O objetivo deste estudo foi a avaliação histopatológica e radiográfica da resposta pulpar e periapical de dentes de cães após pulpotomia e utilização da Proteína Morfogenética Óssea Recombinante Humana 7. Foram utilizados 60 dentes (120 raízes) de 6 cães, divididos em 8 grupos, nos períodos experimentais de 7 dias (Grupos I, II, III, IV) e 70 dias (Grupos V, VI, VII, VIII). Após a pulpotomia, o remanescente pulpar foi recoberto com os seguintes materiais: Grupos I e V - Proteína Óssea Morfogenética Recombinante Humana 7 (rHuBMP-7) associada ao Colágeno Recombinante Humano (rHuCollagen); Grupos II e VI - Colágeno Recombinante Humano (rHuCollagen); Grupos III e VII (Controle Negativo) - Hidróxido de Cálcio p.a. e soro fisiológico e Grupos IV e VIII (Controle Positivo) - Óxido de Zinco e Eugenol. Decorridos os períodos experimentais, os animais foram mortos, as peças removidas e submetidas ao processamento histológico. A avaliação histopatológica foi realizada subjetivamente em microscópio óptico. A avaliação radiográfica foi realizada considerando-se a integridade da lâmina dura, presença de áreas de rarefação óssea periapical, de reabsorções radiculares (interna e externa) e de ponte de dentina, sendo os resultados submetidos à análise estatística utilizando-se o teste exato de Fisher. Nos espécimes que apresentavam áreas de rarefação periapical, as medidas radiográficas das lesões foram comparadas entre os grupos por meio do teste de Kruskall-Wallis. Os achados histopatológicos evidenciaram que no período de 7 dias, nos Grupos I e II havia um infiltrado inflamatório severo e intensa proliferação vascular no tecido pulpar, no Grupo IV um infiltrado inflamatório moderado enquanto no Grupo III foi observado um infiltrado inflamatório leve, estando o tecido pulpar íntegro. Em todos os grupos não havia formação de ponte de dentina e a região periapical apresentava aspectos de normalidade. No período de 70 dias, nos Grupos V, VI e VIII não houve formação de ponte de dentina, o tecido pulpar apresentava áreas de necrose com presença de células inflamatórias na região periapical e reabsorção cementária e óssea. Por outro lado, no Grupo VII, foi observada presença de ponte de dentina, ausência de processo inflamatório e ausência de reabsorção dos tecidos mineralizados. Com relação aos achados radiográficos, no período de 7 dias, todos os espécimes dos Grupos I, II, III e IV apresentavam integridade da lâmina dura, ausência de rarefação óssea periapical, ausência de reabsorção radicular (interna e externa) e ausência de ponte de dentina. No período de 70 dias, nos Grupos V, VI e VIII não houve formação de ponte de dentina em nenhum espécime sendo observadas áreas de rarefação óssea periapical em 100% das raízes do Grupo VI, 60% das raízes do Grupo VIII e 40% das raízes do Grupo V, sendo as maiores lesões encontradas no Grupo VI, seguida pelos Grupos V e VIII (p<0,05). No grupo VII, foi observada presença de ponte de dentina em 60% dos casos, integridade da lâmina e ausência de rarefação óssea periapical em 100% dos casos. Pode-se concluir que a Proteína Óssea Morfogenética Recombinante Humana 7 quando associada ao Colágeno Recombinante Humano não apresentou resultados satisfatórios. / The purpose of this study was to evaluate, both histopathologically and radiographically, the pulpal and periapical response of dogs’ teeth after pulpotomy and use of recombinant human bone morphogenetic protein-7 (rHuBMP-7). For such purpose, 60 teeth (120 roots), obtained from 6 dogs, were divided in 8 groups and evaluated in two experimental periods: 7 days (Groups I, II, III, IV) and 70 days (Groups V, VI, VII, VIII). After pulpotomy, pulp remnant was covered with the following materials: Groups I and V - recombinant human bone morphogenetic protein-7 (rHuBMP-7) associated to recombinant human like collagen (rHuCollagen); Groups II and VI - recombinant human like collagen (rHuCollagen); Groups III and VII (negative control) – calcium hydroxide and sodium chloride solution; and Groups IV and VIII (positive control) – zinc oxide and eugenol. At the established experimental periods, the animals were sacrificed and the anatomic pieces were obtained and histologically processed. The histopathologic evaluation was realized subjectively in a light microscope. The radiographic evaluation was performed considering the integrity of the lamina dura, presence of areas of periapical bone rarefaction, root resorption (internal and external) and dentin bridge formation. The results were analyzed statistically using Fisher\'s exact test. In the specimens presenting periapical bone rarefaction areas, the lesions’ radiographic measurements were compared among the groups using the Kruskall-Wallis test. The histopathologic findings in the 7-day period revealed that Groups I and II presented a severe inflammatory infiltrate and intense vascular proliferation in the pulp