Asma alérgica é uma inflamação pulmonar crônica mediada por células Th2. A Hipótese da Higiene é a teoria aceita para explicar o aumento das alergias nas últimas décadas e preconiza que a menor exposição dos indivíduos a componentes microbianos prejudica a geração mecanismos imunorregulatórios. Nosso estudo abordou a modulação da resposta alérgica pulmonar induzida por ovalbumina, por cepas de bacilo Calmette-Guérin recombinantes (rBCG) que expressam fragmentos de toxinas bacterianas. Observamos que dependendo do antígeno heterólogo expresso, a imunização intranasal com rBCG pode levar tanto a supressão como a exacerbação da resposta alérgica pulmonar. Demonstramos que tanto em um contexto profilático quanto terapêutico, rBCG é capaz de suprimir os parâmetros alérgicos, e a supressão não envolve o recrutamento de células T regulatórias, é um fenômeno local, está associada a maior produção de IFN-g do que IL-4 e é dependente de IL-12. Estes dados sugerem que a infecção pulmonar por rBCG gera um milieu capaz de bloquear a migração de células Th2 inflamatórias. / Allergic asthma is an atopic disorder mediated by Th2 cells. The Hygiene Hypothesis is the accepted theory to explain the increasing in allergy in recent deacades. It states that modern health care and hygiene practices have led to a reduced exposure to microorganisms components which impairs the generation of immunoregulatory mechanisms. The present study analysed how the intranasal infection with recombinant bacillus Calmette-Guérin (rBCG) strains expressing fragments of bacterial toxins could modulate an allergic pulmonary inflammation induced by ovalbumin. We demonstrated that the rBCG strains could supress or exacerbate the allergic inflammation depending on the expressed heterologous antigen. We analysed the effect of the mycobacterial infection in a prophylactic and in a therapeutical contexts, and we have identified that for both situations the of supression allergic features does not involve the recruitment of regulatory T cells to the lungs, is a local phenomena, is associated with an increased production of IFN-g, and is an IL-12 dependent mechanism. Taken togheter, this data suggest that the rBCG pulmonary infection generates a milieu capable to supress the chemotaxis for Th2 cells, which suppress the establishment of the allergic inflammation in the lungs.

A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3β da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3β. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3β of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3β protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.

