Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T13:14:34Z No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina (EPO) é um hormônio produzido, principalmente, pelos rins, que regula a produção de células vermelhas do sangue. Trata-se de uma glicoproteína com 166 aminoácidos, três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilação. Apresenta massa molecular na faixa de 30-34 kDa, sendo aproximadamente 40% correspondente aos glicídeos. A EPO está disponível como agente terapêutico produzido através da tecnologia do DNA recombinante em cultura de células de mamíferos. A EPO humana recombinante (rHuEPO) é usada para o tratamento de anemia associada à insuficiência renal crônica. Devido a relevância médica da rHuEPO, sua produção está sendo nacionalizada através do processo de transferência de tecnologia do Centro de Inmunología Molecular (CIM), de Cuba, para o Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. O controle de qualidade sobre o processo produtivo da rHuEPO e seu produto final é bastante rigoroso. Neste contexto, o mapeamento peptídico é um dos mais importantes ensaios usados no controle em processo da produção de proteínas recombinantes. Este ensaio assegura a integridade da estrutura primária das proteínas ao final das etapas de suas purificações. Sendo assim, o objetivo desta dissertação de mestrado foi definir uma metodologia de mapeamento peptídico da rHuEPO, visando o controle de processo da produção deste biofármaco em Bio-Manguinhos. Previamente, a preparação da rHuEPO fornecida pelo CIM foi avaliada quanto a sua homogeneidade e caracterizadapor eletroforeses em gel de poliacrilamida, cromatografia de fase reversa, cromatofocalização eespectrometria de massa. Para obter os peptídeos da rHuEPO, a hidrólise enzimática desta glicoproteína com a enzima tripsina foi avaliada em diferentes tempos de incubação e com relações enzima/substrato distintas. O fracionamento dos peptídeos foi feito por cromatografia líquida de fase reversa em coluna C18, empregando-se diferentes colunas cromatográficas e gradientes de eluição. As principais frações peptídicas isoladas da cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrometria de massa a fim de comprovar a identidade dos peptídeostrípticos da rHuEPO. A especificidade da metodologia desenvolvida foi avaliada através da comparação dos perfis peptídicos do hidrolisado tríptico da rHuEPO e do quimotripsinogênio A. A hidrólise tríptica usando-se relação enzima/substrato de 1/50 (p/p), concentração de rHuEPO de 1 mg/mL e incubação de 1 hora a 37o C hidrolisou mais de 99% da glicoproteína. As colunas cromatográficas de fase reversa Hi-Pore RP 318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 se mostraram aptas para o fracionamento dos peptídeos trípticos da rHuEPO. Em comparação à metodologia usada no CIM, o tempo de incubação de hidrólise foi reduzido em, pelo menos,2 horas e a duração da corrida cromatográfica para obtenção do mapa peptídico diminuiu em, pelo menos, 1 hora e 42 minutos. Na análise por espectrometria de massa das frações isoladas da cromatografia de fase reversa, seis peptídeos trípticos da rHuEPO foram observados. Tais frações peptídicas foram identificadas como pertencentes à EPO humana pelo programa Mascot Search Results. Dessa forma, ficou estabelecida uma metodologia de mapeamento peptídico especifica, simples e rápida para ser utilizada no controle em processo da produção da rHuEPO em Bio-Manguinhos. / Erythropoietin (EPO) is a hormone produced mainly by the kidney that regulates the production of red blood cells. It is a glycoprotein with 166 amino acids, three N-glycosylation and one O-glycosylation sites. It has a molecular weight in the range of 30-34 kDa, being approximately 40% of its content corresponding to carbohydrates. EPO is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammaliancell culture. The recombinant human EPO (rHuEPO) is used to treat anemia associated with chronic renal disease. Due to rHuEPO medical relevance, its production technology is a subject of transference from the Centro de Inmunología Molecular(CIM), Cuba, to the Instituto de Tecnologia em Imunonobiologicos(Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. The quality control over production process of rHuEPO and its final product is quite rigorous. In this context, peptidemapping is one of the most important tests used in process control of recombinant proteins production. This test ensures the primary structure integrity of a protein after its purification processes. Thus, the objective of this dissertation was to define a methodology for peptide mapping of rHuEPO aiming to be used in the process control of this biopharmaceutical production in Bio-Manguinhos. Previously, the preparation of rHuEPO provided by CIM was characterized by polyacrylamidegel electrophoresis, reversed phase chromatography, chromatofocusing and mass spectrometry. In order to obtain rHuEPO peptides, the enzymatic hydrolysis of this glycoprotein with the enzyme trypsin was assessed at differents incubation times and enzyme/substrate ratio. Peptides fractionation was performed by reverse phase liquid chromatography, using distincts C18 columns and elution gradients. The main peptide fractions from reversed phase chromatography were analyzed by mass spectrometry to confirm the identity of rHuEPO tryptic peptides. The specificity of the developed methodology was evaluated by comparing peptides profiles from rHuEPO