OLIVEIRA, Antônia Simoni de. Produção e caracterização físico-química e biológica da cadeia alfa da lectina recombinante de Canavalia brasiliensis. 2017. 71 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PPGBiotec (ppgbiotec@ufc.br) on 2017-11-06T17:25:54Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-11-09T16:58:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T16:58:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) Previous issue date: 2017 / The ability to express and purify desired recombinant proteins in large quantities allows its biochemical characterization and use in industrial processes. Numerous plant lectins have been produced in heterologous systems, especially in Escherichia coli. By recognizing and specifically binding to carbohydrates, these molecules can perform various biological functions, such as cell-cell recognition, cell adhesion, fertilization, and defense mechanisms. Among plant lectins, leguminous lectins have been extensively investigated. The lectin of Canavalia brasiliensis, isolated by the first time in 1984 by Moreira and Cavada is a widely studied protein and has shown an immunostimulatory, andidepressive, antinociceptive, neroptotective, and antiproliferative effect in human leucemia cells, among onther biological activities tested. The biological properties, however, of many lectins have been attributed to isolectin blends, since it is difficult to separate isoforms using standard techniques. In this study the recombinant lectin (α chain) of Canavalia brasiliensis was produced from the synthetic gene inserted in the vector pET28a e. The strains DH5α and BL21 (DE3) were used for cloning and expression, respectively. The rConBr was expressed under all conditions tested and the condition of 16oC, 16 hours and 1,0 mM IPTG (isopropil-β-D-galatosídeo) was chosen for protein production. The protein was purified, being obtained in its active form. Lectin was active when tested against rabbit erytrocytes and was inhibited by mannose and α-methyl-mannopyranoside. The activity of rConBr is optimum at pH 4.0 to 7.0, remains stable up to 60 ° C and is not dependent on divalent cations. In addition, rConBr was not toxic against Artemia sp. and showed no cytotoxic effect on glioma cells C6 lineage. / A capacidade de expressar e purificar a proteína recombinante desejada em grande quantidade permite a sua caracterização bioquímica e o uso em processos industriais. Numerosas lectinas vegetais têm sido produzidas em sistemas heterólogos, especialmente em Escherichia coli. Por reconhecer e se ligar especificamente a carboidratos, essas moléculas podem desempenhar diversas funções biológicas, como o reconhecimento célula-célula, adesão celular, fertilização e mecanismos de defesa. Dentre as lectinas vegetais, lectinas de leguminosas têm sido extensivamente investigadas. A lectina de Canavalia brasiliensis, isolada pela primeira em 1984 por Moreira e Cavada, é uma proteína amplamente estudada e mostrou efeito imonuestimulatório, antidepressivo, antinociceptivo, antiproliferativo em linhagens celulares de leucemia humana e efeito neuroprotetor, dentre outras atividades biológicas testadas. Entretanto, as propriedades biológicas de muitas lectinas têm sido atribuídas a misturas de isolectinas, uma vez que é difícil separar isoformas utilizando técnicas convencionais. Neste estudo foi produzida a lectina recombinante (cadeia α) de Canavalia brasiliensis a partir do gene sintético inserido no vetor pET28a. As cepas DH5α e BL21 (DE3) foram utilizadas para clonagem e expressão, respectivamente. A rConBr foi expressa em todas as condições testadas e foi escolhida a condição de 16oC, 16 horas e 1,0 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) para produção da proteína. A proteína foi purificada, sendo obtida na sua forma ativa. A lectina mostrou-se ativa quando testada contra eritrócitos de coelho e foi inibida por manose e α-metil-manopiranosídeo. A atividade da rConBr é ótima em pH 4,0 a 7,0, mantém-se estável até 60°C e não é dependente de cátion divalentes. Além disso, a rConBr não foi tóxica contra náuplios de Artemia sp. e não mostrou efeito citotóxicos em células de glioma linhagem C6.