A hemofilia A é uma doença caracterizada pela deficiência do fator VIII (FVIII) de coagulação sanguínea e atinge 1 em 5000 homens. Países desenvolvidos, utilizam como terapia o FVIII recombinante (rFVIII), por apresentar maior segurança e consistir uma fonte ilimitada. Estudos realizados em nosso laboratório, utilizando o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K, originaram as linhagens celulares humanas, HepG2FVIIIdB/P140K (hepática) e Hek293FVIIIdB/P140K (renal), que foram selecionadas pelo mesmo sistema de seleção, o tratamento in vitro com as drogas Benzilguanina e Temozolomide. O presente trabalho teve por objetivo caracterizar e detalhar o padrão de integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K nas duas linhagens celulares humanas, e verificar se o perfil de integração está relacionado ao tipo celular específico ou se este sofre influência da estratégia de seleção a qual as células foram submetidas anteriormente. Foi utilizada a técnica de LM-PCR (ligação-mediada por PCR) que permite localizar o sítio de integração do vetor viral, por meio do sequênciamento do produto de PCR obtido após a digestão com enzimas de restrição e ligação de uma sequência adaptadora (LINKER) ao DNA genômico. Após o seqüenciamento as sequências foram submetidas a análises em bancos de dados de genomas (Human BLAT, QuickMap e DAVID/EASE) para caracterização dos respectivos clones. Também foi realizada uma análise da expressão relativa do mRNA relativo ao rFVIII por RT-PCR e da atividade biológica pelo teste de TTPA. Dessa forma foi possível observar que ambas as linhagens modificadas expressam o mRNA relativo ao rFVIII e que as células HepG2 e Hek293 apresentam níveis de secreção da proteína recombinante biologicamente ativa da ordem de 7,9 UI/mL e 2,1 UI/mL, respectivamente. Foram sequenciados um total de 201 clones da HepG2, sendo 123 similares ao genoma humano e dentre estes 73 considerados verdadeiros e 50 ambíguos. Da Hek293 foram sequenciados 221 clones, sendo 179 similares ao genoma humano e dentre estes 64 verdadeiros e 115 ambíguos. Observamos que o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K apresenta um perfil de integração não randômico e diferente entre as células estudadas, uma vez que na linhagem HepG2 houve uma preferência pelos cromossomos 19, 17 e 11, e na Hek293 pelo cromossomo 9. Em relação a regiões genômicas tais como distância de ilhas CpGs e de sítios de ligação de fatores de transcrição não houve diferença no perfil de integração em ambas as linhagens celulares, visto que nas duas células o vetor se inseriu preferencialmente a uma distância de ± 30-60Kb dessas regiões. Observamos também que houve uma integração dentro de genes codificadores de proteínas da ordem de 52% e 44% nas células HepG2 e Hek293, respectivamente, contudo em ambos os casos mais de 90% dessas inserções ocorreram em regiões intrônicas. Houve 20% de integrações em sítios frágeis do genoma na linhagem HepG2 e 17% na Hek293. Em suma este trabalho mostrou a integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K específica para as duas linhagens em estudo. Além disso, pudemos observar que em ambas as linhagens celulares, HepG2FVIIIdB/P140K e Hek293FVIIIdB/P140K, existem regiões gênicas dentro dos cromossomos na qual o vetor exibe uma preferência. O perfil de integração caracterizado aqui difere de outros trabalhos da literatura que utilizaram retrovírus derivados de MLV. Isso nos leva a crer que o padrão de inserção descrito pode estar relacionado ao fato de que essas células foram tratadas anteriormente com drogas quimioterapêuticas para seleção de um clone celular com maior nível de produção de rFVIII, levando consequentemente a seleção de um perfil de integração semelhante entre as linhagens celulares, mesmo estas tendo origens teciduais diferentes. / Hemophilia A is a disease characterized by deficiency of blood clotting factor VIII (FVIII) and affects 1 in 5000 men. Developed countries use as therapy for Hemophilia A recombinant FVIII (rFVIII) because rFVIII concentrates have proven efficacy and safety and this therapy consist of an unlimited supply.. Studies in our laboratory using the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K, originate the human recombinant cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K (liver origen) and Hek293FVIIIdB/P140K (renal origen) which were selected with high doses of Benzyladenine and Temozolomide. This study aimed to characterize the integration pattern of retroviral vector pMFG-FVIII-P140K in these human cell lines, and verify if the profile of integration is related to specific cell type or it was influenced by the selection strategy which cells have been previously submitted. We used the technique of LM-PCR (ligation-mediated PCR) that allows to locate the site of viral vector integration by the sequencing of PCR products. The sequences were obtained after genomic DNA digestion with restriction enzymes and subsequent connection of an adapter (LINKER) to 5or 3 of the DNA fragment. The sequences were analyzed in genomic databases (Human BLAT, and Quickmap DAVID / EASE) for characterization of the respective clones. It was also performed an analysis of relative expression of rFVIII mRNA by RT-PCR and the biological activity was measured by APTT test. Thus it was observed that both cell lines express the mRNA relative to rFVIII and HepG2 and HEK293 cells have levels biologically active recombinant protein approximately 7.9 IU / mL and 2.1 IU / mL, respectively . We sequenced a total of 201 clones of HepG2FVIIIdB/P140K, 123 of these sequences match to the human genome and, among those 73 were considered true and 50 were ambiguous. In Hek293FVIIIdB/P140K 221 clones were sequenced, these total, 179 were similar to the human genome. 64 were true and 115 were ambiguous. We note that the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K presents a profile of integration different and non-random between the studied cells lines, in HepG2FVIIIdB/P140K was observed a preference of integration for chromosomes 19, 17 and 11, and in Hek293FVIIIdB/P140K for the chromosome 9. In genomic regions such as CpG islands and transcription factors binding sites (TFBS), there was no difference in the profile of integration in both cell lines. In the two cell lines the vector is inserted preferably at a distance of ± 30 - 60Kb of these regions. We also observed that there was 52% of integration within genes encoding proteins (RefSeq genes) in HepG2FVIIIdB/P140K and 44% in Hek293FVIIIdB/P140K cells. In both cases more than 90% of the insertions occurred in intronic regions. There were 20% of integrations at fragile sites in the genome of HepG2 cell line and 17% in Hek293. In summary this study showed the integration profile of retroviral vector pMFG -FVIII-P140K in two different cell lines that produces FVIIIr protein are very similar. Furthermore, we observed that in both cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K and Hek293FVIIIdB/P140K, there are genetic regions within the chromosomes in which the vector displays a preference. The integration profile featured described here differs in CpGs island and TFBS from other studies in the literature that used retroviruses derived from MLV. This leads us to believe that the integration pattern described here may be related to the fact that these cells were previously treated with chemotherapeutic drugs for selecting a cell clone with the highest level of production of rFVIII, consequently leading to selection of a similar profile integration between cell lines, even those having different tissue origins.