tissue, Group IV presented a moderate inflammatory infiltrate while Group III presented a mild inflammatory infiltrate and intact pulp tissue. In all groups, there was no dentin bridge formation and the periapical region had normal appearance. In the 70-day period, Groups V, VI and VIII showed no dentin bridge formation and pulp tissue presented necrotic areas with inflammatory cells in the periapical region as well as bone and cemental resorption. On the other hand, in Group VII, there was dentin bridge formation, absence of inflammatory process and absence of resorption of mineralized tissues. Regarding the radiographic findings, in the 7-day period, all specimens in Groups I, II, III and IV present intact lamina dura, absence of periapical bone rarefaction, absence of root resorption (internal and external) and absence of dentin bridge formation. In the 70-day period, Groups V, VI and VIII did not present dentin bridge formation in any specimen. Periapical bone rarefaction areas were observed in 100% of the roots in Group VI, 60% of the roots in Group VIII and 40% of the roots in Group V. The largest lesions were found in Group VI, followed by Groups V and VIII (p<0.05). In Group VII, there was dentin bridge formation in 60% of the cases, intact lamina dura and absence of periapical bone rarefaction in 100% of the cases. Based on these results, it may be concluded that recombinant human bone morphogenetic protein-7 associated to recombinant human like collagen did not present satisfactory results.

O desenvolvimento de vacinas multivalente constitui urna das prioridades na pesquisa de vacinas modernas. A utilização de vetores vivos para apresentação de antígenos heterólogos mostra-se bastante atraente, e eliminaria a necessidade de várias doses para se alcançar uma proteção máxima. Este tipo de vacina poderia ser administrado em dose única, o que poderia aumentar a cobertura vacinal. Neste trabalho foi explorado o potencial do Mycobacterium bovis BCG recombinante (rBCG) vivo expressando antígenos de Bordetella pertussis, como futuro componente de urna vacina tetravalente rBCG-DTP contra a tuberculose, tétano, difteria e pertussis. Os antígenos de pertussis utilizados foram a subunidade S1 mutada e atóxica da Toxina Pertussis (SI-P1) e o fragmento CRD, um domínio imunogênico da proteína FHA (Adesina Hemaglutinina Filamentosa). PT é o principal fator de virulência de B. pertussis e tanto sozinho como combinado com outros antígenos é o principal componente de todas as vacinas acelulares desenvolvidas até o momento. FHA é um importante fator de aderência da bactéria às células ciliada alvo do hospedeiro, sendo o CRD (domínio de reconhecimento a carboidrato) o responsável pelo reconhecimento de carboidratos em receptores de células do hospedeiro. Os genes detses antígenos foram clonados em vetores de expressão micobacterianos e expressos em BCG sob o controle do promotor mutado da &#946;-lactamase de Mycobacterium fortuitum, pBlaF*, em fusão com o peptídeo sinal da &#946;-lactamase. Estes vetores possuem como marcador de seleção um gene de resistência a kanamicina. Camundongos foram imunizados com rBCG expressando S1-PT e os respectivos esplenócitos mostraram elevada produção de IFN-&#947; e baixa produção de IL-4, caracterizando uma forte resposta celular Th1 antígeno-específica dominante. rBCG-S1PT induziu uma baixa resposta humoral contra PT. Camundongos imunizados com rBCG-S1PT mostraram elevado nível de proteção contra um desafio intracerebral com uma cepa virulenta de B. pertussis. Animais imunizados com rBCG expressando CRD revelaram a presença de anticorpos anti-FHA no soro. Ensaios com camundongos imunizados com a combinação destas duas vacinas estão sendo realizados. Uma nova abordagem para obtenção de rBCG sem o uso de genes de resistência a antibióticos como marcador de seleção, foi investigada, utilizando a complementação em BCG auxotrófico. Uma cepa de rBCG auxotrófico para lisina foi transformada com vetores de expressão contendo o gene de complementação para lisina e os antígenos de pertussis sob controle do mesmo promotor: a seleção dos recombinantes é realizada em meio sem lisina. Estas construções permitiram a expressão estável dos antígenos e serão avaliadas quanto a indução de uma resposta imunológica efetiva contra pertussis. / The development of combined vaccines constitutes one of the priorities in modem vaccine research. The use of live vectors for heterologous antigen presentation is desirable, as it could eliminate the necessity of several doses to reach a maximum protection and increase vaccine coverage. In this work, the potential of recombinant Mycobacterium bovis BCG (Bacillus Calmette and Guerin) (rBCG), expressing Bordetella pertussis antigens was investigated. The antigens used were the genetically detoxified S1 subunít of pertussis toxin (S1-PT) and the CRD fragment of FHA (Filamentous hemagglutinin. The