LANDIM, Patrícia Gadelha de Castro. Produção em Pichia pastoris de uma quitinase de feijão-de-corda com atividade antifúngica. 2011. 155 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T19:42:36Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:17:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) Previous issue date: 2011 / Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50 ° C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41 ° C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity. / As quitinases são enzimas capazes de hidrolisar as ligações β-(1,4)-glicosídicas presentes em biopolímeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarídeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterólogos e a proteína recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relação ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinação de esporos/conídios de fungos filamentosos. A seqüência de DNA codificando a proteína foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressão pET32a(+) e pPICZαA, para expressão heteróloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressão de rVuChi em células de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusão. Em seis estirpes de P. pastoris a proteína recombinante foi secretada, de forma solúvel, para o meio de cultura. Na fração extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolítica, após 72 horas de indução. A detecção de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protéicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequência N-terminal e a ausência de N-glicosilação foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fração F0/40 precipitada com sulfato de amônio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interações hidrofóbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltração em membrana com limite de exclusão de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolítica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora não tenha apresentado atividade contra substratos sintéticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusão molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis ‘spots’ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestável em temperaturas até 50 °C e sua atividade enzimática máxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presença de íons metálicos causou uma redução de sua atividade enzimática. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimática enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hélice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroísmo circular. A desnaturação de 50% das moléculas de rVuChi ocorreu a 54,41 °C. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína produzida em P. pastoris estava em sua conformação totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijão-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinação de esporos de Penicillium herquei até 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibição de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibição de 55% na germinação dos conídios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinação dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinação de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. Além disso, a proteína recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porém não apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata é uma proteína com atividade antifúngica.

FELIX, Wagner Pereira. Produção heteróloga de frutalina em Pichia pastoris. 2008. 113 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:13:10Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:44:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) Previous issue date: 2008 / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 οC and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag. / A frutalina, lectina α-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterólogo para expressão de proteínas utilizando a levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas três estratégias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genômico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptídicas da frutalina, otimizando-o para a expressão em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenção do cDNA utilizando a técnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratégia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratégias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratégia que mostrou melhor expressão da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenção do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresão foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presença do peptídeo de ligação e da cauda de histidina.