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 µg de Tc14/poço), 50% (com 0,4 µg de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 µg de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 µg de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-γ. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 µg of Tc14/well), 50% (with 0.4 µg of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-γ. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.

A agalaxia contagiosa é uma doença de notificação obrigatória que causa severas perdas econômicas para produção de ovinos e caprinos mundialmente. Apesar de seu impacto na produção animal, pouco se sabe sobre os fatores de virulência e patogenicidade do M. agalactiae (principal agente etiológico). Desta maneira, o presente estudo possuiu como objetivo a identificação, purificação e caracterização de proteínas antigênicas de M. agalactiae. Para tanto, quatro proteínas de superfície com potencial antigênico (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) foram selecionadas. Essas proteínas foram expressas em Escherichia coli e purificadas em coluna de níquel. As proteínas purificadas foram avaliadas quanto a antigenicidade em Western blotting utilizando soros de caprinos naturalmente infectados com M. agalactiae. Todas as proteínas expressas foram imunorreativas aos soros de caprinos naturalmente infectados, demonstrando que as proteínas utilizadas nesse estudo são possivelmente antigênicas e possuem epítopos acessíveis. / The Contagious agalactia is a notifiable disease that causes severe economic losses to sheep and goats worldwide. Despite its impact on animal production, little is known about the virulence factors and pathogenicity of M. agalactiae (main etiological agent). Thus, the present study identified, purified and characterized antigenic proteins of M. agalactiae. Therefore, four surface proteins with antigenic potential (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) were selected. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified on nickel column. The purified proteins were assayed for antigenicity by Western blotting using goat sera naturally infected with M. agalactiae. All expressed proteins were immunoreactive with sera from naturally infected goats, demonstrating that the proteins used in this study are possibly antigenics and it have acessible epitopes.

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa. / IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 &mu;g. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon &alpha;2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 &mu;g/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.

O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a -carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, -carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressão gênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da -carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 g de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 g de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores / Recombinant factor VII (FVIIr) has been the main therapeutic choice for hemophilic patients who develop inhibitors antibidies to conventional treatments (FVIII and FIX). Currently, the comercial product is produced in murine cells (BHK-21) which gives disadvantages considering the complexity of post-translational modifications of these proteins. The insertion of murine residues can be highly immunogenic in humans. Thus the production of proteins for therapeutic use in human cell lines appears as a promising alternative. In this context, the aim of this study was to clone and express the blood coagulation FVII in 3 human cell lines (HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11) and select the best cell line for production of recombinant protein. The cells were modified with the lentiviral vector p1054-CIGWS containing the FVII gene and GFP gene marker. After cells modification we observed efficiency of transduction, in which 80% of BHK-21-FVIIr cells showed GFP expression, 73% of HepG2-FVIIr cells, 32% of HKB-11-FVIIr cells and 95% SK- Hep-FVIIr. Gene expression analysis by real-time PCR showed that the three modified human cell lines exhibited RNAm expression relative to FVIIr. When cells were treated with 5 ug/mL vitamin K in culture, the gene expression of FVIIr was similar in the three cell lines (HepG2: 164 563 URE, HKB-11: 119122 and SK-Hep URE: 124919 URE). For FVII activation, the main post translational modification is -carboxylation vitamin-K-dependent which envolves three enzymes, -carboxylase, VKORC1 and calumenina (inhibitor) . Gene expression of these enzymes was evaluated before and after treatment with vitamin K. It was observed that there was an increase in mRNA levels in human cells treated with vitamin K, suggesting that the treatment is capable of activating the enzymes of the vitamin K cycle. Cell growth kinetics showed that modified murine cells BHK-21 have a higher specific growth rate, around 25% more than human cells. However the kinetics of production of recombinant cell lines showed that human cells expressing rFVII 3-fold more rFVII than BHK-21 cells. Due the low rFVII production of murine cells, and the extremely slow growth profile of human cell line HepG2, the recombinant cell lines Sk-Hep-1-rFVII and HKB-11-rFVII have been selected for cultivation tests in suspension using microcarriers in spinners flasks. Over 10 days of cultivation the HKB-11 cells showed a cumulative production of rFVII 152 ug, corresponding to 304 IU and SK-Hep-1 cells showed a rFVII production of 202.6 ug, corresponding to 405.2 IU. In summary, our data demonstrate that human cell lines are effective for producing recombinant factor VII. Using our production model, human cells were better than murine cells (BHK-21) used by the industry. Thus, these human cell lines can be used as a new platform for the FVII production, as well as for other recombinant proteins, with less risk of developing inhibitor antibodies