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-10T19:39:08Z No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-14T13:22:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-14T13:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / As sedas produzidas pelos aracnídeos são essencialmente constituídas de proteínas, as quais são secretadas por glândulas específicas, sendo também encontradas em diferentes grupos de artrópodes. Todos os individuos da classe dos aracnídeos produzem sedas, com diversas funções, sendo todas essas sedas sintetizadas por glândulas presentes no abdômen e polimerizadas por meio de uma série de estruturas denominadas fiandeiras ou fieiras, que são anexos finais da glândula. As aranhas podem possuir em seu corpo ate sete tipos diferentes de glândulas produtoras de seda. Sendo assim, diferentes glândulas produzem diferentes fibras, permitindo então a comparação entre a fibra produzida e sua função, pois cada uma possui propriedades distintas, sendo compostas por motivos de sequência, que conferem a cada uma suas propriedades. Há anos as sedas de aranha tem sido estudadas devido a sua resistência mecânica, que é extremamente superior a do bicho-da-seda. A dificuldade de obtenção dessas sedas através da domesticação de aranhas, que são extremamente agressivas e territorialistas, aliada a possibilidade de produção de novos materiais com propriedades semelhantes, motivaram o desenvolvimento de estrategias alternativas para a producao dessa seda, utilizando a tecnologia do DNArecombinante. Este projeto visou a manipulação e expressão de biopolimeros produzidos a partir de um gene isolado da glandula ampola da principal, produtora de seda da aranha brasileira Parawixia bistriata emmicroorganismos do dominio Bactéria também modificados para possivel aumento da expressão desta proteína. Após produção e purificação, as proteínas de seda foram extruidas para formação de fibra e analises estruturais foram feitas para verificação da qualidade do processo de extrusão, bem como identificação de algumas características moleculares da proteína. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Silks produced by spiders are mainly consisting of proteins, which aresecreted by specific glands, also found in different arthropod groups. Allindividual from the Arachnida class produce silks with different functions, allthese silks are synthesized by glands in the abdomen and polymerizedthrough a series of structures called spinnerets, final appendix of the silkglands. Spiders can have on your body up to seven different types of silkproducingglands. Thus, different glands produce different fibers, thusallowing a comparison between the fiber produced and its function, becauseeach one has different properties and is composed of repetitive amino acidmodules that give each one its properties. For years the spider silks havebeen studied due to its mechanical strength, which is far superior tosilkworm silk. The difficulty of obtaining these silks through thedomestication of spiders, which are extremely aggressive and territorial,combined with the possibility of producing new materials with similarproperties, motivated the development of alternatives for the production ofthis silk strategies using recombinant DNA technology. This project aimed atthe manipulation and expression of biopolymers produced from a geneisolated from the major ampulate gland from the Brazilian spider Parawixiabistriata, which produce spider silk, in microorganisms of the domainBacteria also modified to increase the expression of this protein. Afterproduction and purification, the silk proteins were spun into fibers andstructural analysis were made for verification of the quality of the spinprocess, as well to identify some molecular characteristics of the protein.

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Foi produzida a proteína recombinante do domínio extracelular da subunidade 2 do receptor do IFN-alfa em forma de proteína de fusão com a glutatione-S-transferase (GST-IFNAR2cEC) em E. coli, com o objetivo de avaliar seu efeito bloqueador sobre a ação do IFN-alfa. A GST-IFNAR2cEC de forma solúvel, com peso molecular 54 kDa, foi obtida quando a proteína recombinante foi expressa a 25 graus C por indução de IPTG e foi lisada por French Press. A avaliação do efeito bloqueador da GST-IFNAR2cEC foi feita utilizando-se 3 métodos: 1) Ensaio antiproliferativo com células Daudi, 2) ensaio antiviral com células Hep 2/c e vírus encefalomiocarditis, e 3) expressão gênica semi-quantitativa do STAT 1 (transdutor de sinal e ativador de transcrição) e da 2',5'-oligoadenilato sintetase (OAS) pela RT-PCR duplex nas células Daudi e Hep 2/c. A GST-IFNAR2cEC, mesmo a 420 nM, não inibiu as atividades antiproliferativa e antiviral de 24,5 pM e 49 pM de rIFN-alfa2 provavelmente devido à sua ineficiência na competição com o IFNAR da superfície celular durante o longo período de incubação nos ensaios realizados. A expressão gênica do STAT 1 não foi inibida pela GST-IFNAR2cEC nas células Daudi e Hep 2/c, porém inibiu-se a da 2’, 5’-OAS. Estes resultados sugerem que a expressão gênica do STAT 1 é independente da ligação do IFN-alfa com a IFNAR 2c, e que a da 2’, 5’-OAS é dependente dessa ligação nessas células

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 61-70. Publié aussi en version électronique.