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-05-20T23:46:19Z No. of bitstreams: 1 alexandre_s_freire_ioc_ebs_0019_2009.pdf: 1308505 bytes, checksum: c7f7d30c3e4948ed48a24eab9058e569 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-20T23:46:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandre_s_freire_ioc_ebs_0019_2009.pdf: 1308505 bytes, checksum: c7f7d30c3e4948ed48a24eab9058e569 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz . Rio de Janeiro,RJ, Brasil / A produção do conhecimento dá-se de forma mais veloz do que as mudanças educacionais podem acompanhar. Em Biologia, muitas novas teorias são rapidamente traduzidas em produtos que são, por sua vez, absorvidos pela sociedade. É necessário discutir os novos conceitos juntamente com as idéias clássicas no Ensino Médio. Esse trabalho tem como objetivo discutir a Genética Clássica e moderna a partir da avaliação: i) do espaço dedicado [aos esses] assuntos nos livros didáticos; ii) da análise dos posicionamentos dos estudantes acerca dos novos conceitos da “Nova Biologia”; iii) do desenvolvimento e da discussão do uso do “Jogo do Genoma” entre estudantes de Ensino Médio. Para responder a esses questionamentos, os resultados estão divididos em três capítulos, além do Anexo I (Xavier et al., 2006). O artigo no Anexo I avaliou o conteúdo dos livros didáticos. Um total de 12 livros foi analisado quanti e qualitativamente. Os resultados deste artigo sugerem que apenas alguns livros apresentam termos associados à “Nova Biologia”, além de haver de muito espaço dedicado a termos clássicos da Genética.O capítulo 5.1 demonstrou as visões dos estudantes em relação aos conceitos da “Nova Biologia”. Questionários e entrevistas semi-estruturadas foram aplicados em colégios privados e públicos de duas cidades do estado do Rio de Janeiro. Os resultados sugerem que os estudantes sabem sobre os conceitos relacionados à “Nova Biologia”, especialmente aqueles que estão sendo discutidos já mais tempo e mais amplamente pela mídia. O capítulo 5.2 fala sobre a elaboração do “Jogo do Genoma”. O capítulo 5.3 discute o uso do jogo em turmas do terceiro ano de escolas de Ensino Médio do município de Petrópolis, no estado do Rio. Os estudantes jogaram o jogo e responderam perguntas para que as impressões sobre o jogo pudessem ser obtidas. Os resultados sugerem que o Jogo do Genoma pode ser utilizado em aulas de Genética para motivar os alunos a participar mais ativamente no seu próprio aprendizado. Neste trabalho, foi observado que os livros didáticos não abrangem o conteúdo mínimo relativo aos avanços biotecnológicos, e os estudantes não são fluentes na maioria dos temas da “Nova Biologia”. Por outro lado, o “Jogo do Genoma” parece motivar os alunos de forma que atuem como uma ferramenta auxiliar e eficiente para o ensino de Genética e que também poderá ser usado no ensino de Biologia. / The production of knowledge takes place more quickly than changes in education can follow. In biology, many new theories are quickly translated into products that are in turn absorbed by society. It is necessary to discuss the new concepts together with the classical ideas in high school. This paper aims to discuss the classical and modern genetics from the evaluation: i) the space dedicated to [these] issues in textbooks, ii) the analysis of placements of students about new concepts of "New Biology", iii) development and discussion of the use of "Game of the Genome" among high school students. To answer these questions, the results are divided into three chapters, in addition to Annex I (Xavier et al., 2006). Article in Annex I assessed the content of textbooks. A total of 12 books was analyzed quantitative and qualitatively. The results of this paper suggest that only a few books have terms associated with "New Biology", besides having a lot of space devoted to the classical terms Genética.O Section 5.1 demonstrated the views of students about the concepts of "New Biology". Questionnaires and semi-structured interviews were applied to public and private schools in two cities in the state of Rio de Janeiro. The results suggest that students know about the concepts related to the "New Biology", especially those that are being discussed now longer and more widely by the media. Chapter 5.2 discusses the development of the "Game of the Genome." Chapter 5.3 discusses the use of the game in the third year classes of high schools in the city of Petrópolis, State of Rio Students played the game and answered questions for the impressions of the game could be obtained. The results suggest that the Genome Game can be used in genetics classes to motivate students to participate more actively in their own learning. In this study, we observed that textbooks do not cover the minimum content on the advances in biotechnology, and students are not proficient in most of the themes of "New Biology". On the other hand, the "Game of the Genome" seems to motivate students so that they act as an auxiliary tool and efficient for teaching genetics and can also be used in teaching biology.

