Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJUR.pdf: 1290933 bytes, checksum: 72ad2925663cff469dc6dc50316dbf22 (MD5) Previous issue date: 2005-02-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are snake venom proteins used in the study of integrin-mediated cellular adhesion through integrins. Recombinant disintegrin production may notable supply faster, larger and most homogeneous protein samples than bruit venom processing. This work describes optimization of the recombinant ACLD-C expression technique. ACLD-C is a disintegrin-like protein from Agkistrodon contortrix laticinctus, that have a disintegrin-like domain with DCD motif, and a cysteine-rich domain. This protein was subcloned from the ACLD clone (GenBank U86634), a metallopeptidase. A protocol of expression was established in our laboratory, where recombinant ACLD-C is produced in E. coli, using the expression vector pMal-p. This allows protein target expression in form of N-terminal fusion with MBP (maltose-binding protein), that facilitate purification, correct folding and production of disintegrin in soluble form. In fact, MBP/ACLD-C was was expressed in soluble form and purified in two stages: affinity comatography in amilose resin and cromatography of gel-filtration in superdex-200 resin. Modifications in expression protocol optimized MBP/ACLD-C expression in culture of 0,4 mg/L of culture of 1,2 mg/L (12,6% total of protein in periplasmic space of E.coli). MBP/ACLD-C imobilizated in amilose resin was subjected to digestion with enzyme factor Xa to separate ACLD-C of MBP. The separation was confirmed through positive reaction with anti-ALT-C antibody. ALT-C is a disintegrin-like protein from Bothrops alternatus. ALT-C induced both expression of VEGF in human fibroblasts and proliferation of endothelial cells and angiogenesis. In second part of this work, we investigated if MBP/ACLD-C was also able to induce the expression of this growth factor in this cells. MBP/ACLD-C and two other disintegrins, echistatina, a disintegrin-RGD, and EC6, a heterodimeric disintegrin, were incubated with fibroblasts. The influency of these proteins in VEGF expression was evaluated by ELISA. MBP/ACLD-C was able to strongly induce the expression of VEGF until 4 hours, when the level decreased until 24 hours. Experiment in period of 24 48 hours was not done due to problems of contaminations. Echistatin did not induced VEGF expression, but induced fibroblasts dettachment from plastic. The latter event was not observed in MBP/ACLD-C or EC6 incubated cells. / As desintegrinas são proteínas de veneno de serpente usadas no estudo de processos biológicos envolvendo a adesão celular mediada por integrinas. A produção de desintegrinas recombinantes é de grande importância para tais estudos, pois podem ser obtidas de forma mais rápida, com maior rendimento e qualidade mais constante quando comparada com a obtenção a partir de veneno bruto. Esta dissertação descreve a otimização da expressão da ACLD-C recombinante. ACLD-C é uma proteína tipo desintegrina da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus, que possui um domínio desintegrina-like com um motivo DCD e um domínio rico em cisteína. Esta proteína foi subclonada a partir do clone da ACLD (GenBank U86634), uma metalopeptidase. Um protocolo de expressão foi estabelecido em nosso laboratório, onde ACLD-C recombinante é produzida em E. coli, utilizando-se o vetor de expressão pMal-p. Este vetor possibilita a expressão da proteína-alvo na forma de fusão Nterminal com a proteína MBP (maltose-binding protein), a qual facilita a purificação, o enovelamento correto e a produção da desintegrina na forma solúvel. De fato, MBP/ACLD-C foi expressa na forma solúvel e purificada em duas etapas: cromatografia de afinidade em resina de amilose e cromatografia de gel-filtração em resina superdex-200. Modificações no protocolo de expressão permitiram a otimização da expressão da MBP/ACLD-C de 0,4mg/L de cultura para 1,2mg/L de cultura O rendimento final da MBP/ACLD-C foi de 1,2mg/L de cultura (12,6% do total de proteínas no espaço periplásmico de E. coli). MBP/ACLD-C imobilizada em resina de amilose foi submetida à reação de clivagem com a enzima fator Xa para separar ACLD-C da MBP. A separação foi confirmada através da reação positiva ao anticorpo anti-ALT-C, uma desintegrina-like de Bothrops alternatus. Estudos com ALT-C mostraram que ela foi capaz de induzir a expressão de VEGF (vascular endothelial growth factor) em fibroblastos humanos e induzir a proliferação de células endoteliais e a angiogênese. Assim, resolveu-se investigar se MBP/ACLD-C também é capaz