and Chymotrypsinogen A tryptic hydrolysates. The tryptic digestion using enzyme/substrate ratio of 1/50 (w/w), substrate concentration of 1 mg/mL and incubation for 1 hour at 37°C hidrolysated more than 99% of the glicoprotein. The reversed phase columns Hi-Pore RP318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 were able to fractionate the rHuEPO tryptic peptides. Compared to the methodology used in CIM, the hydrolysis incubation time was reduced by at least 2 hours and the chromatographic running time to obtain the peptide map was decreased by at least 1 hour and 42 minutes. The mass spectrometry analysis of the fractions isolated from reversed-phase chromatography showed six tryptic peptides of rHuEPO. These peptide fractions were identified as belonging to human EPO by the program Mascot Search Results. Thus it was established an specific, simple and fast peptide mapping methodology to use in process control of rHuEPO in Bio-Manguinhos.

O estudo teve como objetivo avaliar a razão de custo-efetividade, sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde SUS, do tratamento da anemia de pacientes em Terapia Renal Substitutiva. Duas alternativas foram comparadas: um novo medicamento recentemente registrado no Brasil, o Ativador Contínuo de Receptor de Eritropoetina (Continuous Erythropoietin Receptor Activator), CERA, e outro, atualmente disponível no sistema de saúde brasileiro, a Eritropoetina Recombinante Humana - Epo-rHu. Métodos: Um modelo de Markov simulou o curso de uma coorte de pacientes em Terapia Renal Substitutiva tratados com CERA e Epo-rHu por quatro anos. A qualidade de vida associada ao uso dos medicamentos foi estimada de forma indireta, por meio de entrevista qualificada com os profissionais cuidadores, previamente submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local. Foi realizada análise de sensibilidade no modelo proposto através da variação dos parâmetros: dose dos medicamentos, custo das estratégias, taxa de desconto e efetividade utilizados para sua construção. Resultados: A média da qualidade de vida atribuída aos pacientes tratados foi 6,3 para a Epo-rHu, 7,8 para o CERA e 9,3 para os pacientes transplantados. O modelo demonstrou que a estratégia mais custo-efetiva é a terapêutica com a Epo-rHu, com um custo por QALY de R$ 21.052,00. O custo incremental por QALY ganho associado ao CERA foi de R$ 72.974,00. Conclusão: A utilização mensal do medicamento CERA está associada à maior qualidade de vida quando comparada a Epo-rHu. No entanto, a terapia com o novo medicamento não se mostrou mais custo-efetiva frente ao tratamento com Epo-rHu / This study sought to determine the cost-effectiveness of anemia treatment in dialysis patients for Brazilian Public Health System. Two alternatives were compared: a new drug, the Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA, recently registred in Brazil, and another one, provided nowadays by the National Health System, Epo-rHu (Recombinant Human Eythropoietin). Methods: A Markov cohort of dialysis patients treated with CERA and Epo-rHu for four years was used to perform the base case analysis. The model outputs were QALYs and costs. The quality of life associated with each drug was measured by interviews applied to health care professionals. These interviews were previously submitted and approved by the local ethics committee. A sensitivity analysis was applied to the model to test it, varying the values of drugs dosage, costs, discount rate and effectiveness. Results: The average quality of life assigned by health care professionals to the patients treated with Epo-rHu, CERA and to kidney transplant receptors were respectively 6,3, 7,8 and 9,3. The model showed that Epo-rHu treatment was more cost-effective than CERA treatment. The cost-effectiveness ratio of Epo-rHu therapy was R$ 21.052,00. In addition, the cost per QALY gained of CERA therapy was R$ 72.974,00. Conclusion: Anemia treatment with CERA is associated with improvement in quality of life compared to Epo-rHu therapy. However, the new drug is not more cost-effective than the drug provided by the Brazilian Public Health System

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Interleukin 11 (IL-11) is a multifunctional cytokine in the IL-6 type family of long-chain helical cytokines, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells. Recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) produced by DNA technology in Escherichia coli is currently being used worldwide for the prevention of thrombocytopenia and to reduce the need for platelet transfusions after myelosuppressive chemotherapy in patients with nonmyeloid malignancies. A stability-indicating reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the assessment of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 25ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B was acetonitrile with 0.1% TFA, run as follows: time 0 to 0.1 min 40% of B; from 0.1 to 30 min linear up to 65% of B; from 30.01 to 31 min linear down to 40% of B, maintained up to 40 min. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. Chromatographic separation was obtained with a retention time of 27.6 min, and was linear over the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9995). The limits of detection and quantitation were 0.34 and 1.12 μg/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.22% with bias lower than 1.25%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed non-significant differences (p>0.05). The proposed method was applied to the assessment of rhIL-11 and related proteins in biopharmaceutical dosage forms, and the results were correlated to those of a bioassay, showing a higher mean difference of the estimated content/potencies of 2.60% for the RP-LC method, aiming to establish new alternatives to monitor stability, improve quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. / A interleucina 11 (IL-11) é uma citocina multifuncional que pertence a família da interleucina- 6 e estimula a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas. A interleucina-11 humana recombinante (rhIL-11) é produzida pela tecnologia do DNA em Escherichia coli e é usada clinicamente para a prevenção de trombocitopenia grave e redução da necessidade de transfusão de plaquetas após quimioterapia mielossupressiva em pacientes com neoplasias malignas não mielóides. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de rhIL-11 em formulações de produtos farmacêuticos. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 25ºC. A fase móvel A foi constituída de TFA 0,1% e a fase móvel B de acetonitrila com 0,1% TFA, eluídas no seguinte gradiente: 0 0,1 min, 40% de B; 0,1 30 min, 40 65% de B; 30,01 a 31 min, 65 40% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min e detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A eluição cromatográfica foi obtida no tempo de 27,6 min, sendo linear na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9995). Os limites de detecção e quantificação foram 0,34 e 1,12 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,20%, com bias inferior a 1,25%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais não apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p>0,05). O método proposto foi aplicado para a avaliação da potência de rhIL-11 e de proteínas relacionadas em formulações farmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio, observando-se diferenças das médias de conteúdo/potência 2,60% superiores para o método por CL-FR. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide with 84 amino acids and it is the most important peptide regulator for calcium and phosphate ion homeostasis, maintaining bone structure. Recombinant human parathyroid hormone, rhPTH (1-34), produced by DNA technology in Escherichia coli contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH and is currently being used worldwide for the treatment of osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women and men with osteoporosis primary or hypogonadal. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34) in biopharmaceutical formulations. A gradient RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 40 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1 M sodium sulphate buffer, pH 2.3, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.1 M phosphoric acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.7 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention times of 12.2 min, and 13.2 min, and was linear over the concentration range of 1-250 μg/mL (r 2 = 0.9997) and 2-300 μg/mL (r 2 = 0.9993), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.44 and 1.47 μg/mL, respectively, for the RP-LC and 0.79 and 2.63 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.49% and 100.22%, with bias lower than 1.12% and than 0.81%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p< 0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of rhPTH and related proteins in biotechnology-derived products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.64% and 1.31% for the RP-LC and SE-LC related to the in vivo bioassay, and of 0.98% and 0.31% higher, compared to the in vitro cell culture assay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84 aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato, e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH (1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 = 0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e 2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22, com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31% superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Erythropoietin is a endogenous glycoprotein which stimulates the erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of renal anaemia. The chromatographic method for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products was validated in the present work. A size-exclusion liquid chromatography method (SE-LC) was validated using a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7,8 mm I.D.), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M dibasic sodium phosphate and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run isocratically at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained within 30 min and it was linear in the concentration range of 5-150 μg/mL (r2=0.9991). Validation parameters were evaluated such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. The specificity was evaluated by the peak purity of the Recombinant Human Erythropoietin Biological Reference Preparation of European Pharmacopoeia (rhEPO-SBR) storage under stress conditions. The proposed method was applied for the analysis of erythropoietin in pharmaceutical products, evaluating also the dimmers and high-molecular-mass forms. Moreover, was performed the analysis of erythropoietin by reversedphase liquid chromatography (RP-LC), evaluating the sulphoxides and deamidates forms. The correlation with the methods was established, showing mean differences between the estimated potencies of 2.50% lower for the bioassay, and 9.29% higher for the RP-LC, compared with the sizeexclusion liquid chromatography method, with significative correlation, conform calculated for the Pearson s correlation coefficient (r=0,9629 e r=0,9422, respectively). The alternative established represents a contribution towards the reduction or replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / A eritropoietina é uma proteína endógena que estimula a eritropoiese. É clinicamente usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foi validado método cromatográfico por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos, empregando coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7,8 mm I.D.), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel foi composta de fosfato de potássio monobásico 0,001M, fosfato de potássio dibásico 0,008M e cloreto de sódio 0,2M, pH 7,4, eluída isocraticamente, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 30 min, sendo linear na faixa de concentração de 5-150 μg/mL (r2=0,9991). Avaliaram-se os parâmetros de sensibilidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Eritropoietina Humana Recombinante Substância Biológica de Referência da Farmacopéia Européia (rhEPO-SBR) submetida à degradação sob condições forçadas. O método proposto foi utilizado para análise de eritropoietina em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas diméricas e de alta massa molecular. Paralelamente, efetuaram-se análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), determinando-se as formas de sulfóxidos/desamidados. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,50% menores pelo bioensaio, e 9,29% maiores para CL-FR, em relação ao método por cromatografia líquida por exclusão molecular, com correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de pearson (r=0,9629 e r=0,9422, respectivamente). Desse modo, pesquisou-se alternativa no contexto da redução ou substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

O estudo teve como objetivo avaliar a razão de custo-efetividade, sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde SUS, do tratamento da anemia de pacientes em Terapia Renal Substitutiva. Duas alternativas foram comparadas: um novo medicamento recentemente registrado no Brasil, o Ativador Contínuo de Receptor de Eritropoetina (Continuous Erythropoietin Receptor Activator), CERA, e outro, atualmente disponível no sistema de saúde brasileiro, a Eritropoetina Recombinante Humana - Epo-rHu. Métodos: Um modelo de Markov simulou o curso de uma coorte de pacientes em Terapia Renal Substitutiva tratados com CERA e Epo-rHu por quatro anos. A qualidade de vida associada ao uso dos medicamentos foi estimada de forma indireta, por meio de entrevista qualificada com os profissionais cuidadores, previamente submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local. Foi realizada análise de sensibilidade no modelo proposto através da variação dos parâmetros: dose dos medicamentos, custo das estratégias, taxa de desconto e efetividade utilizados para sua construção. Resultados: A média da qualidade de vida atribuída aos pacientes tratados foi 6,3 para a Epo-rHu, 7,8 para o CERA e 9,3 para os pacientes transplantados. O modelo demonstrou que a estratégia mais custo-efetiva é a terapêutica com a Epo-rHu, com um custo por QALY de R$ 21.052,00. O custo incremental por QALY ganho associado ao CERA foi de R$ 72.974,00. Conclusão: A utilização mensal do medicamento CERA está associada à maior qualidade de vida quando comparada a Epo-rHu. No entanto, a terapia com o novo medicamento não se mostrou mais custo-efetiva frente ao tratamento com Epo-rHu / This study sought to determine the cost-effectiveness of anemia treatment in dialysis patients for Brazilian Public Health System. Two alternatives were compared: a new drug, the Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA, recently registred in Brazil, and another one, provided nowadays by the National Health System, Epo-rHu (Recombinant Human Eythropoietin). Methods: A Markov cohort of dialysis patients treated with CERA and Epo-rHu for four years was used to perform the base case analysis. The model outputs were QALYs and costs. The quality of life associated with each drug was measured by interviews applied to health care professionals. These interviews were previously submitted and approved by the local ethics committee. A sensitivity analysis was applied to the model to test it, varying the values of drugs dosage, costs, discount rate and effectiveness. Results: The average quality of life assigned by health care professionals to the patients treated with Epo-rHu, CERA and to kidney transplant receptors were respectively 6,3, 7,8 and 9,3. The model showed that Epo-rHu treatment was more cost-effective than CERA treatment. The cost-effectiveness ratio of Epo-rHu therapy was R$ 21.052,00. In addition, the cost per QALY gained of CERA therapy was R$ 72.974,00. Conclusion: Anemia treatment with CERA is associated with improvement in quality of life compared to Epo-rHu therapy. However, the new drug is not more cost-effective than the drug provided by the Brazilian Public Health System