Made available in DSpace on 2014-09-24T12:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 157.pdf: 1202080 bytes, checksum: e4ae8cb25f3ce32fa7537d73814aa79f (MD5) Previous issue date: 2004 / A avaliação da potência biológica da eritropoetina humana recombinante (rhEPO), presente em sete produtos farmacêuticos, foi efetuada, comparativamente ao Padrão biológico da Farmacopéia Européia F.E.(2002), em camundongos normocitêmicos fêmeas, de 8 semanas de idade da linhagem Swiss Webster (SW), através da administração subcutânea do hormônio, numa sequência logarítmica de base 3 (10, 30 e 90 Ul/animaì Â dose múltipla, subdividida em quatro sucessivas aplicações diárias, seguida da coleta de amostra sangüínea 24h após a última aplicação da dose múltipla, ilsando-se o método visual da hemólise seletiva, para a contagem dos reticulócitos. (...)Empregando o mesmo Padrão, confirmamos dados da literatura, que demonstram que a seqüência logarítmica das doses na base 2 (20, 40 e 80 Ul/animal), aplicadas em esquema de dose única seguida da coleta do sangue 96 h após, preconizada pela F .E., é menos discriminativa da seqüência na base 3, bem como comprovamos a maior sensibilidade e menor variabilidade dos resultados empregando-se a metodologia de dose múltipla, a qual proporcionou ensaios biológicos altamente válidos, evidenciados através da aplicação do método das retas paralelas (3:3,6 pontos) que revelou a elevada significância das regressões lineares (P<0,01) bem como desvios não-significativos da linearidade e do paralelismo (P>0,05). Uma primeira tentativa de aplicação do ensaio 2:2, 4 pontos, reduzindo significativamente o número de animais, revelou-se válida, porém, na vigência de variabilidade mínima dos resultados experimentais, meta que, embora difícil, espera-se seja atingida corri, o emprego do método automatizado de contagem dos reticulócitos, isto é, a Citometria de Fluxo, a qual é de precisão sensivelmente maior que o método visual. O estudo comparativo entre as linhagens B6D2Fl, preconizada pela F.E., e a SW, revelou maior sensibilidade da primeira (24 por cento), embora este valor se afigure relativo, face a significativa diferença entre os pesos corporais das fêmeas da B6D2Fl (16,8 a 20,2 g) e da SW (29,2 a 37,9 g) e ao fato da rhEPO ser aplicada por animal e não por unidade de peso. Por outro lado, as respostas proporcionais das fêmeas da linhagem SW, aos diferentes estímulos do hormônio, se afiguram suficientes para torná-la altamente sugestiva como alternativa válida, em termos de linhagem de camundongos normocitêmicos, para o ensaio biológico de potência da rhEPO.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 501.pdf: 2806630 bytes, checksum: 5dbcbb44377fbc1620ff4879d96a08d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-05T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) Previous issue date: 2008-03 / Sedas são compostos protéicos secretadas por glândulas especializadas encontradas em diferentes grupos de artrópodes. Aranhas produzem uma diversidade de fibras, que são predominantemente compostas por proteínas repetitivas (espidroínas), codificadas por uma família multigênica. A caracterização dessa família está focada em espidroínas sintetizadas por espécies de Araneomorphae (aranhas verdadeiras), enquanto poucas seqüências de Mygalomorphae (tarântulas) são conhecidas. Sedas formam uma família diversa de materiais naturais com extraordinárias propriedades mecânicas, como resistência e extensibilidade, além da biocompatibilidade demonstrada. A possibilidade de produzir novos biomateriais com propriedades similares às das espidroínas levou à inúmeros estudos dessas proteínas. Apesar das potenciais características mecânicas, a inabilidade de domesticar as aranhas para produzir quantidades suficientes de proteínas conduziu ao desenvolvimento de estratégias alternativas para a produção das sedas utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Proteínas com resistência e elasticidade definidas podem ser produzidas utilizando engenharia genética de maneira a misturar os módulos repetitivos em proporções específicas, produzindo biomateriais com grande potencial para uso na medicina e engenharia. Este trabalho envolve a expressão recombinante de seda de aranhas em Escherichia coli, por meio da manipulação genética de genes isolados das glândulas produtoras de seda das espécies Nephilengys cruentata (Araneomorphae) e Avicularia juruensis (Mygalomorphae). A proteína AJSilk Gland Protein – 1 de A. juruensis identificada neste trabalho pode ajudar no melhor entendimento da diversidade e evolução da família de genes das espidroínas. Além disso, genes sintéticos foram construídos para codificar um análogo à Flag-like de N. cruentata. Esses genes artificiais foram obtidos por meio de uma estratégia controlada, usada para proteínas repetitivas compostas por diferentes unidades repetitivas in tandem. Resultados de análises por SDS-PAGE e “Western blot” e a purificação (em coluna de afinidade) demonstraram que as proteínas Flag recombinantes foram expressas com sucesso em microorganismos. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Silks are protein compounds secreted by specialized glands, and are found in different groups of arthropods. Spiders can produce a number of silk fibers (spidroins) that are predominately composed of repetitive amino acid modules encoded by a multigenic family. The characterization of this multigenic family has focused on spidroins synthesized by Araneomorphae species (true spiders), whereas only a few sequences are known from the Mygalomorphae species (tarantulas). Silks represent a diverse family of natural materials with extraordinary mechanical properties such as high tensile strength and extensibility, as well as a great biocompatibility. The possibility of producing new biomaterials properties similar to spidroins motivated this research. Despite their superior mechanical characteristics, the inability of domesticating spiders to produce enough protein for industrial applications had lead to alternative strategies for silk production, mainly through the recombinant DNA technology. By using genetic engineering aproaches to mix the conserved and repetitive modules in specific proportions, proteins with defined strength and elasticity can be designed, and they may have many potential medical and engineering uses. This work involves the recombinant expression of spider silk proteins in Escherichia coli through the manipulation of silk genes isolated from glands of the Brazilian species Nephilengys cruentata (Araneomorphae) and Avicularia juruensis (Mygalomorphae). The protein AJSilk Gland Protein – 1 from A. juruensis was identified in this work and could enlighten some diversity and evolution issues of the spidroin multigenic family. In addition, synthetic genes were designed to encode analogs of the N. cruentata Flag-like gene. These artificial genes were constructed by using a controlled strategy to generate repetitive proteins composed of tandem different repeat units. The results of SDS-PAGE, Western blot analysis and the purification (using a affinity column) of the spider flagelliform recombinant proteins demonstrated that the strategy was successfully conducted to produce these spider proteins in microorganisms.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3689.pdf: 2323201 bytes, checksum: 6af4b1ce7a2e6e0fc415c443c45e7e99 (MD5) Previous issue date: 2011-07-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / Pneumococcal diseases are a major cause of mortality worldwide. New vaccines against Streptococcus pneumoniae are been developed. The pneumococcal surface protein A (PspA) is an important pneumococcal virulence factor and a potential vaccine candidate, therefore, a recombinant fragment of PspA gene was cloned into pET37b and the plasmid was inserted into E. coli BL21(DE3) for improved protein production in high cell density cultures (HCDC). Fed-batch is the operational mode most frequently used to obtain high cell density in recombinant E. coli cultures. Before running a high cell density culture (HCDC) of E. coli, it is usually necessary to decide whether to use glucose or glycerol as carbon source in defined or complex media, with IPTG or lactose as inducing agents. Glycerol has outstanding potential as carbon source because its assimilation does not trigger undesirable metabolite formation, even when growth takes place at high rates. However, glycerol is usually simply used as a glucose substitute in media designed for the latter as carbon source. Furthermore, most of the bioreactor induction strategies have been based on a template from molecular biology shake flask expression studies. Here, both batch and fed-batch defined culture medium formulations were modified to improve performance of the process for glycerol as growth limiting substrate. The experiments were carried out in 5 L bioreactor, using an automatically controlled exponential feeding and glycerol as carbon source. The standard defined medium formulation was modified to improve performance of the process for glycerol as growth limiting substrate and induction by both IPTG and lactose was studied. Specific growth rates