de induzir a expressão deste fator de crescimento nestas células, o que constitui a segunda parte deste trabalho. MBP/ACLD-C e outras duas desintegrinas, echistatina, uma desintegrina-RGD, e EC6, uma desintegrina heterodimérica, foram incubadas com os fibroblastos para verificar a influência dessas proteínas na expressão de VEGF através de ensaios de ELISA. MBP/ACLD-C foi capaz de induzir fortemente a expressão de VEGF até 4h, quando o nível da citocina decresceu até 24 e novamente aumentou até 48h. EC6 também foi capaz de induzir a expressão do fator de crescimento até 4h, quando o nível também decresceu até 24h. O experimento no período de 24h-48h não foi realizado devido a problemas de contaminação. Echistatina, por sua vez, não apresentou indução de VEGF em relação ao controle, e as células incubadas com essa desintegrina desaderiram do plástico, o que não ocorreu com as outras duas proteínas.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000793411.pdf: 2869881 bytes, checksum: dde8b87e326aaccf874b6b62350ca99d (MD5) / O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein

Les gènes synthétiques des lectines des algues marines rouges Hypnea musciformis (HML) et Bryothamnion triquetrum (BTL) ont été clonés dans différents vecteurs et transformés dans plusieurs souches bactériennes d’expression. Les lectines recombinantes ont été obtenues dans la fraction soluble de cultures bactérienne dans les souches d’Escherichia coli Rosettagami 2 (DE3) pour rHML et BL21 (DE3) pour rBTL. Les tests d'hémagglutination ont montré que rHML et rBTL sont capables d’agglutiner les érythrocytes de lapin avec un bon pouvoir hémagglutinant mais seulement après traitement à la trysine et la papaine indiquant que leur ligands ne sont pas directement accessibles à la surface des hématies. Les propriétés hémagglutinantes de rHML et de rBTL confirment le repliement correct et l'état fonctionnel des protéines. La caractérisation de leur spécificité sur puces à sucres a montré une spécificité stricte de HML, BTL et rBTL pour les oligosaccharides complexes comportant la fucosylation (α1-6) du noyau, avec une préférence particulière pour les N-glycanes non bissectés, bi- et tri-antennés de chaîne courte. La présence d’acide sialique à l'extrémité non réductrice du glycane favorise la reconnaissance de ces glycanes. C'est la première caractérisation des lectines d’algues rouges par puce à sucres. Des expériences de STD-RMN menées sur BTL, ont montré son interaction avec un octasaccharide au niveau de noyau fucosylé (α1-6). L'activité toxique des lectines sauvages et recombinantes a été évaluée contre Artemia sp. et contre des cellules d'adénocarcinome du poumon (A549). Dans les essais de cytoxicité, HML, rHML, BTL et rBTL n’ont montré aucune toxicité contre Artemia sp. et seulement HML et rHML ont montré une cytotoxicité faibles contre les cellules d’adénocarcinome du poumon (A549). Le premier cristal de rBTL a été obtenu à l'aide d'un robot de cristallisation et diffractait à 15 Å. / Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into different vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosettagami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Å.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:29:48Z : No. of bitstreams: 1 pesquero_nc_me_araiq.pdf: 1328191 bytes, checksum: b43c0dd0e4c51db5570dd9acd342760e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No presente trabalho foi avaliada a equivalência entre as formas nativa e recombinante da lectina Artin M utilizando como ligante a peroxidase de raiz forte (HRP) por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo. Para tal foi preparado um biossensor por meio da imobilização da lectina, tanto nativa como recombinante, na superfície do cristal de quartzo piezelétrico. A imobilização das lectinas foi realizada por meio da construção de uma monocamada auto organizada utilizando dois alcanotióis, ácido 11-mercaptoundecanóico e o 2-mercaptoetanol. Para o acoplamento das proteínas foram utilizados N-etil-N- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidoxisuccinimida (NHS) que formam com os grupamentos carboxílicos um intermediário reativo. Após a preparação do biossensor foi utilizado um sistema de injeção em fluxo acoplado à microbalança de cristal a quartzo para o estudo da interação lectina-glicoconjugado. Desta forma, as interações da Artin M nativa e recombinante com a glicoproteína peroxidase de raiz forte foram estudadas por meio da determinação das suas constantes de afinidade aparente e de associação cinética, sendo que foram encontrados os valores de constante de afinidade aparente (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP, e os valores de constante cinética (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP. Os valores das constantes de interação obtidos evidenciaram a equivalência entre ambas as formas da lectina Artin M. Neste trabalho também foi determinada a constante de associação cinética da interação entre a lectina Artin M recombinante e linhagens celulares de leucemia mielóide aguda humana (NB4, K562 e U937), no intuito de melhor entender a diferença na citotoxicidade observada da Artin M sobre estas células... / In the present work was evaluated the equivalence between the native and recombinant forms of Artin M using horseradish peroxidase as ligand by means the quartz crystal microbalance technique. In this way, a biosensor was prepared immobilizing the lectin, native and recombinant forms, on piezoelectric quartz crystal surface. Lectins immobilization was realized constructing self assembled monolayers using the alkanethiols 11-mercaptoundecanoic acid and 2-mercaptoethanol. To the binding of proteins was used N-ethyl-N-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), which form with carboxylic groups a reactive intermediary. After biosensor preparation was utilized a flow injection system coupled to quartz crystal microbalance to study the lectin-glycoconjugated interaction. Thus the native Artin M and recombinant Artin M interaction with horseradish peroxidase glycoprotein were studied by determining its apparent affinity constant and association kinetic constants. The values obtained to apparent affinity constant were (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions, and the values obtained to association kinetic constant were (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions. These constant values evidence the equivalence between native and recombinant forms of Artin M lectin. During this work were also determined the association kinetic constant of the interaction between recombinant Artin M and leukemic lineages from human acute myeloid leukemia (NB4, K562 and U937), with the purpose of a better understanding in the different cytotoxic effect of Artin M on these cells. In this way the values of association kinetic constant obtained was (0,3 ± 0,1) x 10-7 , (0,9 ± 0,1) x 10-7 e (2,7 ± 0,3) x 10-7 mL cel -1 to the interactions between Artin M and NB4, K562 and U937, respectively

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGMCS.pdf: 2717580 bytes, checksum: ff4f01b1bf27d70757eb37ee1960edef (MD5) Previous issue date: 2004-06-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Disintegrins are proteins present in the poison of serpents that have been calling the pharmaceutical industry attention due to their capacity to prevent the progression of cancerous cells. A receiving key-protein called integrin addresses the formation of new blood vessels instructing the tumor cells to increase and spread. The disintegrin acts as an inhibitor that blocks this interaction. In order to produce substantial amounts of disintegrin in industrial scale, its expression in CHO-K1 cells was carried out by cloning the characteristic DNA extracted from the poison producing glands of the serpent Agkistrodon contortrix laticinctus. Usually CHO-K1 cells are cultivated in medium containing bovine fetal serum. However, its presence in the cultivation medium hinders the stages of detection, extraction and purification of the protein of interest. The objective of this work was to study the CHOZMD cell growth and the desintegrin production in serum free medium, as well as to develope a methodology for the detection and quantification of the disintegrin present in the medium. The cultivations were carried in culture bottles of 25cm2, 75cm2 and 150cm2 and later in spinner flask with a volume of 500mL, incubated with an amount of CO2 controlled in 10% v/v, pH between 7.0 to 7.4, a temperature of 37 °C, under agitation conditions. The cells were cultivated in the presence of the microcarrrier Pronectin F which enables the attainment of high cell concentration. The culture media DMEM and CHO-S-SFM II were used in the cultivations by means of a gradual adaptation process for a serum free medium, through the reduction of DMEM+serum proportion at each change, until that it was totally replaced by the serum free medium. The cells were maintained in 100% serum free medium during 6h with the withdrawal of 250 ml after 3 h and of the remaining volume after 6h of cultivation. For the detection of the disintegrin, the samples were initially filtered in Milipore filter, then concentrated in ultra filter