<p>The main aim of the thesis was to explore the potential of supercritical fluid (SF) techniques in the field of drug delivery. In particular, the relatively recently developed solution-enhanced dispersion by supercritical fluids (SEDS) technology has been employed in the preparation of particles/powders. </p><p>The manufacturing, stability and bioavailability of a dosage form strongly depend on the physicochemical properties of the formulation particles. For example, dry powder inhalation (DPI) for administering drugs to the respiratory tract require particles in a narrow size range (1-5 μm) to be effective. The identification of polymorphs and control of purity are also important issues since the physicochemical properties and therapeutic effects of the alternative forms of a drug may differ substantially. Solvent-based traditional crystallisation processes provide the product that may require further down-stream processing to obtain particles for advanced drug delivery applications. This can result in unwanted changes in the physicochemical properties of the particles and thus affect the performance of the dosage form. SF processing has addressed many of the challenges in particle formation research. Among several SF technologies developed for particle processing over the last decade, the SEDS process with its specially designed co-axial nozzle with mixing chamber has resulted in improved control over the particle formation process. Carbon dioxide (CO₂) was used as the SF, because it has low critical points and is non-toxic, non-flammable and relatively inexpensive. </p><p>The initial part of the thesis concerns the formation of particles of model drugs such as hydrocortisone, budesonide and flunisolide using SEDS technology and the determination of the influence of processing conditions and solvents on particle characteristics such as size, shape and crystal structure. Particles of model drugs of differing shapes in a size range suitable for inhalation delivery were prepared. In the process, two new polymorphic forms of flunisolide were identified. This was the first report of SEDS technology being shown as a polymorph-screening tool. The remainder of the thesis deals with the development of SEDS technology for precipitating therapeutic proteins such as recombinant human growth hormone (hGH) from aqueous solutions. Powders of hGH were precipitated using SEDS without significant changes in the chemical or physical stability of the protein. The addition of sucrose to hGH in the feed solution promoted precipitation and minimised the detrimental effects of the solvent and/or the process on the physical aggregation of the protein. </p><p>In conclusion, this thesis highlights the applicability of the SEDS process in drug delivery research and advances general understanding of the particle formation phenomenon. The SEDS process may also prove to be a potential alternative technology for the precipitation of stable powders of therapeutic proteins.</p>

The main aim of the thesis was to explore the potential of supercritical fluid (SF) techniques in the field of drug delivery. In particular, the relatively recently developed solution-enhanced dispersion by supercritical fluids (SEDS) technology has been employed in the preparation of particles/powders. The manufacturing, stability and bioavailability of a dosage form strongly depend on the physicochemical properties of the formulation particles. For example, dry powder inhalation (DPI) for administering drugs to the respiratory tract require particles in a narrow size range (1-5 μm) to be effective. The identification of polymorphs and control of purity are also important issues since the physicochemical properties and therapeutic effects of the alternative forms of a drug may differ substantially. Solvent-based traditional crystallisation processes provide the product that may require further down-stream processing to obtain particles for advanced drug delivery applications. This can result in unwanted changes in the physicochemical properties of the particles and thus affect the performance of the dosage form. SF processing has addressed many of the challenges in particle formation research. Among several SF technologies developed for particle processing over the last decade, the SEDS process with its specially designed co-axial nozzle with mixing chamber has resulted in improved control over the particle formation process. Carbon dioxide (CO2) was used as the SF, because it has low critical points and is non-toxic, non-flammable and relatively inexpensive. The initial part of the thesis concerns the formation of particles of model drugs such as hydrocortisone, budesonide and flunisolide using SEDS technology and the determination of the influence of processing conditions and solvents on particle characteristics such as size, shape and crystal structure. Particles of model drugs of differing shapes in a size range suitable for inhalation delivery were prepared. In the process, two new polymorphic forms of flunisolide were identified. This was the first report of SEDS technology being shown as a polymorph-screening tool. The remainder of the thesis deals with the development of SEDS technology for precipitating therapeutic proteins such as recombinant human growth hormone (hGH) from aqueous solutions. Powders of hGH were precipitated using SEDS without significant changes in the chemical or physical stability of the protein. The addition of sucrose to hGH in the feed solution promoted precipitation and minimised the detrimental effects of the solvent and/or the process on the physical aggregation of the protein. In conclusion, this thesis highlights the applicability of the SEDS process in drug delivery research and advances general understanding of the particle formation phenomenon. The SEDS process may also prove to be a potential alternative technology for the precipitation of stable powders of therapeutic proteins.