up to 0.57 h-1, biomass formation yield of 0.56 g DCW/gglycerol and cellular productivities around 6.0 g (DCW)/ L h were achieved in shortened rE. coli HCDC by increasing the thiamine concentration in the medium, adding phosphate salts to the feeding medium and raising the growth phase temperature to 37°C. The performance of lactose as inducer was investigated by implementing an innovative induction strategy, which consisted of addition of a lactose pulse followed by a continuous supply of lactose mixed with glycerol in the feeding solution. The results indicated similar productivity [1.3 g (DCW)/ L h], protein maximum yield (220 mgprotein/g DCW) and concentration (26 gprotein/L) when using IPTG or lactose. These values are significantly higher than some of the best reported in the literature, confirming the efficacy of the proposed biomass formation and protein production strategy. Glycerol showed outstanding performance as carbon source, enabling high growth rates without acetate formation. Together with automatic control of the exponential feeding profile, the cultivation strategy employed resulted in higher rates of cell growth and protein production, leading to shorter cultivations with higher productivities and, consequently, lower production costs. This work is an important contribution to the field of HCDC with glycerol as carbon source and lactose as inducer. / As doenças pneumocócicas são uma das maiores causas de mortalidade mundial e por isso, o desenvolvimento de novas vacinas contra Streptococcus pneumoniae é crucial para tornar mais eficiente a prevenção contra as doenças causadas por essa bactéria. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é um importante fator de virulência, sendo uma potencial candidata à antígeno vacinal. Por isso, um fragmento recombinante do gene da PspA foi clonado no plasmídeo pET37b e este foi inserido em células de E. coli BL21(DE3) para a produção da proteína em cultivos de alta densidade celular (HCDC). O modo de operação em batelada alimentada é o mais frequentemente empregado para obter altas densidades celulares em culturas de E. coli recombinante. Antes de realizar um HCDC de E. coli, é normalmente necessário decidir entre o uso de glicose ou glicerol como fonte de carbono em um meio definido ou complexo, tendo IPTG ou lactose como agentes da indução. Glicerol apresenta um excelente potencial como fonte de carbono já que sua assimilação não provoca a formação de metabólitos indesejados, mesmo quando altas velocidades de crescimento são observadas. No entanto, o glicerol é geralmente usado simplesmente como um substituto da glicose em meios de cultivo formulados tendo a última como fonte de carbono. Além disso, a maioria das estratégias de indução em biorreator tem sido baseadas em uma transposição dos estudos de indução em frascos agitados. No presente trabalho, as composições dos meios definidos empregados tanto na batelada como na alimentação foram modificadas visando obter um melhor desempenho do processo tendo glicerol como substrato limitante. Os experimentos foram realizados em biorreator de 5 L, utilizando controle automático da alimentação exponencial e glicerol como fonte de carbono. A formulação do meio definido de cultivo comumente utilizado em HCDCs foi modificada para melhorar o desempenho do processo para glicerol como substrato limitante do crescimento e estudou-se a indução com IPTG e lactose. Velocidades específicas de crescimento de até 0,57 h-1, fator de conversão de substrato a células na ordem de 0,56 g (DCW)/ gglicerol e produtividades celular em torno de 6,0 g (DCW)/L h foram obtidos em HCDC de rE. coli de curta duração devido, principalmente, ao aumento da concentração de tiamina no meio, adição de sais de fosfato no meio de alimentação e aumento da temperatura da fase de crescimento para 37ºC. O desempenho da lactose como indutor foi investigado através da implementação de uma estratégia de indução inovadora, baseada na adição de um pulso de lactose seguido por um fornecimento contínuo de lactose junto com glicerol no meio de alimentação. Os resultados indicaram produtividade celular [1,3 g (DCW)/L h], rendimento máximo de proteína (220 mgproteína/g DCW) e concentração protéica (26 gproteína/L) semelhantes ao se utilizar IPTG ou lactose. Estes valores são significativamente maiores do que alguns dos melhores relatados na literatura, confirmando a eficácia da estratégia proposta para a formação de biomassa e produção protéica. O glicerol mostrou um excelente desempenho como fonte de carbono, possibilitando altas velocidades de crescimento celular sem formação de acetato. O controle automático do perfil de alimentação exponencial, juntamente com as estratégias de cultivo empregadas, resultou em maiores velocidades de crescimento celular e produção de proteína, levando a cultivos mais curtos, com maiores produtividades e, consequentemente, menores custos de produção. Este trabalho é uma contribuição importante para estudos de HCDC com glicerol como fonte de carbono e lactose como indutor.