Amicon and finally centrifuged in membranes Centriprep and Centricon. The disintegrin, protein of ~70kDa, present in the treated samples was detected using Bio Dot equipment with nitrocelulose membrane incubated with specific antibodies. The samples were applied in ion exchange column and the fractions obtained applied in nitrocelulose membrane. In the cultivations carried out in serum free medium with the microcarrier Pronectin F a maximum cell concentration of 1.74.106 cel.ml-1 was reached, which is slightly inferior to the value reached in the cultivations in medium containing serum (2.7.106 cel.mL-1). However, concerning product formation, the immunodetecion results revealed the presence of the disintegrin in the cultivations carried out with serum free medium. Cultivations carried out in spinner flask, with a volume of 200mL and using microcarrier Citodex 1 and medium supplemented with 1% hemolymph (v/v) presented maximum cell concentration of 2.6.106 cel.mL-1. The detection method developed was effective in the identification of the target protein in the samples from the cultivation medium containing hemolymph. Preliminary tests demonstrated loss of protein might be related to gradual degradation in cultivation medium or retention in ion exchange column. / Desintegrinas são proteínas presentes no veneno de serpentes que têm despertado interesse da indústria farmacêutica por sua capacidade de impedir a progressão de células cancerígenas. Uma proteína-chave receptora chamada integrina direciona a formação de novos vasos sangüíneos instruindo as células do tumor a crescerem e se espalharem. A desintegrina atua como um inibidor que bloqueia essa interação. Para que quantidades substanciais de desintegrina possam ser produzidas em escala industrial, realizou-se a expressão da mesma em células CHO-K1, produzidas por clonagem do ADN característico retirado das glândulas produtoras do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus. Normalmente as células CHO-K1 são cultivadas em meio contendo soro fetal bovino. No entanto, a presença do mesmo no meio de cultivo dificulta as etapas de detecção, extração e purificação da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi estudar o crescimento de células CHO-K1 e a produção da desintegrina em meio livre de soro, assim como desenvolver uma metodologia para a detecção e quantificação da desintegrina presente no meio. Os cultivos foram realizados em garrafas de cultura de 25cm2, 75cm2 e 150cm2 e posteriormente em frasco spinner com um volume de 500mL, incubados em estufa com uma quantidade de CO2 controlada em 10% v/v, pH entre 7,0 a 7,4, a uma temperatura de 37 °C em condições de agitação brandas. As células foram cultivadas na presença do microcarrregador sólido Pronectin F, que possibilita a obtenção de uma alta concentração de células. Os meios de cultura DMEM e CHO-S-SFM II foram utilizados nos cultivos por um processo de adaptação gradual para um meio livre de soro, reduzindo-se a proporção de meio com soro a cada troca, até que fosse totalmente substituído para o meio livre de soro. As células foram mantidas em meio 100% livre de soro durante 6 h com a retirada de 250 ml após 3 h e o restante após 6 h de cultivo. Para a detecção da desintegrina, as amostras foram primeiramente filtradas em filtro Millipore e o filtrado concentrado em ultrafiltro Amicon e centrifugadas em membranas Centriprep e Centricon. A desintegrina, proteína de ~70KDa presente nas amostras tratadas, foi detectada utilizando-se equipamento Bio Dot em membrana de nitrocelulose incubada com anticorpos específicos. As amostras foram aplicadas em coluna de troca iônica e as frações obtidas aplicadas em membrana de nitrocelulose. Nos cultivos realizados em meio livre de soro com o microcarregador Pronectin F foi atingida uma concentração celular máxima de 1,74.106 cel.ml-1, a qual é ligeiramente inferior ao valor alcançado nos cultivos em meio contendo soro (2,7.106 cel.mL-1). Entretanto no que se refere à formação do produto o resultado na membrana de nitrocelulose evidencia a presença da desintegrina no meio de cultivo livre de soro. Cultivos realizados em meio suplementado com 1% v/v de hemolinfa apresentaram concentração celular máxima de 2,6. 106 cel.mL-1 em frasco Spinner, com um volume de 200mL e utilizando microcarregador Citodex 1. O método de detecção desenvolvido foi efetivo na identificação da proteína de interesse nas amostras retiradas do cultivo em meio contendo hemolinfa. Testes preliminares demonstraram que a proteína pode estar degradando gradativamente em meio de cultivo ou ficando retida na coluna de troca iônica.