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-23T13:40:05Z No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-23T15:17:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-23T15:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Tuberculosis is a re-emerging infectious disease that remains a major public health problem worldwide. Although there is the BCG vaccine that is effective against severe forms of childhood TB, in adults its efficacy is variable (0-85%). In this context there is a need to develop new vaccines to control the spread of TB. This thesis proposes the development of a new recombinant fusion M. tuberculosis protein (Ag85C-MPT51-HspX) by molecular cloning, expression in E. coli with a histidine tag and purified by ion exchange chromatography. The fusion protein was constructed successfully, expressed in E. coli BL21 and purified. Tests in mice were performed to evaluate the immunogenicity of the recombinant fusion protein Ag85C-MPT51-HspX of M. tuberculosis. Mice were immunized three times with the protein Ag85C-MPT51-HspX formulated with CpG-DNA encapsulated in liposomes, CpG-DNA encapsulated in liposomes, liposome or saline as negative control and the humoral and cellular immune response was evaluated. The immunization with the vaccine formulation induced the production of high titers of specific anti-fusion protein Ag85C-MPT51-HspX IgG1 = 3.08 ± 0.04; IgG2a = 3.10 ± 0.03) and, favored the increase of specific CD4+ IFN-γ (2.14% ± 0.17), CD4+ TNF-α (2.16 ± 0.34%). The recognizing of this protein by seric IgG and IgM discriminated patients with active TB infection from healthy individuals. We conclude that CMX protein has potential to be used for the development of vaccine against M. tuberculosis as well also for TB diagnostic kits. / A tuberculose é uma doença infecciosa re-emergente que permanece como um dos maiores problemas de saúde pública mundial. Embora exista a vacina BCG que é eficiente contra formas graves de TB na infância, em adultos a eficácia é variável (0 a 85%). Nesse contexto existe a necessidade do desenvolvimento de novas vacinas para controlar a disseminação da TB. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nova proteína de fusão recombinante (Ag85C-MPT51-HspX) de M. tuberculosis a partir da clonagem molecular, expressão em E. coli com uma cauda de histidina e purificação através de cromatografia de troca iônica. A proteína de fusão foi construída com sucesso expressa em E. coli BL21 e purificada. Ensaios em camundongos foram realizados para avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante de fusão Ag85C-MPT51-HspX de M. tuberculosis. Os camundongos foram imunizados três vezes com a proteína Ag85C-MPT51-HspX formulada com CpG-DNA encapsulada em lipossoma, CpG-DNA encapsulado em lipossoma, lipossoma ou salina como controle negativo e a resposta imune humoral e celular foi avaliada . A imunização com a formulação vacinal induziu a produção de altos títulos de anticorpos específicos anti-proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX (IgG1 =3,08±0,04; IgG2a=3,10±0,03), bem como, favoreceu o aumento de células T CD4+IFN-γ (2,14%±0,17), CD4+TNF-α (2,16%±0,34) específicas. A avaliação do reconhecimento desta proteína de fusão tanto por IgM quanto IgG humana sérica permitiu discriminar pacientes com tuberculose ativa de controles saudáveis, demonstrando a antigenicidade desta molécula em humanos. Conclui-se que a proteína CMX poderá ser testada tanto como vacina, assim como para o desenvolvimento de testes de diagnóstico para a tuberculose.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina &#945;-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 &#959;C and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa. / IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 &mu;g. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon &alpha;2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 &mu;g/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.