antigen genes were cloned into mycobacterial expression vectors under control of the upregulated M. fortuitum &#946;-lactamase promoter, pBlaF*, in fusion with the &#946;-lactamase signal sequence. Mice were immunized with rBCG expressing S1-PT and the respective splenocytes induced specific production of INF-&#947; and low IL-4, characterizing a strong antigen-specific Th1-dominant cellular response. The rSCG-S1 PT induced a low humoral response against PT. Mice immunized with rSCG-S1 PT strains displayed high-level of protection against an intracerebral challenge with live B. pertussis. Animals immunized with rBCG expressing CRD induced anti-FHA antibodies production. Protection induced by the combination of these two strains is being evaluated. A new approach for production of rBCG without the use of antibiotic resistance markers was also investigated, using complementation in auxotrophic BCG. A lysine auxotrophic rSCG strain was transformed with expression vectors containing the complementation gene for lysine and the pertussis antigens: selection of recombinant clones was carried in media without lysine. These constructs allowed steady expression of the antigens and will be evaluated for the induction of an immunological response against pertussis. These strains would be appropriate for clinical evaluation in humans.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-28T12:10:57Z No. of bitstreams: 1 ricardo-cristiano-de-souza-brum.pdf: 1743762 bytes, checksum: 0d2663a8b1457e7b609cb7288212d4da (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-28T12:10:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ricardo-cristiano-de-souza-brum.pdf: 1743762 bytes, checksum: 0d2663a8b1457e7b609cb7288212d4da (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Nos últimos anos, as farmacopéias e principais agências regulatórias para produtos farmacêuticos e biofarmacêuticos exigem cada vez mais em suas monografias a aplicação do método para detecção de endotoxinas bacterianas pelo lisado de amebócitos de Limulus(LAL) no controle de pirogênio de produtos terminados parenterais. O objetivo do presente estudo foi padronizar e validar o ensaio de LAL para o biofármaco alfainterferona 2b humana recombinante, produzido em E. coli. Foram empregados os métodos Gel-Clot e Cinético-Cromogênico (semiquantitativo e quantitativo, respectivamente). Para o método Cinético-Cromogênico, a máxima diluição válida (MDV) foi calculada para cada apresentação com base na concentração do produto e a sensibilidade do teste (3 MUI, MDV: 1:3.888 e 10 MUI, MVD: 1:12.962). Diluições seriadas abaixo da MDV foram avaliadas emtriplicata para a verificação dos interferentes, sendo eleitas as diluições de 1:80 e1:100 que exibiram a melhor recuperação no controle positivo do produto. Para oensaio Gel-Clot na apresentação de 3 MUI (MDV: 1:17) foi estipulada a diluição de 1:8para a validação dos testes de rotina. Durante a validação dos ensaios, foi utilizada uma curva-padrão de endotoxina nas concentrações de 0,005 – 50 EU/ml e avaliados o seucoeficiente de correlação (R) e o desvio-padrão relativo. Os critérios de desempenho do método cinético (linearidade, especificidade, exatidão, repetibilidade, reprodutibilidade) foram atendidos de acordo com os parâmetros farmacopéicos e regulatórios (ANVISA e FDA), garantindo desta forma a robustez necessária para que o método de LAL possa ser incluído nos ensaios de rotina do Laboratório de Controle de Qualidade. / In recent years, the Pharmacopean, technical reports and international guides for pharmaceuticals products requires each time more intheir monographies the application of Limulus Ambocytes Lysateendotoxins assay (LAL) for release and pyrogen control in parenteral finished products. The objective of thisstudy was the standardization and validation of the LAL test for the human recombinant biopharmaceutical interferon alpha 2b, produced in E. coli, were used Gel-Clot and Chromogenics Kinetic methods (semi-quantitative and quantitative). In the case of Chromogenics method test, the maximum valid dilution (MDV) was calculated for each presentation based on the concentration of product (3 MUI, MDV: 1:3,888 and 10 MUI, MVD: 1:12,962), serial dilutions under the MDV (1:80) were evaluated in triplicate to detect interferences. For the gel-clot test for the 3 MUI presentation (MDV: 1:17) 1:8 dilution was setfor interferences detection test. For tests’ validation, several dilutions were performedusing standard endotoxin concentrations in 0,005 to 50 EU / ml to confirm the criteria for the methods performance (linearity, specificity, accuracy, reply, reproducibility). The results of validation showed that all pharmacopeia and regulatory parameters (ANVISA) studied, are compatible with the MDV used for each studied presentation of the human recombinant biopharmaceuticals interferon alpha 2b and may be used in quality control.

