Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.

A função e a arquitetura dos genes está começando a ser elucidada a partir do estudo de genomas completos tanto de procariotos como de eucariotos. Diversos estudos foram ultimamente realizados a respeito de exon shuffling do ponto de vista evolutivo, fenômeno relacionado à origem de novos genes através de recombinações de DNA mediadas por introns. Apesar de eventos de exon shuffling serem responsáveis pelo aumento da modularidade gênica, outros processos foram desenvolvidos ao longo da evolução para que houvesse o aumento da diversidade do proteoma sem a conseqüente expansão dos genomas, sendo splicing alternativo um dos mais freqüentes. Apresentamos nesta dissertação duas extensivas análises: 1) a análise de uma base de dados de genes eucarióticos contendo pelo menos um intron que apresentou excesso de introns de fase 0 e exons simétricos, dados que suportam exon shuffling como um importante mecanismo de evolução gênica. Avaliamos também a confiabilidade de introns preditos por programas de computador através de alinhamento de ESTs; e 2) a análise do uso alternativo de exons (UAE), um tipo de splicing alternativo, em transcritos humanos detectando que cerca de 51% dos genes humanos possuem mais de uma variante de splicing e que este tipo de processamento pós-transcricional parece ser mais freqüentemente encontrado em tecidos tumorais. / Abstract not available.

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite β-lactoglobulina, α-caseína, β-caseína e κ-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de β-caseína e β-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou κ-caseína além da β-caseína e β-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de β-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P<0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P>0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P>0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax®) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da β-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL. / Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as β-lactoglobulin, α-casein, β-casein and κ-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel®. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed β-lactoglobulin and β-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed β-lactoglobulin, β-casein and κ-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of β-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P<0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P>0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P>0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax®) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of β-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids.

O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópias do vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína. / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of Hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factors or recombinant protein produced in murine cells. Coagulation therapy based on these approaches has high costs and is closely associated with prion and virus contamination besides the FIX inhibitors development. These effects increase the risk for bleeding-related morbidity and mortality. The purpose of this study was to clone hFIX into a lentiviral vector and evaluate the expression of the recombinant protein in two human cell lines. The cloning of the hFIX cDNA into 1054 lentiviral expression vector was confirmed by enzymatic restriction obtaining the expected 1407 bp and 10054 bp bands in agarose gel. The 293T and SK-Hep-1 cell lines have been stable transduced with 1054-FIX lentiviral vector generated in our laboratory and the cells with higher expression of EGFP were selected and separated by flow cytometry. The quantification of the expression of rhFIX was performed by ELISA and chromogenic assays. The concentration of total rhFIX was 500 ng/106 cells in 293T cell line and 803 ng/106 cells in SK-Hep-1 cell line. The biological activity of FIX secreted by 293T and SK-Hep-1 was 0,047 UI/106 cells and 0,186 UI/106 cells, respectively. In order to evaluate the active rhFIX production profile over time, we conducted a monitoring of 180 days, which was noted that the SK-Hep-1 cell line ceased FIX expression, while 293T cells maintained the expression during this period. rhFIX was characterized by western blot analysis confirming the presence of a expected 57 kDa immunereactive band. The 293T and SK-Hep-1 cell lines showed 7.67 and 17 integrated vector copies/cell, respectively. Considering the importance of the ?-carboxylation process, we performed a gene expression analysis of genes involved in this process, such as VKORC1, ?-carboxylase and calumenin, in cell lines. The results showed high ratios among the genes VKORC1 and calumenin and among VKORC1 and ?-carboxylase in both cell lines. The cell growth kinetics was performed by a 7-day period, showed significant differences between SK-Hep-1 transduced cells and non-transduced cells, whereas 293T cells showed no difference in cell growth. Enrichment of culture medium with Ca +2 and Mg +2 ions was tested to evaluate its influence on the expression of active FIX. 293T cells showed better performance in 0.5 mmol/L Ca+2 and 1.0 mmol/L Mg +2 concentrations and SK-Hep-1 cells in culture medium control. Our data indicate that transduced SK-Hep-1 cells are the best producer of functional rhFIX, and comparisons between these two cell lines are important in characterizing the behavior of genetically modified cell lines focused on the heterologous expression of recombinant proteins and opens new avenues for future studies aimed at improving the production of this type of protein.

O Fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da hemofilia B, o qual é baseado na administração de FIX derivado de plasma humano ou FIX recombinante. A terapia baseada nestas abordagens apresenta limitações como os altos custos e a baixa disponibilidade para a população de hemofílicos. O FIX é uma proteína complexa com grande variedade de modificações pós-traducionais e, por isso, apresenta baixa atividade específica e produtividade. A produção de um FIX recombinante com aumento na sua atividade coagulante pode contribuir para terapias de reposição e gênica mais eficazes nas quais quantidades menores das moléculas cataliticamente melhoradas serão necessárias para se obter os benefícios terapêuticos do FIX. Essa infusão diminuída poderá reduzir ou eliminar a geração de inibidores de FIX, minimizando os efeitos colaterais e reduzindo os custos do tratamento, sendo um dos desafios atuais no tratamento da hemofilia B. Nesse contexto, a engenharia genética tem se tornado uma ferramenta importante na modificação de proteínas de interesse farmacêutico visando a melhora das suas propriedades bioquímicas e biofísicas. Este trabalho teve como objetivo desenvolver novas variantes de FIX recombinante humano com aumento da sua atividade biológica. Para isso, fizemos um estudo detalhado da estrutura da proteína FIX e geramos três variantes FIX-YKALW, FIX-ALL e FIX-LLW, utilizando a técnica de mutagênese sítio dirigida. Essas variantes foram expressas em células humanas SK-Hep-1 tratadas com vitamina K e as proteínas foram caracterizadas in vitro e in vivo. A quantidade de FIX total secretada no sobrenadante celular foi similar entre as variantes FIX-YKALW e FIX-LLW (3,2 ?g/mL), enquanto FIX-ALL apresentou a menor expressão (1,8 ?g/mL), quantidades 2-3 vezes menores que de FIX controle (FIX-WT). Entretanto, a atividade biológica das variantes foi, em média, 6,2 vezes maior que FIX-WT, com atividade específica 11 vezes maior para FIX-YKALW e FIX-LLW e 24 vezes maior para FIX-ALL. FIX-YKALW apresentou a melhor geração de trombina in vitro dentre as variantes e destacou-se na avaliação da eficiência hemostática em camundongos hemofílicos B, na qual uma dose 5 vezes menor que a recomendada de FIX foi suficiente para promover uma resposta pró-coagulante. Neste trabalho foram desenvolvidas 3 novas variantes de FIX recombinante humano com maior atividade específica que o fator disponível no Sistema Único de Sáude. O FIX-ALL apresentou-se como a proteína mais potente in vitro descrita até o momento e FIX-YKALW como a mais promissora, dentre as mutantes desenvolvidas, na proteção hemostática in vivo. Estudos complementares são necessários para transpor a barreira da pesquisa para a utilização desses novos fatores de coagulação no tratamento da hemofilia B. Entretanto, esse trabalho apresenta novas proteínas com potencial de serem usadas na combinação com a terapia gênica bem como na terapia de reposição / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factor or recombinant protein. Coagulation therapy based on these approaches has limitations as high costs and low availability to hemophilic population. FIX is a complex protein with a wide variety of post-translational modifications and, therefore, presents low specific activity and productivity. The production of recombinant FIX with enhanced coagulant activity may contribute to more effective protein replacement and gene therapies in which reduced amounts of catalytically improved molecules will be required to obtain the therapeutic benefits of FIX. This fewer infusion may reduce or eliminate the generation of FIX inhibitors, minimizing side effects and reducing treatment costs. It is one of the current challenges for hemophilia B treatment. In this context, bioengineering has become an important tool for pharmaceutical interest protein modification to improve its biochemical and biophysical properties. This study focused on development of new recombinant human FIX variants with augmented clotting activity. We performed a detailed study of FIX protein structure and generated three variants, FIX-YKALW, FIX-ALL and FIX-LLW, using site-directed mutagenesis. Such variants were expressed in SK-Hep-1 cells treated with vitamin K and they were characterized in vitro and in vivo. The amount of FIX secreted in the cell supernatant was similar between FIX-YKALW and FIX-LLW (3.2 ?g/mL), whereas FIX-ALL displayed the lowest expression (1.8 ?g/mL), 2-3 times lower than FIX-wild-type (FIX-WT). However, the clotting activities of FIX variants were 6.2 times greater than FIX-WT. FIX-YKALW e FIX-LLW showed 11-fold higher specific activity and FIX-ALL showed 24-fold higher specific activity. FIX-YKALW displayed the greatest generation of thrombin in vitro among variants and was highlighted in the evaluation of haemostatic efficiency in hemophiliac B mice, in which a dose 5 times lower than the recommended FIX replacement therapy was enough to promote a procoagulant response. We generated 3 novel recombinant human FIX variants with enhanced specific activity than FIX available on the health system. FIX-ALL with higher in-vitro potency than any other known hyperfunctional FIX variant and FIX-YKALW as the most promising variant, among the generated mutants, for in-vivo haemostatic protection. Further studies are required to overcome the barrier to research for application of new coagulation factors on hemophilia B treatment. However, we have presented new proteins with potential for therapeutic use combined with gene therapy as well as in protein replacement therapy.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-β1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-β1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-β1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-β1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-β1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-β1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-β1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-β1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-β1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-β1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-β1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-β1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-β1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-β1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-β1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-β1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-β1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

