O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-γ, IL-2, TNF-α and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

Ce projet avait pour but la production de protéines recombinantes pour des procédures vaccinales dans un système végétal. Les protéines choisies ont été d'une part, deux protéines virales d'un Arterivirus, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), les protéines GP5 et M, et d'autre part une protéine du flagelle, la flagelline ou FljB de Salmonella typhimurium. Le PRRSV est responsable de pertes économiques majeures dans l'industrie porcine mondiale et l'efficacité des vaccins actuels contre ce virus est limitée. La protéine M a été choisie pour sa propriété à former un hétérodimère avec la protéine GP5 qui augmente la réponse immunitaire. La glycoprotéine GP5, quant à elle, possède deux épitopes dans sa région N-terminale dont un joue un rôle majeur puisqu' il est capable de stimuler la production d'anticorps neutralisants nécessaires à la clairance du virus. Enfin FljB, qui est une protéine bien conservée chez les bactéries Gram négatives, a été retenue pour ses propriétés adjuvantes intéressantes de par sa capacité à se lier au récepteur 5 de type toll (TLR5) et à induire des réponses immunitaires systémiques et mucosales. Les hypothèses pour cette étude étaient que la production d'une protéine recombinante M::GP5 intégrant trois mutations (M::GP5mut) à des sites stratégiques de celle-ci induirait une meilleure réponse immunitaire que la protéine GP5 sauvage ; que l'administration par voie orale de plante produisant la protéine M::GP5mut induirait une immunité protectrice contre le PRRSV ; que les propriétés adjuvantes de FljB produite chez Nicotiana benthamiana devraient être comparables à celles de FljB recombinante produite chez E. coli. Pour répondre à ces questions, un système transitoire d'expression chez N. benthamiana a été choisi. Il a l'avantage de pouvoir produire des protéines rapidement et à des niveaux élevés. L'immunogénicité de la protéine M::GP5mut, et les propriétés adjuvantes de la flagelline ont été testées dans un système murin. Dans le cas de la flagelline, l'ovalbumine (OVA) a été choisie comme immunogène. Peu de résultats ont été obtenus dans le cadre du projet des protéines du PRRSV du fait de l'absence de production de celles-ci à un niveau détectable bien que la présence des ARNm ait été confirmée. En revanche, pour FljB, il a été montré que l'administration par voie orale de celle-ci induisait une réponse immunitaire contre l'OVA d'une intensité égale à celle produite par l'administration du mélange OVA avec de la FljB recombinante produite par E. coli et supérieure à celle de l'OVA administrée seule. De plus, FljB recombinante produite dans N. benthamiana a permis d'obtenir une réponse plus précoce qu'avec l'utilisation de FljB recombinante produite chez E. coli. En conclusion, il a pu être montré grâce à FljB que le système de production utilisé était efficace et que FljB est un bon adjuvant qui conserve ses propriétés quand elle est produite chez N. benthamiana. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : PRRSV, FljB, expression transitoire, adjuvant, réponse immunitaire, Nicotiana benthamiana

Thèse (M.Sc)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 75-85. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 130-139. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-08-01T21:41:21Z No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Com cerca de 900.000 a 1,3 milhões de novos casos anualmente, a Leishmaniose é um complexo de doenças que pode ser fatal se não dada a devida atenção. Apesar de sua relevância na saúde pública, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a doença em humanos, e seu tratamento é caro e agressivo à saúde. O presente estudo tem como objetivo otimizar os parâmetros de indução do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em Escherichia coli recombinante. Dessa forma, para a indução foi utilizada a lactose nas concentrações de 0,1; 1,0 e 10 g/L, e o isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nas concentrações de 20,0; 100,0; 500,0 e 1000,0 M como moléculas indutoras em diferentes densidades celulares (densidade óptica a 600 nm de 0,5 e 1,0) de modo a analisar a influência do instante de indução no rendimento da proteína de interesse. Os resultados mostraram que a concentração de IPTG de 100,0 M foi a que mais favoreceu a produção do antígeno (0,087 g/L), sendo esta concentração de IPTG 10 vezes menor do que utilizada em trabalhos anteriores para esse tipo de sistema, e para a lactose foi a de 1,0 g/L (0,016 g/L). Dessa forma, a indução com 100,0 M de IPTG permitiu obter o antígeno 503 com uma concentração 5,6 vezes maior que a máxima obtida quando a lactose foi usada como indutor. / With nearly 900,000 to 1.3 million new cases annually, Leishmaniosis is a complex of diseases that can be fatal if not given proper attention. Despite its relevance in the public health system, there is no vaccine capable of preventing disease in humans so far, and its treatment is expensive and aggressive to human health. Vaccination