O desenvolvimento de vacinas multivalente constitui urna das prioridades na pesquisa de vacinas modernas. A utilização de vetores vivos para apresentação de antígenos heterólogos mostra-se bastante atraente, e eliminaria a necessidade de várias doses para se alcançar uma proteção máxima. Este tipo de vacina poderia ser administrado em dose única, o que poderia aumentar a cobertura vacinal. Neste trabalho foi explorado o potencial do Mycobacterium bovis BCG recombinante (rBCG) vivo expressando antígenos de Bordetella pertussis, como futuro componente de urna vacina tetravalente rBCG-DTP contra a tuberculose, tétano, difteria e pertussis. Os antígenos de pertussis utilizados foram a subunidade S1 mutada e atóxica da Toxina Pertussis (SI-P1) e o fragmento CRD, um domínio imunogênico da proteína FHA (Adesina Hemaglutinina Filamentosa). PT é o principal fator de virulência de B. pertussis e tanto sozinho como combinado com outros antígenos é o principal componente de todas as vacinas acelulares desenvolvidas até o momento. FHA é um importante fator de aderência da bactéria às células ciliada alvo do hospedeiro, sendo o CRD (domínio de reconhecimento a carboidrato) o responsável pelo reconhecimento de carboidratos em receptores de células do hospedeiro. Os genes detses antígenos foram clonados em vetores de expressão micobacterianos e expressos em BCG sob o controle do promotor mutado da &#946;-lactamase de Mycobacterium fortuitum, pBlaF*, em fusão com o peptídeo sinal da &#946;-lactamase. Estes vetores possuem como marcador de seleção um gene de resistência a kanamicina. Camundongos foram imunizados com rBCG expressando S1-PT e os respectivos esplenócitos mostraram elevada produção de IFN-&#947; e baixa produção de IL-4, caracterizando uma forte resposta celular Th1 antígeno-específica dominante. rBCG-S1PT induziu uma baixa resposta humoral contra PT. Camundongos imunizados com rBCG-S1PT mostraram elevado nível de proteção contra um desafio intracerebral com uma cepa virulenta de B. pertussis. Animais imunizados com rBCG expressando CRD revelaram a presença de anticorpos anti-FHA no soro. Ensaios com camundongos imunizados com a combinação destas duas vacinas estão sendo realizados. Uma nova abordagem para obtenção de rBCG sem o uso de genes de resistência a antibióticos como marcador de seleção, foi investigada, utilizando a complementação em BCG auxotrófico. Uma cepa de rBCG auxotrófico para lisina foi transformada com vetores de expressão contendo o gene de complementação para lisina e os antígenos de pertussis sob controle do mesmo promotor: a seleção dos recombinantes é realizada em meio sem lisina. Estas construções permitiram a expressão estável dos antígenos e serão avaliadas quanto a indução de uma resposta imunológica efetiva contra pertussis. / The development of combined vaccines constitutes one of the priorities in modem vaccine research. The use of live vectors for heterologous antigen presentation is desirable, as it could eliminate the necessity of several doses to reach a maximum protection and increase vaccine coverage. In this work, the potential of recombinant Mycobacterium bovis BCG (Bacillus Calmette and Guerin) (rBCG), expressing Bordetella pertussis antigens was investigated. The antigens used were the genetically detoxified S1 subunít of pertussis toxin (S1-PT) and the CRD fragment of FHA (Filamentous hemagglutinin. The antigen genes were cloned into mycobacterial expression vectors under control of the upregulated M. fortuitum &#946;-lactamase promoter, pBlaF*, in fusion with the &#946;-lactamase signal sequence. Mice were immunized with rBCG expressing S1-PT and the respective splenocytes induced specific production of INF-&#947; and low IL-4, characterizing a strong antigen-specific Th1-dominant cellular response. The rSCG-S1 PT induced a low humoral response against PT. Mice immunized with rSCG-S1 PT strains displayed high-level of protection against an intracerebral challenge with live B. pertussis. Animals immunized with rBCG expressing CRD induced anti-FHA antibodies production. Protection induced by the combination of these two strains is being evaluated. A new approach for production of rBCG without the use of antibiotic resistance markers was also investigated, using complementation in auxotrophic BCG. A lysine auxotrophic rSCG strain was transformed with expression vectors containing the complementation gene for lysine and the pertussis antigens: selection of recombinant clones was carried in media without lysine. These constructs allowed steady expression of the antigens and will be evaluated for the induction of an immunological response against pertussis. These strains would be appropriate for clinical evaluation in humans.