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna purificada a partir do lÃtex da planta Calotropis procera foi purificada e sua caracterizaÃÃo bioquÃmica revelou ser esta uma proteÃna similar a osmotinas e que a mesma, denominada de CpOsm, exibia forte atividade contra fungos fitopatogÃnicos. Neste trabalho foram investigados sistemas de expressÃo heterÃlogos, procarionte e eucarionte, com o objetivo de estabelecer sistemas de expressÃo que pudessem produzir CpOsm recombinante e avaliar se sua expressÃo produzia a proteÃna ativa, com aÃÃo antifÃngica. A partir do sequenciamento do cDNA da CpOsm e ensaios de cristalizaÃÃo desenvolvidos com a proteÃna purificada do lÃtex foi possÃvel estudar suas caracterÃsticas moleculares. Para a expressÃo em E. coli foi utilizado o vetor pET303&#61487;CT-His e P. pastoris o vetor pPICZ&#945;A. A proteÃna recombinante (rCpOsm) expressa no sistema procarionte nÃo foi secretada para o meio externo, acumulando-se no espaÃo intracelular, formando corpos de inclusÃo, nos quais a proteÃna estava insolÃvel. Embora a insolubilidade represente um passo limitante, este sistema de expressÃo pode ser muito interessante para a produÃÃo quantitativa de rCpOsm para outros fins como produÃÃo de anticorpos ou estudos de folding/refolding proteico, considerado suas caracterÃsticas moleculares peculiares, observadas nos estudos cristalogrÃficos, tais como o conjunto de pontes dissulfeto intracadeia. rCpOsm foi tambÃm expressa em cÃlulas de P. pastoris, entretanto o sistema de expressÃo deverÃ, necessariamente, sofrer melhorias para maximizar o rendimento. rCpOsm de P. pastoris foi inicialmente detectada por sequenciamento de novo por espectrometria de massas a partir da digestÃo trÃptica. A identificaÃÃo de peptÃdeos internos confirmou sua presenÃa no meio extracelular. A limitaÃÃo deu-se pela baixa taxa de expressÃo, o que, por conseguinte, nÃo permitiu uma caracterizaÃÃo mais ampla da rCpOsm deste sistema. rCpOsm expressa em P. postoris estava em sua forma ativa. Em uma anÃlise comparativa, rCpOsm e CpOsm, de modo e intensidade similares, foram capazes de alterar drasticamente a morfologia de esporos de F. solani e reduzir seu volume, comparados a esporos nÃo tratados, revelado atravÃs de microscopia de forÃa atÃmica. CpOsm foi cristalizada pelo mÃtodo de gota pendente e os cristais obtidos difrataram a uma resoluÃÃo de 1,61 à com caracterÃsticas morfolÃgicas do espaÃo cristalogrÃfico P6122. Os dados coletados sugerem que a proteÃna mantÃm uma estrutura em monÃmero, correspondendo a sequÃncia de aminoÃcidos do cDNA, com 203 resÃduos. A estrutura pode ser vista como trÃs regiÃes distintas, presentes em outras osmotinas jà descritas, formando um domÃnio central onde hà um conjunto de folhas beta, sendo este o mais longo, e dois outros menores, formados de estrutura predominantemente desordenadas com pequenos segmentos em alfa-hÃlice (domÃnio II) e longas alÃas (domÃnio III). Oito pontes dissulfeto estabilizam a estrutura e envolvem todos os resÃduos de cisteÃna da estrutura primÃria. NÃo hà evidencias cristalogrÃficas para formaÃÃo de oligÃmeros. Este estudo conclui que a expressÃo heterÃloga em sistema eucarionte produz rCpOsm ativa e isto representa uma etapa a mais cumprida para a sua possÃvel expressÃo em plantas com o objetivo de proteÃÃo contra fitopatÃgenos. / In a previous step to this work, a latex protein belonging to Calotropis procera was described. The protein, named CpOsm, exhibited biochemical characteristics closely related to pathogenesis related proteins joined into PR-5 group. The new protein with osmotin characteristics displayed activity against phytopatogenic fungi. Here, attempts to obtain a suitable heterologous system to express functional recombinant CpOsm were performed in Prokaryote and Eukaryote expression systems. Further, cDNA sequencing and crystallographic assays were performed using CpOsm and the molecular and structural properties of the functional protein. The vector pET303&#61487;CT-His and PICZ&#945;A were used to express CpOsm in E. coli and P. pastoris, respectively. The ecombinant protein (rCpOsm) produced in the Prokaryote system was retained into E. oli cells and deposited as inclusion bodies. rCpOsm was insoluble. Although insoluble roteins into inclusion bodies represent an adverse phase for obtaining the active CpOsm, this system of expression can be interesting to other goals as quantitative roduction of rCpOsm for producing antibodies