remains the most practical and realistic way of fight against the disease, thus, the production of recombinant antigens as a pathway towards a vaccine acquisition is necessary. In addition, the optimization of the strategy of the recombinant antigen’s production is of interest so it can make the process viable. Therefore, the present study aims to optimize the induction parameters of the 503 Leishmania i. chagasi antigen expressed in recombinant Escherichia coli. Hence, the induction at different cell densities (optical density at 600 nm of 0.5 and 1.0) was evaluated in order to analyse the influence of the induction time on the yield of the protein of interest. In this segment, lactose and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) were used as inducer molecules, using various concentrations: 0.1 g/L, 1.0 g/L and 10 g/L for lactose and 20 μM, 100 μM, 500 μM and 1000 μM for IPTG. The results presented that the concentration of IPTG that obtained the higher antigen levels was that of 100 μM (0.087 g/L), a 10-fold lower concentration than was being previously used in this type of system, and for lactose it was 1 g/L (0.016 g/L). Thus, the induction with 100 μM allowed to obtain the antigen with a concentration 5.6 times higher than the lactose induction maximum concentration.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2007 / Bibliografia: f. 144-155 / O nascimento da Engenharia Genética constitui um marco para as Ciências, pois a partir do desenvolvimento desta técnica, também conhecida como técnica do DNA recombinante, tornou-se possível produzir os Organismos Geneticamente Modificados (OGM). Em 1996,

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-02T18:36:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) Previous issue date: 2005-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é caracterizada pelo aspecto geminado da partícula viral e genoma composto por DNA circular de fita simples, com aproximadamente 2.600 nucleotídeos. É dividida em quatro gêneros, de acordo com o tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização do genoma e relacionamento filogenético. Os begomovírus possuem dois componentes genômicos, são transmitidos por mosca-branca e infectam espécies dicotiledôneas. No Brasil há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro. Embora a importância econômica dos begomovírus em soja seja secundária, a ocorrência desses patógenos nesta cultura é preocupante. Duas possíveis novas espécies de begomovírus, denominadas “vírus A” e “vírus B” foram isoladas e clonadas a partir de plantas de soja. Obteve-se a seqüência completa de nucleotídeos do DNA-B do “vírus A”, e uma seqüência parcial do DNA-A do “vírus B”. A comparação de seqüências e análise filogenética indica que o DNA-B do “vírus A” possui a máxima correspondência nucleotídica com o isolado B3 do Sida micrantha mosaic virus (SimMV), e o DNA-A do “vírus B” com o isolado A2 do SimMV. Entretanto os níveis de identidade são baixos, indicando que ambos os vírus realmente devem constituir novas espécies de begomovírus. Vírus de plantas, incluindo os begomovírus, têm sido utilizados com sucesso na construção de vetores para a indução de silenciamento gênico. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e não há relatos para plantas de soja. Os dois componentes genômicos do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) encontram-se completamente seqüenciados e, o DNA-A foi utilizado para a construção do vetor viral pToR- A1.4 CP. A estratégia utilizada foi a construção de um clone infeccioso sem o gene da proteína capsidial, substituído por um sítio múltiplo de clonagem para 9 enzimas de restrição derivado do vetor pKS+. Este vetor viral baseado no ToRMV será um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional de tomateiro e de soja, na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos. / The Geminiviridae is a family of plant viruses characterized by twinned icosahedral viral particles and a circular single-stranded DNA genome, with approximately 2.600 nucleotides. It is divided into four genera according to the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogenetic relationships. Begomoviruses have two genomic components, are transmitted by whitefly and infect dicotyledoneous species. In Brazil, begomoviruses cause serious losses in tomato and bean crops. Although the economic importance of the begomoviruses in soybean is secondary, the presence of these pathogens in this crop is cause of concern. Two possible new begomovirus species, named “virus A” and “virus B”, were isolated and cloned from soybean plants. The complete nucleotide sequence of the DNA-B from “virus A” and a partial sequence of the DNA-A from “virus B” were obtained. Sequence comparisons and phylogenetic analysis indicated that the DNA-B from “virus A” has a maximum nucleotide identity with the isolate B3 from Sida micrantha mosaic virus (SimMV), and that the DNA-A from “virus B” with the isolate A2 from SimMV. However, identity levels are low, indicating that both viruses could actually comprise novel begomovirus species. Plant viruses, including