Neste trabalho foram estudados diversos métodos cromatográficos para a purificação de fatores recombinantes de coagulação VII (FVIIr) e VIII (FVIIIr) derivados de linhagens celulares humanas SK-Hep. O FVIIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia A, enquanto o FVIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia B e também a Hemofilia A. Produzir estes fatores em linhagens celulares humanas faz com os padrões de glicosilação, sulfatação e enovelamento destas proteínas sejam extremamente parecidos com os fatores endógenos produzidos no organismo humano. A purificação do FVIIIr através de técnicas de cromatografia multimodais usando a resina CaptoMMC, afinidade usando a resina FVIIISelect e troca iônica (SP-Sepharose) permitiu obter um produto bastante homogêneo e com perfil de banda (por SDS-PAGE) bem definido que demonstrou a presença esperada das cadeias leve e pesada (o Westen-Blott indicou que os anticorpos comerciais reconheceram a cadeia pesada da molécula estudada). As técnicas permitiram uma alta reprodutibilidade do processo onde sequencias de purificação indicaram o mesmo comportamento de perfis cromatográficos e o processo eliminou 99.5% ± 0,5% de proteínas inespecíficas, recuperando até 64% de FVIIIr. O FVIIr foi purificado com apenas uma única técnica cromatográfica usando a resina FVIISelect que isolou a proteína de interesse eliminando cerca de 99% de impurezas, recuperando praticamente todo o produto. O eluido da cromatografia de afinidade foi dialisado em membranas de 5 kDa o que resultou no processo de auto ativação da molécula de FVIIr, resultando em um aumento de sinal de até 5x em relação a quantidade inicial. O gel de SDS-PAGE e o Westen-Blott comprovaram o processo de auto-ativação no qual uma migração de banda de 50 kDa para 30kDa foi observada e os anticorpos comerciais contra FVII foram capazes de detecta-la. O método de purificação também foi bastante reproduzível e o perfil de banda muito semelhante se comparado ao produto comercial existente no mercado. Sendo assim, foi possível obter plataformas de purificação para as proteínas FVIIr e FVIIIr. / In this work, several chromatographic methods were studied for the purification of recombinant clotting factors VII (FVIIr) and VIII (FVIIIr) derived from human SK-Hep cell lines. The FVIIIr is used for the treatment of Hemophilia A, while the FVIIr is used for the treatment of Hemophilia B and Hemophilia A. Producing these factors in human cell lines results in glycosylation, sulphation and folding patterns similar to the endogenous factors produced in the human organism. Purification of FVIIIr by multimodal chromatography techniques using CaptoMMC resin, affinity using FVIIISelect resin and ion exchange (SP-Sepharose) yielded a fairly homogeneous and well-defined band profile (by SDS-PAGE) which demonstrated the expected presence of the light and heavy chains, Westen-Blott indicated that commercial antibodies recognized the heavy chain of the studied molecule. The techniques allowed a high reproducibility of the process where purification sequences indicated the same behavior of chromatographic profiles and the process eliminated 99.5% ± 0.5% nonspecific proteins and recovering up to 64% FVIIIr. FVIIr was purified with only a single chromatographic technique using the FVIISelect resin which isolated the protein by removing about 99% impurities and recovering virtually the entire product. The affinity chromatography eluate was dialyzed on 5 kDa membranes which resulted in the autoactivation process of the FVIIr molecule resulting in a signal increase of up to 5 fold over the initial amount. The SDS-PAGE gel and Westen-Blott demonstrated the auto-activation process where a migration of 50 kDa to 30 kDa band was observed and the commercial antibodies against FVII were able to detect the band. The purification method was also quite reproducible and the band profile very similar compared to the commercial products. Thus, it was possible to obtain purification platforms for the FVIIr and FVIIIr proteins.