Uma das estratégias mais promissoras para a biotecnologia de vacinas é o desenvolvimento de linhagens precisamente atenuadas, e que possam ser usadas como carregadoras de antígenos heterólogos. Mutantes de <i}>Salmonella Typhimurium têm sido extensivamente utilizados com essa fmalidade. A flagelina, monômero constituinte do filamento flagelar, vem sendo empregada como carregadora de antígenos heterólogos, inseridos na região central, hipervariável (região IV). Inserções nessa região são freqüentemente funcionais, e levam à exposição do epitopo na superfície do filamento. O presente trabalho explora o potencial de outras regiões da molécula para a inserção de epitopos. Nós inserimos a mesma seqüência usada anteriomente (epitopo da proteína M de S. pyogenes, Tipo 5) em regiões com diferentes níveis de homologia (III e VI), e em região totalmente conservada (VIII). Também foram feitas inserções duplas em regiões que se mostraram toleráveis (III e IV; IV e VI). Todas as proteínas híbridas foram sintetizadas pela Salmonella, como demonstrado em imunoblots, usando anticorpo contra a flagelina e contra o peptídeo. Todas as regiões, exceto a VIII, aceitaram a inserção sem perda de motilidade, apesar de, em alguns casos, ela ter sido extremamente reduzida. A imunogenicidade foi avaliada pela imunização de camundongos com bactérias vivas, inativadas ou, quando possível, flagelina purificada. Os resultados foram similares aos descritos na literatura para inserções envolvendo a região IV, obtendo-se um elevado título de anticorpos contra flagelina. Um baixo nível de anticorpo contra o peptídeo também foi detectado para todas as novas linhagens testadas. Nossos resultados com imunização de bactérias vivas sugerem uma resposta levemente melhor ao peptídeo quando duas cópias estão presentes, mas os dados não são conclusivos. / One of the most promising strategies for the biotechnology of vaccines is the development of precisely attenuated strains, which could be used as carriers of heterologous antigens. Mutants of Salmonella Typhimurium have been extensively explored to this effect, since the infection ofmice by S. Typhimurium mimics the infection of humans by S. Typhi, and the genetics of the species is extremely well known, making it easy the obtention of defined mutants with reduced pathogenicity. Mutants with auxotrofy in genes of the aromatic pathway are particularly attractive, since they need PABA and DHB to grow, and these compounds are unavailable in mammalian tissues. Flagellin, the monomer which constitutes the flagellar filament, has been used as a carrier for heterologous epitopes, inserted in a central, hypervariable region (region IV). Insertions in this region are often functional, and lead to exposition of the epitope at the filament\' s surface. The present work explored the potential of the other regions ofthe molecule for the insertion of epitopes. We inserted the same reporter sequence (MS epitope from S. pyogenes M protein) in regions with different levels of homology (III and VI), and totally conserved (VIII). We also made double insertions in regions shown to be permissive (III and IV; IV and VI). All hybrid proteins were synthesized by Salmonella, as demonstrated by immunoblots using antibody against flagellin and against the synthetic peptide. All regions, except the highly conserved region VIII, accepted the insertions without loss of motility, albeit, in some cases, motility was seriously reduced. Immunogenicity of the hydrids was evaluated by immunization with live bacteria, killed bacteria, and purified flagellin (when possible). Results obtained with the new constructs were similar to the ones published for insertions involving region IV, in the sense that antibody titers to the carrier protein were very high. A low level of antibody to the inserted peptide was also detected in all groups of animals. Our results with live immunization suggest a slightly better response to the peptide when two copies are present, but the data are not conclusive.

A lagarta L. obliqua tem se destacado por apresentar em sua hemolinfa proteínas com atividade biológica demonstrada em cultivos celulares. A literatura disponível não apresenta trabalhos sobre a expressão da proteína antiapoptótica de L. obliqua, então este estudo objetiva a clonagem e expressão da proteína antiapoptótica presente na hemolinfa de L. obliqua, em sistema bacteriano Escherichia coli. O RNAm extraído do tegumento de L. obliqua deu origem a um cDNA obtido por RT-PCR, o qual foi clonado em vetor pCR II-TOPO para posterior transformação de bactérias E. coli JMQC. Na expressão heteróloga, o fragmento foi subclonado em vetor pET28a e transformadas bactérias E. coli BLQC. A indução de expressão foi realizada com IPTG 1 mM. A APLOrEC purificada por cromatografia foi identificada por Western Blot. A atividade biológica da APLOrE foi analisada em células VERO e L929 após indução de morte e verificou-se que esta protegeu os cultivos induzidos com 4mM de H2O2 portanto, eficaz na manutenção estrutural do citoesqueleto destas células. / The caterpillar L. obliqua has become known for performing in their hemolymph proteins with biological activity demonstrated in cell cultures. The available literature does not provide studies on the expression of antiapoptotic protein L. oblique, so this study aims cloning and expression of anti-apoptotic protein present in the hemolymph of L. oblique, bacterial system in Escherichia coli. The extracted mRNA L. obliqua husk gave a cDNA obtained by RT-PCR, which was cloned into pCR II-TOPO vector for subsequent transformation of E. coli bacteria JMQC. The heterologous expression, the fragment was subcloned into pET28a vector and transformed E. coli bacteria BLQC. The induction of expression was performed with 1 mM IPTG. The APLOrEC purified by chromatography was identified by Western blot. The biological activity was examined in APLOrE VERO and L929 cells after death induction, and it was found that this protected crops H2O2 induced with 4mM therefore effective in the structural maintenance of the cytoskeleton of such cells.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.