begomoviruses, have been used with success for the construction of vectors for the induction of gene silencing. However, there are few effective vectors for inoculation into tomato plants and none for soybean plants. Both genomic components of Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) have been completely sequenced and, the DNA-A was used for the construction of the viral vector pToR-A1.4 CP. The strategy used was the construction of an infectious clone without the capsid protein gene, replaced by a multiple cloning site for 9 restriction enzymes, derived from the pKS+ plasmid vector. This viral vector will be a complement and an alternative in functional genomics of tomato and soybean plants, in the analysis of genes involved in various biological processes. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-01-20T13:50:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T13:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta pesquisa, estudamos o tempo de eficiência das insulinas de DNA recombinante via modelos para os testes de vida acelerados. Para isso, foi avaliada, periodicamente, a perda de potência dessas insulinas, submetidas às condições de temperatura de 8ºC, 25ºC e 37ºC, inseridas num contexto de ensaios acelerados. Essa proposta envolveu a utilização da metodologia para os testes de vida acelerados em estudos de dados reais através dos softwares R e Minitab. Ela teve como objetivos: o estudo da influência da temperatura no tempo da perda de potência das insulinas; a aplicação de técnicas gráficas e do teste da razão de verossimilhança para escolha do modelo que melhor se ajuste aos dados; a extrapolação das estimativas obtidas em momentos de estresse para as condições normais de uso e a apresentação ao mundo acadêmico de uma aplicação desses testes aos dados reais da engenharia genética. A análise, de abordagem classica, tomou como referência os estudos de alguns pesquisadores que, para tratar a censura intervalar presente nos dados, passaram a considerar os intervalos censurados como tempos exatos de falha. Os resultados mostraram que, por meio dos testes de vida acelerados, os fabricantes não só serão capazes de produzir insulinas com mais qualidade e confiabilidade, em tempo recorde, bem como poderão ter os prejuízos minimizados por calcular o prazo de garantia e a validade desses produtos com estimativas de tempos de falha confiáveis, oferecendo, assim, produtos com mais eficiência. / Dans cette recherche, nous étudions la durée (le temps) de éfficacité de lºinsuline dºADN recombinant par les modeles de testes de vie accélérés. Raison pour laquelle a été avaliée, périodiquement, la perte de lºefficacité de ces insulines que sont sumises a des conditions de température de 8ºC, 25ºC et 37ºC, inserées dans un contexte de testes accélérés. Cette proposition a impliquée lºutilisation de la méthodologie par les testes de vie accélérés et les études de données réelles par moyen softwares R et Minitab. Ayant ainsi pour objectifs: lºétude de lºinfluence de la temperature au moment de la perte dºefficacité des insulines; lºapplication de techniques graphiques et du teste de la raison de vraissemblance pour le choix du modele que mieux sºajuste aux données; lºextrapolation des estimatives obtenues au moment du stress (tension) pour les conditions normales dºusage et la présentation au monde académique dº une application de ces testes aux données réelles de lº ingénierie génétique. Lºanalyse, de lºapproche classique, a pris pour référence les études de quelques chercheurs qui pour traiter la censure entre intervale présent dans les données, sont passés a considérer les intervales censurées comme temps exacte de faille. Les résultats ont montré que, par moyen de testes de vie accélérés, les fabricants ne seront pas seulement capables de produire des insulines de bonnes qualités et fiables, en temps record, mais aussi aurons leurs préjudices assez minimisés en ce qui concerne le délai de validité de ces produits avec les estimatives de la durée de faille confiable, tout en offrant ainsi, de produits plus efficace. / We have studied in the present research the efficiency rate of recombinant DNA insulin through models for accelerated life testing. For this purpose, we have periodically assessed the power loss for this type of insulin when it is subjected to temperature conditions of 8ºC, 25ºC, and 37ºC, and inserted in a context of accelerated life testing. This plan involved the use of a methodology for accelerated life testing and real data study by means of the softwares R and Minitab. This research had as its objectives: the study of the influence of temperature on the rate of insulin power loss; the application of graphical techniques and of likelihood-ratio testing in choosing the best suited model for the data; the extrapolation of estimations made in moments of stress to include normal usage conditions, and the presentation to academia of an instance of application of these tests to a real data from genetic engineering. The analysis, which was made in a classical approach, had as reference the research of a number of researchers-who, in order to cope with the interval censoring in the data, started to consider the censored intervals to be exact failure times. The results show that by means of the accelerated life tests not only the manufacturers will be able to produce insulin in record time with greater quality and reliability, but they will also manage to incur minimized losses, given that they will have the ability to calculate their products” dates of expiration and warranty periods based on reliable failure times and, therefore, to provide more efficient products. / Sem lattes