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra estágios assexuados sanguíneos de Plasmodium. Recentemente nosso grupo identificou o domínio II (DII) de AMA-1 de Plasmodium vivax (PvAMA-1) como uma região altamente reconhecida por anticorpos IgG de indivíduos brasileiros infectados por P. vivax. No presente estudo avaliamos as propriedades imunogênicas da proteína recombinante DII, produzida a partir de Escherichia coli. Grupos de 6 camundongos fêmeas BALB/c foram imunizados quatro vezes com 10 &#181;g dessa proteína na presença de diferentes formulações de adjuvantes [Adjuvante Completo/Incompleto de Freund (ACF/AIF), MPL-TDM, TiterMax, Hidróxido de Alumínio (Alum), Quil A, QS-21 e CpG-ODN 1826], individualmente, ou em combinação (Alum + QS-21 ou Alum + CpG-ODN 1826)). Nosso objetivo foi avaliar comparativamente a resposta de anticorpos (IgM, IgG e isotipos de IgG), induzida pelos diferentes esquemas de imunizações, visando futuros estudos pré-clínicos em primatas não humanos. Os títulos de anticorpos IgG contra (o ectodomínio) PvAMA-1 foram determinados por ELISA, duas semanas após cada imunização. A presença de IgM e dos isotipos de IgG também foi avaliada após o final do esquema de imunizações. Nossos resultados demonstraram que a proteína recombinante DII foi altamente imunogênica em camundongos BALB/c quando administrada na presença dos adjuvantes testados. Altos títulos de IgG1, IgG2a e IgG2b foram observados na maioria dos grupos (com exceção do adjuvante Alum), sugerindo uma resposta mista Th1/Th2. Finalmente, demonstramos que anticorpos monoclonais e policlonais anti-DII reconheceram a proteína nativa expressa na superfície de merozoítas de P. vivax, por imunofluorescência. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a proteína recombinante o domínio II de PvAMA-1 (DII) foi imunogênico em camundongos BALB/c quando administrado na presença das diferentes formulações de adjuvantes testadas, sugerindo que esse antígeno possa ser utilizado como uma vacina de subunidade contra a malária vivax. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) has been considered a malaria vaccine candidate against asexual blood stages of Plasmodium. Recently, we identified the domain II (DII) of Plasmodium vivax AMA-1 (PvAMA-1) as a region highly recognized by IgG antibodies from Brazilian individuals infected by P. vivax. In the present study, we evaluated the immunogenic properties of a bacterial recombinant PvAMA-1 DII. Groups of 6 female BALB/c were immunized four times with 10 &#181;g of recombinant protein in the presence of different adjuvant formulations [Complete/Incomplete Freunds Adjuvant (CFA/IFA), MPL-TDM, TiterMax, Aluminum hydroxide (Alum), Quil A, QS-21, CpG-ODN 1826] separately or in combination (Alum + QS-21 or Alum + CpG-ODN 1826). Our goal was to compare the antibody response (IgM, IgG and IgG subclass) induced by different protocols of immunization aiming at future pre-clinical studies in non-human primates. The IgG antibody titers against PvAMA-1 were determined by ELISA two weeks after each immunizing dose. The presence of IgM and IgG subclass were evaluated after the end of immunizations schedule. We found that the recombinant DII was highly immunogenic in BALB/c mice when administered in the presence of all adjuvant tested. High titers of IgG1, IgG2a and IgG2b were observed in all groups (except for Alum adjuvant), suggesting a mixed Th1/Th2 response. Finally, we demonstrated that monoclonal and polyclonal antibodies against DII recognized the native protein expressed on the P. vivax merozoite surface parasites by immunofluorescence. Together, our data demonstrated that the recombinant PvAMA-1(DII) was immunogenic in mice when administered in different adjuvant formulations, suggesting that this protein can be used as part of a sub-unit vaccine against malaria vivax.