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Claudia Esther Alicia Rocio Hassan / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Resumo: O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Abstract: Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein / Mestre

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MichelleRFV.pdf: 525804 bytes, checksum: d94754591de23bce5b0b460d3e10d382 (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / With advent of the technology of the recombinant DNA, the recombinant protein expression becomes an important tool in the studies of the structure, function and identification of new proteins, mainly with therapeutical purposes. The Escherichia coli has been procarioto predominant in the studies of genetic engineering due to wealth of information regarding its metabolism. Despite the expressivo advance of the studies of molecular biology and the immunology of the infections, it does not exist, currently, no prophylactic drug capable to prevent calazar. Of this form, it exists a great necessity of specific antigen identification for the vaccine development and kits for disgnostic against the visceral Leishmaniose. In this context, this work objectified to study the recombinant antigen expression of the Leishmania chagasi during the culture of Escherichia coli in shaker. A first set of assays was carried through with the objective of if knowing the kinetic behavior of the growth of two clones recombinant proteins (eIF, LACK) in two different compositions of culture medium (2xTY, TB) supplemented by antibiotics, without IPTG addition. In the second stage of the assays, the procedure of induction for IPTG was carried through, in order to verify the influence of the composition of the ways tested in the expression them recombinant proteins. On the basis of the gotten results, can be observed that the high complexity of culture medium favored the kinetic one of growth of clones recombinant (eIF, LACK), however, to if to deal with the assays submitted to the procedure of induction for IPTG, the raised complexity of culture medium did not favor the expression of recombinant proteins. On the other hand, they had been gotten resulted positive for all clones recombinant (eIF, LACK) tested, confirmed through the eletrofor?tico profile / Com advento da tecnologia do DNA recombinante, a express?o de prote?nas recombinantes torna-se uma ferramenta importante nos estudos da estrutura, fun??o e identifica??o de novas prote?nas, principalmente com finalidades terap?uticas. A Escherichia coli tem sido o procarioto predominante nos estudos da engenharia gen?tica devido ? riqueza de informa??es a respeito do seu metabolismo. Apesar do avan?o expressivo dos estudos da biologia molecular e da imunologia das infec??es, n?o existe, atualmente, nenhuma droga profil?tica capaz de prevenir o calazar. Desta forma, existe uma grande necessidade de identifica??o de ant?genos espec?ficos para o desenvolvimento de vacinas e kits para diagn?sticos contra a Leishmaniose visceral. Neste contexto, este trabalho objetivou estudar a express?o de ant?genos recombinantes da Leishmania chagasi durante o cultivo de Escherichia coli em incubador rotativo (shaker). Um primeiro conjunto de ensaios foi realizado com o objetivo de se conhecer o comportamento cin?tico do crescimento dois clones recombinantes (eIF, LACK) em duas diferentes composi??es de meios (2xTY, TB) suplementados por antibi?ticos, sem adi??o de IPTG. Na segunda etapa dos ensaios, foi realizado o procedimento de indu??o por IPTG, a fim de verificar a influ?ncia da composi??o dos meios testados na express?o das prote?nas recombinantes. Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que a elevada complexidade do meio de cultivo favoreceu a cin?tica de crescimento dos clones recombinantes (eIF,LACK), no entanto, ao se tratar dos ensaios submetidos ao procedimento de indu??o por IPTG, a elevada complexidade do meio de cultivo n?o favoreceu a express?o das prote?nas recombinantes. Por outro lado, foram obtidos resultados positivos para todos os clones recombinante (eIF, LACK) testados, confirmada atrav?s do perfil eletrofor?tico

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar as ligaÃÃes β-(1,4)-glicosÃdicas presentes em biopolÃmeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarÃdeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterÃlogos e a proteÃna recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relaÃÃo ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinaÃÃo de esporos/conÃdios de fungos filamentosos. A seqÃÃncia de DNA codificando a proteÃna foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressÃo pET32a(+) e pPICZαA, para expressÃo heterÃloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressÃo de rVuChi em cÃlulas de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusÃo. Em seis estirpes de P. pastoris a proteÃna recombinante foi secretada, de forma solÃvel, para o meio de cultura. Na fraÃÃo extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolÃtica, apÃs 72 horas de induÃÃo. A detecÃÃo de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequÃncia N-terminal e a ausÃncia de N-glicosilaÃÃo foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fraÃÃo F0/40 precipitada com sulfato de amÃnio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interaÃÃes hidrofÃbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltraÃÃo em membrana com limite de exclusÃo de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolÃtica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora nÃo tenha apresentado atividade contra substratos sintÃticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusÃo molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis âspotsâ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestÃvel em temperaturas atà 50 ÂC e sua atividade enzimÃtica mÃxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presenÃa de Ãons metÃlicos causou uma reduÃÃo de sua atividade enzimÃtica. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimÃtica enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hÃlice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroÃsmo circular. A desnaturaÃÃo de 50% das molÃculas de rVuChi ocorreu a 54,41 ÂC. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna produzida em P. pastoris estava em sua conformaÃÃo totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijÃo-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinaÃÃo de esporos de Penicillium herquei atà 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibiÃÃo de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibiÃÃo de 55% na germinaÃÃo dos conÃdios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinaÃÃo dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinaÃÃo de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. AlÃm disso, a proteÃna recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porÃm nÃo apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata à uma proteÃna com atividade antifÃngica. / Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50  C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41  C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity.

A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3β da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3β. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3β of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3β protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.