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein which stimulates the erythropoiesis (production of hemaceas) and is clinically used for the treatment of renal anemia. EPO formulations present usually elevated contamination by aluminum. Aluminum is known to participate in the pathogenesis of osteodystrophy and encephalopathy associated with chronic hemodialysis, and has been proposed to be involved in central nervous system degeneration diseases such as Alzheimer s diseases. In the present work, the presence of Al as contaminant in erythropoietin formulations consumed by chronic renal patients, was investigated by developing and optimizing a chromatographic method for separation and determination of proteins, with subsequent collection of fractions and measured of the Al present by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF AAS). As the commercialization of pharmaceutical forms of EPO are in glass containers with rubber cap (bottle, vial or syringe), it was investigated the ability of the constituents of EPO formulations (salts, amino acids, urea, and mannitol among others) to promote the extraction of aluminum present in both glass and rubber. The tests were performed considering the process of sterilization and the contact of the solutions during storage. The results demonstrated that the interaction of EPO with aluminum is higher than that of albumin (the other proteic constituent). Among the other constituents, citric acid and citrate presented the highest interaction. For each constituent there is probably a different mechanism for the release of aluminum from glass and rubber, but all constituent of EPO formulations interacted with glass and rubber packaging, leading to their contamination by aluminum. As the level of contamination by aluminum in commercial formulations of erythropoietin was determined, and it was observed that the lyophilized powder presented the lowest contamination by aluminum, this form must be the choice for renal patients, due to the susceptibility of these patients to aluminum toxicity. / A eritropoetina (EPO) é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese (produção das hemáceas) e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à insuficiência renal crônica. Formulações de eritropoetina apresentam geralmente uma elevada contaminação por alumínio, que é um metal extremamente tóxico para pacientes com insuficiência renal. Este metal é relacionado a doenças neurológicas e ao comprometimento da estrutura óssea dos pacientes, podendo causar a morte se administrado cronicamente ou em concentrações elevadas aos pacientes. Alguns autores também relacionam o desenvolvimento de doenças degenerativas como a doença de Alzheimer com intoxicação por alumínio. A presença do alumínio em formulações farmacêuticas destinadas ao tratamento da insuficiência renal e nutrição parenteral é um problema sério devido a toxicidade do alumínio e ao contato direto com o sangue do paciente. Em nosso laboratório, nos dedicamos a estudar a origem do aluminio nestas soluções e de que modo ele interage com os seus constituintes. No presente trabalho, investigou-se a presença de Al como contaminante em formulações farmacêuticas de eritropoetina consumida por pacientes renais crônicos através do desenvolvimento e otimização de um método cromatográfico para separação e determinação de proteínas, com posterior coleta de frações e medidas do Al presente por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GF AAS). Como as formas farmacêuticas de comercialização da EPO são em recipientes de vidro com tampa de borracha (frasco-ampola ou seringas), investigou-se a capacidade dos constituintes das formulações de EPO (sais, aminoácidos, uréia e manitol entre outros) em promover a extração do alumínio presente tanto no vidro quanto na borracha. Os ensaios foram realizados considerando o processo de esterilização e o contato das soluções durante o período de armazenamento. Os resultados encontrados demonstraram que a EPO apresenta maior interação com o alumínio que a albumina (o outro constituinte proteico das formulações). Entre os outros constituintes, o ácido cítrico e o citrato apresentaram a maior interação. Para cada constituinte há provavelmente um mecanismo diferenciado de liberação de Al do vidro e da borracha, porém todos os constituintes das formulações de EPO interagiram com o vidro e a borracha, levando a contaminação destas por alumínio. Como foi determinado o nível de contaminação por alumínio das formulações de eritropoetina comerciais, observou-se que a forma farmacêutica