or to study protein folding/refolding, ince CpOsm possesses peculiar structural characteristics such as occurrence of an xtended network or intra chain disulfide bonds stabilizing the overall structure. rCpOsm as also successfully expressed in P. pastoris. However, this protocol must to undergo improvement in order to maximize yield. rCpOsm was initially detected in the P. pastoris expression system by MS/MS de novo sequencing after tryptic digestion. Identification of internal peptides present in the extracellular media confirmed the production and excretion of rCpOsm in P. pastoris cells. The very low yield of recombinant protein avoided enough amount of purified rCpOsm to perform a broad characterization. On a comparative basis, native CpOsm, purified of the latex, and rCpOsm, purified from P. pastoris cultures, at similar mode and intensity were capable of drastically alter the morphological architecture of spores of F.solani and reduced their olume as compared to non-treated spores, as revealed by atomic force microscopy measurements. CpOsm was crystallized by the pendant drop method and the crystals grown diffracted at 1.61 Ã. They fit on the P6122 space. The data collecting, supported by the cDNA deduced amino acid sequence suggested that CpOsm occurs as an monomeric structure composed of a unique chain of 203 amino acid residues and no evidences for quaternary association was seen. The overall structure can separated in three structural domains, which have been reported in other osmotins. The central region preserves the set of beta-sheets and is the largest. The others exhibit short segments on alpha-helix interconnected by randomized sequences (domain II). In domain III predominates randomized sequences and long loops. Eight disulfide bonds stabilize the structure and involve all cysteine residues of the primary sequence. The heterologous expression of CpOsm on Eukaryote system produces rCpOsm active and this support the hypothesis that rCpOsm is a suitable candidate for heterologous expression in plants in order to obtain improved crops against selected phytopatogens.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-09T14:09:38Z No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T14:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 / Equine Infectious Anemia (EIA) is caused by a lentivirus of the family Retroviridae and is considered one of the most important viruses in horses in the world. It is a chronic infection, untreated, prevalent in hot and humid climate regions favorable to transmission by hematophagous insects. The official diagnosis of the disease is made through the detection of circulating antibodies in the IDGA and ELISA tests. In order to increase protein yield and improve the performance of serological tests, the p26 gene sequence was optimized for preferred codons for use in E. coli and fused to maltose binding protein. The resulting recombinant fusion protein (p26rec) was detected by SDS-PAGE and Western blot with anti- HIS monoclonal antibody and used as an antigen in the development and evaluation to evaluate an IDGA and an ELISA (IDGArec and ELISArec) for the diagnosis of EIA. After analysis of 569 equine sera, diagnostic sensitivity (SeD) and diagnostic specificity (SpD) were determined. The cutoff point for ELISArec (> 29.51%) was determined by the ROC curve analysis. For IDGArec both SeD and SpD were 100% and for ELISArec were 100% and 99.6% respectively. The p26rec has been maintained with stable working dilutions for more than three years stored at 4 ° C. The results demonstrated the high degree of confidence obtained with p26rec in the IDGArec and ELISArec tests and could therefore be recommended in the serological diagnosis of the AIE. / A Anemia Infecciosa Equina (AIE) é causada por um lentivírus da família Retroviridae e é considerada uma das viroses mais importantes em equinos no mundo. É uma infecção crônica, sem tratamento, prevalente em regiões de clima quente e úmido favorável à transmissão por insetos hematófagos. O diagnóstico oficial da doença é realizado através da detecção de anticorpos circulantes nos testes IDGA e ELISA. Visando aumentar a produção proteica e melhorar o desempenho dos testes sorológicos, a sequência do gene p26 foi otimizada com relação aos códons preferenciais para uso em E. coli e fusionada à proteína ligante de maltose com rendimento 2mg/ml de cultura celular. A proteína de fusão recombinante resultante (p26rec) foi detectada por SDS- PAGE e Western blot com anticorpo monoclonal anti-HIS. A p26rec do VAIE foi utilizada como antígeno no desenvolvimento e avaliação por IDGA e ELISA (IDGArec e ELISArec). Após a análise de 569 soros de equinos, foi determinada a sensibilidade diagnóstica (SeD) e a especificidade diagnóstica (SpD). O ponto de corte para o ELISArec (>29.51%) foi determinado pela análise da curva ROC. Para o IDGArec ambos a SeD e a SpD foram de 100% e para o ELISArec foram de 100% e 99,6% respectivamente. A p26rec vem se mantendo com título estável há mais de três anos armazenada a 4°C. Os resultados encontrados mostram o alto grau de confiança obtido com a p26rec nos testes IDGArec e ELISArec, podendo assim ser recomendados no diagnóstico sorológico da AIE.