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-26T11:51:30Z No. of bitstreams: 1 luciana-de-santos-almeida.pdf: 1492447 bytes, checksum: fb4ac7dc61ce8aa49ecd3124c10c4ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-26T11:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana-de-santos-almeida.pdf: 1492447 bytes, checksum: fb4ac7dc61ce8aa49ecd3124c10c4ec4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A Era da Engenharia Genética ou Biotecnologia Moderna, que teve início nos anos 1970, encontra diversas aplicações em vários segmentos de atividades, dentre eles a saúde e alimentos. Na área de saúde têm -se o destaque para a indústria de biofármacos, que tem tido um crescimento acelerado nos últimos anos, pelo fato desses novos medicamentos serem voltados para a terapêutica de doenças que aflige uma parcela considerável da população mundial. Como exemplo pode-se citar o interferon alfa 2b humano recombinante, que faz parte do Programa de Medicamentos de Dispensação Excepcional do Ministério da Saúde, e está incluído no Protocolo Clínico para Hepatite C. Como forma de atender à demanda da população brasileira quanto às necessidades desse biofármaco, Bio-Manguinhos assinou em 2004 um Contrato de Transferência de Tecnologia como o Centro de Engenharia Genética e Biotecnologia de Cuba (CIGB), com o propósito de nacionalizar a produção do referido medicamento. Este trabalho teve como objetivo realizar uma pesquisa qualitativa para elencar os Requerimentos Fundamentais para Transferência, Registro Sanitário, Estabelecimento e Parâmetros de Estabilidade de Bancos de Células de E. coli que expressa o interferon alfa 2b humano recombinante. Foi elaborado um questionário, que serviu como fonte de coleta de dados, que foi enviado por e-mail a diversas Agências Regulatórias e pesquisadores da academia científica. Esse questionário teve como objetivo elencar os principais testes/requisitos que os Bancos de Células devem apresentar. O índice geral de retorno dos questionários foi igual a 39,3%, sendo que o índice de respostas dos pesquisadores foi igual a 62,5% e das Agências Regulatórias igual a 8,3%. O índice de marcação dos itens ficou em torno de 80% e ficou estabelecido que aqueles itens que tiveram um índice maior que 50% seriam os requerimentos indispensáveis a serem descritos. Não foi possível validar o trabalho pelo índice de retorno dos questionários por parte das Agências Regulatórias. Porém, acredita-se que aquilo que foi descrito pode servir como um passo inicial na elaboração de uma norma específica relativa ao Controle de Banco de Células de procariotos, pois representa a opinião de experientes pesquisadores da comunidade científica. E ainda contribuir nos requisitos específicos que serão futuramente estabelecidos pela ANVISA, relativos ao registro de um produto biogenérico/biossimilar. / The Age of Genetic Engineering and Modern Biotechnology, which began in the 1970s, has had several applications in various business activities, among of which are health and food. In health area the emphasis has been on the biopharmaceutical industry that has had a rapid growth in recent years, because these new drugs are aimed towards the therapy of diseases that afflict a significant part of the world’s population. As an example, it can be mentioned the recombinant human interferon-alpha 2b, which is part of the Drugs of Exceptional Dispensation Program of the Ministry of Health, also is it in the Clinical Protocol for Hepatitis C. In order to meet the demand of the Brazilian population for this drug, in 2004, Bio-Manguinhos signed an Agreement on Technology Transfer with the Center for Genetic and Biotechnology Engineering of Cuba (CIGB), so that this medicine could be produced at national level. This study aimed at doing a qualitative research to list the Fundamental Requirements for Transfer, Registration, Establishment and Stability Parameters of Banks of E. coli Cells expressing recombinant human interferon-alpha 2b. A questionnaire was compiled for data collection. It was sent by e-mail to a number of regulatory agencies and researchers of the scientific academy. This questionnaire aimed at listing the main tests / requirements that banks must submit Cells. The overall rate of return of questionnaires was 39.3%, and the rate of responses from researchers was 62.5% and from regulatory agencies was 8.3 %. The rate of items marked was around 80%, then it was agreed that those items that had a rate higher than 50% would be the essential requirements to be described. The work was not validated due to the low rate of return of questionnaires from the Regulatory Agencies. However, it is believed that what was described can serve as the first step in developing a specific standard relating to control the Banks of Prokaryotes Cells, since it represents the expertise opinion of researchers in the scientific community. Yet, it contributes to the specific requirements that shall eventually be established by ANVISA for the registration of a biogeneric / biosimilar product.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.