de pó liofilizado apresentou menor contaminação por alumínio devendo, portanto, ser a forma de escolha para os pacientes renais, tão sucetíveis a toxicidade do alumínio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3461.pdf: 3248917 bytes, checksum: b02925f28a9fc50ea71c3af6beebca5c (MD5) Previous issue date: 2011-03-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The desintegrinas are cys-rich polypeptides without enzymatic activity, some found in snake venoms with an adhesive motif to integrin, unleashing distinct responses. Several research groups have been studying snake venom disintegrins with focus in pharmacological applications in tumor progression and proliferation, angiogenesis, blood clotting, and osteoporosis. This work shows the results of the construction of cDNA library of Rhinocerophis alternatus venom gland, cloning and expression of ALT-C, a disintegrina-like protein, in bacterial system. The library was comprised of 812 sequences that were classified into: (i) coding for hypothetical protein or mismatched in databases (unknown) corresponding to 20.94%; (ii) transcripts for cellular process 17.86%; and (iii) transcripts coding for toxic protein with 61.21%. Among toxic proteins the SVMPs were the most abundant transcripts 58.59%. Other toxic transcripts were C-type lectins (15.56%), bradykinin potentiating peptides (11.8%), serineproteases (5.18%), cys-rich secretory proteins (2.28%), vascular endothelial growth factors (2.28%), L-amino acid oxidases (1.86%) and phospholipases A2 (1.45%). The percentages correspond to this snake venom effects, low enzymatic activity and hemorrhagic and clotting activity as main action, derived from the SVMPs, C-type lectin and serineproteases. One of the SVMPs contigs were chosen based on the similarity with ALT-C, the defined sequence was called ALT-Ch (ALT-C homologue) since there has 4 conservative substitutions compared to the previously determined sequence. The ALT-C-h sequence was used in PCR to inclusion the restriction site for BamHI and EcoRI, cloned in pGEX4T-1 and transformed into E. coli AD494 (DE3) for expression. The cell culture was grown until the log fase and induced with IPTG for 3 hours, the expressed protein's identity was confirmed by Western Blotting using Polyclonal antibody Anti-ALT-C. The construction of the R. alternatus venom gland cDNA library provides a source of interesting active biomolecules, such as desintegrinas, to pharmacological applications in pathologies involving integrins like angiogenesis, tumor progression and metastasis. / As desintegrinas são polipeptídeos sem atividade enzimática, ricos em cisteína, geralmente encontrados no veneno de serpentes, possuidoras de um motivo adesivo reconhecedor de integrinas antagonizando ou agonizando a atividade das mesmas. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando desintegrinas de venenos de serpentes com o foco em aplicação farmacológica nos processos de progressão e proliferação tumoral, angiogênese, coagulação sanguínea, e osteoporose. Este trabalho apresenta os resultados da construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Rinocerophis alternatus e a clonagem e expressão da ALT-C, uma tipo desintegrina, em sistema bacteriano. A biblioteca foi composta por 812 sequências que foram classificadas em: (i) codificantes para proteínas hipotéticas ou sem equivalência nos bancos de dados (unknown) correspondendo a 20,94%; (ii) transcritos para produtos celulares 17,86%; e (iii) transcritos codificantes para proteínas tóxicas 61,21%. Dentre as proteínas tóxicas as SVMPs foram os transcritos mais abundantes com 58,59% dos compostos tóxicos do tecido. Os demais transcritos tóxicos encontrados foram as lectinas do tipo-C (15,56%), peptídeos potenciadores de bradicinina (11,8%), serinoproteases (5,18%), proteínas secretórias ricas em cisteína (2,28%), fatores de crescimento endotelial vascular (2,28%), L-aminoácido oxidases (1,86%) e fosfolipases A2 (1,45%). As percentagens encontradas correspondem aos efeitos do veneno dessa serpente, que possui baixa atividade enzimática e predominate ação hemorrágica e de alteração na coagulação sanguínea derivada da ação das SVMPs, lectinas do tipo-C e serinoproteases. Um dos contigs para SVMPs foi eleito pela similaridade com a ALT-C. A sequência determinada por esse contig foi denominada ALT-C-h (homóloga da ALT-C) por apresentar 4 substituições conservativas da sequência determinada anteriormente. A sequência foi utilizada em PCR para inclusão de sítio de restrição para BamHI e EcoRI, clonado em pGEX4T-1 e transformados em E. coli AD494(DE3) para ensaios de expressão. O cultivo foi crescido até a fase log e a indução expressão realizada com IPTG por 3 horas, a identidade da proteína expressa foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-ALT-C. A construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de R. alternatus fornece uma fonte de estudo interessante de biomoléculas ativas nos venenos como, por exemplo, as desintegrinas visando aplicações farmacológicas para patologias envolvendo integrinas como angiogênese, progressão e metástase tumoral.