimicked by adenosine A2A receptor (A2AR), but not receptor A1 (A1R), antagonists upon aging and Alzheimer´s disease. We tested if A2AR were also necessary for the memory impairment upon direct perturbation of the cholinergic system with scopolamine and if A2AR activation was sufficient to trigger memory deficits in naive mice using 3 tests, to probe for short-term memory, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The intra-peritoneal (i.p.) administration of scopolamine (1.0 mg/kg) impaired short-term memory performance in 3 tests, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The scopolamine-induced amnesia was prevented by the A2AR (SCH 58261, 0.5 mg/kg, i.p.) as well as by A1R antagonist (DPCPX, 1 mg/kg, i.p.) in all tests, except for the modified Y-maze, and both antagonists were devoid of effects on memory or locomotion in naive rats. Notably, the activation of A2AR with CGS 21680 (0.1 mg/kg, i.p.) before the training session was sufficient to trigger memory impairment in the 3 tests in naive mice, and effect prevented by SCH 58261 (0.5 mg/kg, i.p.). Furthermore, the intracerebroventricular administration of CGS 21680 (50 nmol) also impaired recognition memory in the object recognition task. These results show that A2AR are necessary and sufficient to trigger memory impairment and they further suggest that A1R might also be selectively engaged to control the cholinergic driven memory impairment.

O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo pertencente à família Cyprinidae, o qual vem sendo estudado em diferentes áreas científicas. Essa espécie apresenta genes evolutivamente conservados, diversos sistemas de neurotransmissão já caracterizados e um amplo repertório comportamental , os quais podem ser modulados por diversas drogas. Portanto, a presente tese tem por objetivo estudar parâmetros bioquímicos em peixe-zebra com ênfase nos sistemas de sinalização purinérgico e colinérgico, bem como avaliar o comportamento de animais submetidos à tarefa do open tank e investigar os efeitos promovidos pelo tratamento com taurina no modelo de exposição aguda ao etanol. Nós demonstramos que o tratamento agudo (1h) com taurina nas concentrações de 150 e 400 mg/L aumentou a hidrólise de AMP e levou a uma diminuição significativa na desaminação de adenosina em membranas cerebrais, sendo que o último efeito também foi observado nos ensaios in vitro. Entretanto, não foram observados efeitos sobre a hidrólise dos nucleotídeos tri e difosfatados, promovida pelas NTPDases. Estudos relacionados à hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP em cérebro, fígado e coração de peixe-zebra demonstraram um perfil diferencial nos respectivos tecidos. O efeito distinto promovido por inibidores apontou que diferentes membros das NTPDases poderiam estar contribuindo para a atividade enzimática detectada, o que foi sugerido por estudos de bioinformática e ensaios de expressão gênica. Além disso, verificamos que, no modelo de exposição aguda ao etanol, a taurina foi capaz de prevenir as alterações promovidas pelo álcool sobre a atividade da AChE e das defesas antioxidantes enzimáticas. Contudo, o pré-tratamento com taurina demonstrou ser mais efetivo na prevenção do estresse oxidativo, visto que, diferentemente do co-tratamento, aumentou o conteúdo total de tióis reduzidos cerebral e diminuiu o dano lipídico. A fim de caracterizar o repertório comportamental espaço-temporal dos animais no teste do open tank, nós elaboramos um protocolo que avaliava o efeito do confinamento prévio a estímulos naturalísticos (ambientes claro, escuro e transparente). Os resultados demonstraram que os peixes previamente confinados em um ambiente naturalmente aversivo (claro) apresentaram uma habituação intrasessão mais rápida em comparação aos grupos escuro e transparente, avaliada pelas transições e tempo de permanência na região superior do aparato. O perfil exploratório espaço-temporal foi analisado através de plots representativos, sendo proposto um etograma descritivo para a tarefa do open tank. A partir do repertório comportamental determinado, o efeito promovido pelo pré-tratamento com taurina nas alterações comportamentais induzidas pelo etanol foi investigado. Nossos achados demonstraram que o etanol diminuiu a atividade locomotora dos animais, sendo que as concentrações de taurina testadas (42, 150 e 400 mg/L) preveniram essa modificação. Contudo, o pré-tratamento com 150 mg/L de taurina não preveniu as alterações na exploração da área superior do aparato, sugerindo que diferentes mecanismos poderiam estar envolvidos na resposta comportamental observada. Em suma, nossos resultados possibilitam uma maior compreensão das respostas neuroquímicas e comportamentais em peixe-zebra, contribuindo para novas estratégias relacionadas a estudos translacionais. / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost fish that belongs to the Cyprinidae family, which has been studied in different scientific areas. This species has evolutively conserved genes, several neurotransmitter systems characterized, and a wide behavioral repertoire, which may be modulated by distinct drugs. Thus, this thesis aims to study biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the purinergic and cholinergic signaling, as well as to evaluate the behavior of animals in the open tank task and to investigate the effects of taurine treatment in the acute ethanol exposure model. We showed that acute taurine treatment (1h) at 150 and 400 mg/L increased the AMP hydrolysis and significantly decreased the adenosine deamination in brain membranes. The latter effect was also observed in the enzyme assays performed in vitro. However, the tri and diphosphonucleoside hydrolysis promoted by NTPDases was unaffected by taurine. Studies related to ATP and ADP hydrolysis in zebrafish brain, liver, and heart demonstrated a differential profile in the respective tissues. The distinct effect promoted by inhibitors pointed that different NTPDase members could play a role in the enzyme activity detected, as suggested by bioinformatic analysis and gene expression assays. Moreover, we observed that, in the acute ethanol exposure model, taurine prevents the alterations induced by ethanol in AChE and in enzymatic antioxidant defenses activities. However, taurine pretreatment has shown to be more effective in the prevention of oxidative stress, considering that, differently from the cotreatment, it increased the total reduced thiol content and decreased lipid peroxidation in zebrafish brain. To characterize the spatio-temporal behavioral repertoire of animals subjected to the open tank task, we described a protocol which evaluated the effect promoted by the previous confinement using natural stimuli (bright, dark, and transparent environments). The results showed that fish previously confined into an aversive environment (brightly one) presented a faster intra-session habituation response when compared to dark and transparent groups, evaluated by transitions and time spent in the top area of the tank. The spatio-temporal exploratory profile was assessed by representative plots with the proposal of a descriptive ethogram to the behavioral task. Considering these behaviors, the effect promoted by taurine pretreatment on the behavioral changes induced by ethanol was investigated. Our findings demonstrated that ethanol significantly decreased the locomotor activity and that the taurine concentrations tested (42, 150, and 400 mg/L) prevented this modification. Nevertheless, the pretreatment with 150 mg/L taurine did not prevent the alterations on the exploratory profile for the top area of apparatus, suggesting that different mechanisms could be involved in the behavioral response observed. In conclusion, our data help to a better understanding of the neurochemical and behavioral responses in zebrafish, contributing for new strategies related to translational studies.