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-21T15:24:13Z No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-21T15:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos - Finep / The economic impact caused by Aujeszky's disease (AD) has decreased with the use of vaccines deleted for the gE gene of the AD Virus and diagnostic tests for the detection of antibodies specific to the protein corresponding to the deleted gene for differentiation of infected animals from the vaccinated - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). The goal of this work was to clone and express the gene related to the extramembrane portion of the gE glycoprotein of the DA virus in E. coli expression system using synthetic gene with optimized codons and thioredoxin fused protein (Trx), and to evaluate its potential use in ELISA. After cloning, expression and identification of recombinant gE protein (gErec*Trx) in Western blotting with anti-His antibody, gErec*Trx (approximately 60 kDa) was used as antigen in ELISA (ELISAgErec) using Protein G peroxidase as conjugate. Samples previously tested in virus neutralization (VN) and in commercial ELISA were tested in ELISAgErec, and the cutoff point (> 0.13) was defined by ROC curve analysis. A total of 599 sera from pigs were used, of which 208 were positive VN and 391 negative in commercial ELISA for the detection of antigE antibodies from the DA virus, of which 300 originated from Certified Porcine Breeding Farms (GRSCs) and 91 from Technological properties of the State of Pernambuco. ELISAgErec presented sensitivity of 97.6% and specificity of 96.4%. To evaluate the analytical sensitivity and limit of detection, the international reference serum for AD was used, and for analysis of the analytical specificity were tested sera from pigs Pathogen-Specific Free (SPF) vaccinated with the main vaccines used in pigs. ELISAgEr showed greater sensitivity than the commercial ELISA thus demonstrating its ability to distinguish healthy and vaccinated animals from infected animals. In addition, to showing good solubility, gErec remained immunoreactive in the same titre in ELISAgErec after several months stored at 4 °C, and even after thermal stress at 70 °C it presented the same results. / O impacto econômico causado pela Doença de Aujeszky (DA) tem diminuído com uso de vacinas deletadas para o gene gE do Vírus da DA e testes diagnósticos para detecção de anticorpos específicos para a proteína correspondente ao gene deletado, para diferenciação dos animais infectados dos vacinados - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a porção extramembranar da glicoproteína gE do vírus da DA em sistema de expressão E. coli utilizando gene sintético com códons otimizados e proteína fusionada a tiorredoxina (Trx), e avaliar seu potencial uso em ELISA. Após a clonagem, expressão e a identificação da proteína gE recombinante (gErec*Trx) em Western blotting com anticorpo anti-His, a gErec*Trx (aproximadamente 60 kDa) foi usada como antígeno em ELISA (ELISAgErec) utilizando Proteina G peroxidase como conjugado. Amostras previamente testadas em virusneutralização (VN) e em ELISA comercial foram testadas no ELISAgErec, e o ponto de corte (>0,13) foi definido por análise da curva ROC. Foram utilizados 599 soros de suínos, sendo 208 positivos virusneutralização (VN) e 391 negativos em ELISA comercial para detecção de anticorpos antigE do vírus da DA, sendo 300 oriundas de Granjas de Reprodutores Suínos Certificadas (GRSCs) e 91 de propriedades tecnificadas do estado de Pernambuco. O ELISAgErec apresentou sensibilidade de 97,6% e especificidade de 96,4%. Para avaliar a sensibilidade analítica e o limite de detecção foi testado o soro internacional de referência para a DA, e para avaliação da especificidade analítica foram testados soros de suínos Livre de Patógenos Específicos (SPF) vacinados com as principais vacinas usadas em suínos. O ELISAgEr apresentou maior sensibilidade que o ELISA comercial demonstrando assim sua capacidade de distinguir animais sadios e vacinados dos animais infectados. Além de apresentar boa solubilidade a gErec se manteve imunorreativa no mesmo título no ELISAgErec após vários meses estocada a 4 °C, e mesmo após estresse térmico a 70 °C apresentou mesmos resultados.