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 13.pdf: 1194887 bytes, checksum: 54a931fb645150833adeccae7c782e0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A eritropoietina humana recombinante (rhEPO) é produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO) pela tecnologia do DNA recombinante (rDNA) e vem sendo amplamente utilizada na prática clínica, para redução da necessidade de transfusão sanguínea em processos cirúrgicos e no tratamento de anemias de várias etiologias, incluindo anemia devido à doença renal crônica; relacionada ao câncer ou ao tratamento do mesmo, anemia relacionada à utilização de zidovudina, utilizada para terapia de pacientes infectados pelo HIV e anemia relacionada à utilização de ribavirina, utilizada para terapia de pacientes portadores de hepatite C. Diante da gama de produtos contendo rhEPO disponíveis no mercado, da abrangência da indicação terapêutica e das características dos pacientes usuários de rhEPO, é de grande importância o efetivo controle da qualidade deste produto previamente ao seu ingresso no mercado. Neste contexto, a avaliação da potência biológica é um dos ensaios preconizados para produtos contendo rhEPO, devendo ser realizada a cada lote produzido, antes que o mesmo possa ser liberado para uso da população. A Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.) preconiza o ensaio de potência biológica de rhEPO, recomendando a utilização da linhagem de camundongos B6D2F1. Entendendo que a possibilidade de utilização de outras linhagens de camundongos seria de grande utilidade para laboratórios produtores, assim como para os laboratórios de controle da qualidade, o presente estudo teve como objetivo principal avaliar a concordância entre os valores de potência biológica obtidos com a linhagem preconizada pela Ph. Eur. (B6D2F1) e Swiss Webster (SW). Todos os resultados foram considerados válidos e satisfatórios, pois cumpriram com os critérios de regressão, linearidade e paralelismo. Os resultados se mantiveram dentro dos limites estabelecidos pela Ph. Eur. / The recombinant human erythropoietin (rhEPO) is produced in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells by recombinant DNA technology (rDNA) and has been widely used in clinical practice, to reduce the need for blood transfusion and in surgical procedures for treatment of anemia of various etiologies; including anemia due to chronic kidney disease, cancer-related or treatment thereof, anemia related to the use of zidovudine therapy used for patients infected with HIV, anemia related to the use of ribavirin, used for therapy of patients with hepatitis C. Given the range of products available on the market containing rhEPO, the scope of the therapeutic indication and characteristics of patients using rhEPO, it is of great importance to effective control the quality of this product prior to its entry into the market. The assessment of biological potency is a recommended test by the European Pharmacopoeia (Ph. Eur) for products containing rhEPO, and B6D2F1 is the mice strain recommended for this test. The possibility of using other mouse strains would be useful for producing laboratories, as well as for quality control laboratories. For this reason, the present study aimed to evaluate the agreement between values obtained with the strain recommended by the Ph. Eur (B6D2F1) and Swiss Webster (SW). The methodology for assessing the potency of rhEPO was standardized for the SW strain and the biological potency results conducted with both strains by INCQS were compared with those conducted by a producing laboratory. All tests were considered valid, satisfactory and met the criteria for regression, linearity and parallelism. The results remained within the limits setted by Ph. Eur. In all groups of data evaluated by the KS test, p> 0.05, no statistical evidence existed to prove that the distribution is not normal. There was no need for combination of tests to obtain satisfactory results in both strains tested. The potency assay using the SW strain is standardized under control and can be employed in assessing the biological potency of rhEPO. For the all variables, i.e. intra-and inter-assay and accuracy, with both strains tested, the values obtained were excellent, especially considering an in vivo assay. The strains, SW and B6D2F1, generated statistically homogeneous and similar results, and therefore can be considered concordant. The assay proved to be reproducible by the practical approach adopted, however, further studies with different laboratories using the SW strain, should be performed.

NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli. 2008. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:23:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) Previous issue date: 2008 / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein. / As lectinas constituem ferramentas biotecnológicas de fundamental importância em estudos histoquímicos e citoquímicos para a detecção de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicações, destacam-se a identificação de receptores de membrana e a detecção de estruturas características de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, já foi utilizada na detecção histoquímica de lesões malignas de mama e tireóide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressão do gene da frutalina em células de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteína através da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estágios de maturação dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqüenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia única, formada pela cadeia beta com 20 resíduos, ligada a um peptídeo de ligação com quatro resíduos, e a cadeia alfa com 133 resíduos. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), após a indução com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios de ligação a carboidratos das moléculas. As mutações nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-01Bitstream added on 2014-06-13T21:03:44Z : No. of bitstreams: 1 prando_ec_dr_botib.pdf: 1650912 bytes, checksum: 61a3213e2810a3629780bb8a28aa87c8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Atualmente, o silenciamento de genes supressores de tumor por mecanismos epigenéticos é reconhecido como uma característica importante das células tumorais. Estudos recentes mostraram que as alterações da metilação do DNA não estão restritas a genes discretos, mas podem afetar ilhas CpG consecutivas em algumas regiões genômicas, levando à hipótese de que mecanismos epigenéticos coordenados poderiam silenciar simultaneamente a expressão de vários genes. A perda da expressão da isoforma A do gene RASSF1, localizado em 3p21.3 (uma região cromossômica frequentemente deletada no câncer), constitui um dos principais exemplos de genes que são inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos no câncer, incluindo os carcinomas mamários. Este estudo teve como finalidade investigar a ocorrência de alterações epigenéticas em um agrupamento gênico em 3p21.3 contendo vários genes candidatos a supressores tumorais. Foram selecionados 10 genes contíguos (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10, NPRL2, TMEM115 e CACNA2D2) e um painel de 17 linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários (BT-20, BT-474, BT-483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDAMB- 453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 e ZR-75-30), uma linhagem epitelial derivada de doença fibrocística benigna da mama (MCF10A) e duas linhagens derivadas de epitélio mamário normal (184A1 e 184B5). Inicialmente, os níveis de expressão foram quantificados por qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) após o tratamento das linhagens com as drogas 5-aza-2’-desoxicitidina (5AzadC), um agente desmetilante, e tricostatina A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas em... / Currently, the silencing of tumor suppressor genes by epigenetic mechanisms is recognized as an important feature of tumor cells. Recent studies have showed that aberrant DNA methylation patterns are not restricted to discrete genes, but also could affect consecutive CpG islands in some genomic regions, which suggested that epigenetically coordinated mechanisms could lead to the simultaneous silencing of cancer-related genes. The loss of expression of the isoform A of the RASSF1 gene, mapped at 3p21.3 (a chromosomal region frequently deleted in cancer), is listed among those genes inactivated by both, genetic and epigenetic mechanisms in human cancer, including breast carcinomas. The purpose of this study was to investigate the occurrence of epigenetic alterations in a gene cluster at 3p21.3 which contains several candidates to tumor suppressor genes. It was selected 10 contiguous genes (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10A, NPRL2, TMEM115 and CACNA2D2) and a panel of 17 breast cancer cell lines (BT-20, BT-474, BT- 483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 and ZR-75-30), one cell line derived from benign fibrocystic disease of the breast (MCF10A) and two cell lines derived from normal mammary epithelium (184A1 and 184B5). Initially, the expression levels were quantified by qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) after the treatments of the cell lines with the 5-aza-2'-deoxycytidine (5Azadc), a DNA demethylating agent and trichostatin A (TSA) a histone deacetylase inhibitor, relative to the untreated controls. The results obtained showed that RASSF1 transcripts were detected in all cell lines; however, the expression of RASSF1A isoform was detected only in the Hs578T and... (Complete abstract click electronic access below)

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.