O avanço no desenvolvimento de uma vacina contra o Plasmodium vivax exige a identificação de antígenos capazes de induzir uma resposta imune protetora contra a malária. O presente estudo avalia o potencial da proteína-3 da superfície de merozoítos de P. vivax (PvMSP-3), como candidata a vacina. As proteínas recombinantes representando a região C-terminal da MSP-3&#945; e diferentes regiões (N e C-terminal e proteína inteira) da MSP-3&#946; de P. vivax foram utilizadas como antígeno. A imunogenicidade destas proteínas recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando adjuvantes agonistas de TLR (flagelina FliC de Salmonella Typhimurium e CpG ODN) ou adjuvantes convencionais, tais como hidróxido de alumínio, saponinas, TiterMax Gold e adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA utilizando soros de camundongos coletados duas semanas após cada dose de imunização. Nossos resultados demonstraram que a MSP-3&#945; e a MSP-3&#946; foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos em camundongos na presença de diferentes adjuvantes, incluindo agonistas de TLR. Dentre as formulações testadas, aquelas contendo os adjuvantes CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax e adjuvante incompleto de Freund foram mais imunogênicas e, portanto, mais promissoras para os ensaios pré-clínicos em primatas não-humanos. Usando camundongos TLR-4 KO, nós demonstramos que a proteína MSP-3&#946; tem uma propriedade adjuvante intrínseca que é independente do TLR4 e que a contaminação por LPS na proteína purificada não desempenha qualquer papel no nosso sistema. / The advance in the development of a vaccine against Plasmodium vivax requires the identification of immunodominant antigens able to induce a protective immune response against malaria. The present study evaluates the potential of the Merozoite Surface Protein 3 of P. vivax (PvMSP-3) as vaccine candidate. Recombinant proteins representing the C-terminal region of MSP-3&#945; and different regions of MSP-3&#946; (N and C-terminal and full-length protein) of P. vivax were used as antigen. The immunogenicity of these recombinants was evaluated in BALB/c mice using as adjuvant TLR agonists (FliC flagellin of Salmonella Typhimurium and CpG motif-containing DNA) or conventional adjuvants such as Aluminum hidroxide, Saponins, TiterMax Gold and Incomplete Freund\'s Adjuvant. The IgG antibodies were determined by ELISA in sera from mice two weeks after each immunizing dose. Our results demonstrated that MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were able to induce high antibody titres in mice in the presence of different adjuvants, including TLR agonists. Among the tested formulations, the adjuvants CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax and Incomplete Freund\'s Adjuvant were more immunogenic, therefore more promising for pre-clinical trials in non-human primates. Using TLR-4 KO mice, we demonstrated that the MSP-3&#946; protein has an intrinsic adjuvant property that is independent of TLR4 and that contaminating LPS in the purified protein did not play any role in our system.

O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

No experimento 1, avaliou-se os efeitos da leptina exógena na concentração sérica de leptina e na expressão do gene LEP no tecido adiposo de novilhas zebuínas pré-púberes. Amostras de tecido adiposo (mesentérico, perirenal e subcutâneo) e de sangue foram obtidas de 36 novilhas, distribuídas nos tratamentos: A) dieta de alta energia; B) dieta de baixa energia; BL) dieta de baixa energia + 4,8 g/kg PV de oLeptin subcutânea, duas vezes ao dia, por 56 dias. A concentração de leptina foi determinada com kit comercial ELISA (Cusabio) específico. Amostras de sangue de quatro novilhas por grupo foram coletadas em seis pontos no tempo, sendo um antes e um após o tratamento hormonal. Dois dias após a obtenção da puberdade, oito novilhas por grupo foram abatidas para coleta de tecido. A expressão gênica foi quantificada nos depósitos de gordura por PCR em tempo real. A oLeptina aumentou transitoriamente a concentração de leptina do grupo BL, com pico (11,1 ± 1,4 ng/mL) após 7 dias do início do tratamento. A leptina sérica do grupo A aumentou linearmente no tempo, enquanto no grupo B, manteve-se constante (4,0 ± 2,0 ng/mL). A dieta A aumentou a expressão de leptina no tecido adiposo em 2,4 vezes; e a administração de oLeptina diminuiu a expressão do gene LEP em cerca de 2,5 vezes, comparando com o grupo controle. A redução na expressão do gene LEP explica a redução na leptina sérica do grupo BL após 30 dias de tratamento hormonal. O objetivo do experimento 2 foi clonar a região codificadora da leptina bovina, transformar leveduras Pichia pastoris KM71H e expressar a proteína no meio de cultura. O gene da leptina foi amplificado em reação de PCR, a partir de amostra de tecido adiposo subcutâneo de novilha do grupo A. Os primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (senso) e 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT - 3\' (antisenso), contendo sítios EcoRI e SalI, foram desenhados com base na sequência do mRNA da leptina bovina (NM 173928.2), substituindo a sequência sinal de secreção nativa pela sequência do Fator do Saccharomyces cereviasiae. O inserto foi clonado nos vetores de expressão pPICZ&alpha;A e pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), sendo as leveduras transformadas por eletroporação. Clones com múltiplas cópias do gene foram selecionados em meio YPD + 500 &#956;g/mL de zeocina, e 22 colônias recombinantes foram selecionadas para análise de expressão em pequena escala. Colônias pPICbLep foram inicialmente cultivadas em meio de crescimento (BMGY), sendo transferidas para meio de indução (BMMY), contendo metanol. A indução durou 144 horas. Alíquotas de 200 &#956;l de sobrenadante foram coletadas diariamente, para análise da presença da bLeptina por SDS-PAGE. As colônias pGAPbLep foram cultivadas em meio YPD por 96 h, com coleta de sobrenadante a cada 24 h. As leveduras foram transformadas com sucesso, com os plasmídeos pPICbLep e pGAPbLep, entretanto, apenas as colônias pGAPbLep expressaram uma proteína de 35 kDa, o dobro do tamanho esperado para a bLeptina (17 kDa), provavelmente por ocorrência de dimerização. Mais estudos são necessários sobre os processos de produção de leptina recombinante bovina em Pichia pastoris. / In experiment 1, the effects of exogenous leptin were evaluated on serum leptin levels and on LEP gene expression in the adipose tissue of prepubertal zebu heifers. Adipose tissue (mesenteric, perirenal and subcutaneous) and blood samples were collected from 36 heifers, distributed among treatments: A) high energy diet; B) low energy diet; BL) low energy diet + 4,8 g/kg BW subcutaneous oLeptin, twice daily, for 56 days. Leptin concentration was determined with specific commercial ELISA kit (Cusabio). Blood from four heifer per group was sampled in six time points, one before and one after the hormonal treatment. Two days after puberty attainment , eight heifers per group were slaughter for tissue sampling. Gene expression was quantified in fat depots by real time PCR. The oLeptin increased transiently leptin concentration in group BL, with a peak (11,1 ± 1,4 ng/mL) after 7 days of treatment. Serum leptin in group A increased linearly in time, while in group B it remained constant (4,0 ± 2,0 ng/mL). Diet A enhanced leptin expression in the adipose tissue 2.4-fold, and oLeptin administration decreased de expression 2.5-fold, comparing to the control group. The decrease in LEP gene expression explains the reduction in serum leptin from group BL after 30 d of hormonal treatment. The objective with experiment 2 was to clone de codifying region of bovine leptin, transform KM71H Pichia pastoris yeasts, and express the protein in culture media. The leptin gene was amplified by PCR, from subcutaneous adipose tissue sample from a heifer in group A. Primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (forward) and 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT 3 (reverse), containing EcoRI and SalI restriction sites, were designed based in the mRNA sequence from bovine leptin (NM 173928.2), replacing the native secretion signal sequence by the -factor sequence from Saccharomyces cereviasiae. The insert was cloned in the expression vectors pPICZ&alpha;A and pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), and yeasts were transformed by electroporation. Clones with multiple copies of the gene were selected in YPD + 500 &#956;g/mL zeocina, and 22 recombinant colonies were selected for a small-scale expression analysis. pPICbLep colonies were initially cultivated in growth media (BMGY), and then transferred to the induction media (BMMY), containing methanol. The colonies were inducted for 144 h. Supernatant aliquots (200 &#956;l) were collected daily, for bLeptin analysis in SDS-PAGE. pGAPbLep colonies were cultivated in YPD media for 96 h, collecting supernatant samples each 24 h. Yeasts were successfully transformed with the plasmids pPICbLep and pGAPbLep, however, only pGAPbLep colonies expressed a protein with 35 kDa, twice the size expected for the bovine leptin (17 kDa), probably because of dimerization. More studies are necessary about the recombinant bovine leptin production processes in Pichia pastoris.