OLIVEIRA, Antônia Simoni de. Produção e caracterização físico-química e biológica da cadeia alfa da lectina recombinante de Canavalia brasiliensis. 2017. 71 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PPGBiotec (ppgbiotec@ufc.br) on 2017-11-06T17:25:54Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-11-09T16:58:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T16:58:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_asoliveira.pdf: 1748685 bytes, checksum: f28ffb97f04b08fd6458d2ad2a1f460c (MD5) Previous issue date: 2017 / The ability to express and purify desired recombinant proteins in large quantities allows its biochemical characterization and use in industrial processes. Numerous plant lectins have been produced in heterologous systems, especially in Escherichia coli. By recognizing and specifically binding to carbohydrates, these molecules can perform various biological functions, such as cell-cell recognition, cell adhesion, fertilization, and defense mechanisms. Among plant lectins, leguminous lectins have been extensively investigated. The lectin of Canavalia brasiliensis, isolated by the first time in 1984 by Moreira and Cavada is a widely studied protein and has shown an immunostimulatory, andidepressive, antinociceptive, neroptotective, and antiproliferative effect in human leucemia cells, among onther biological activities tested. The biological properties, however, of many lectins have been attributed to isolectin blends, since it is difficult to separate isoforms using standard techniques. In this study the recombinant lectin (α chain) of Canavalia brasiliensis was produced from the synthetic gene inserted in the vector pET28a e. The strains DH5α and BL21 (DE3) were used for cloning and expression, respectively. The rConBr was expressed under all conditions tested and the condition of 16oC, 16 hours and 1,0 mM IPTG (isopropil-β-D-galatosídeo) was chosen for protein production. The protein was purified, being obtained in its active form. Lectin was active when tested against rabbit erytrocytes and was inhibited by mannose and α-methyl-mannopyranoside. The activity of rConBr is optimum at pH 4.0 to 7.0, remains stable up to 60 ° C and is not dependent on divalent cations. In addition, rConBr was not toxic against Artemia sp. and showed no cytotoxic effect on glioma cells C6 lineage. / A capacidade de expressar e purificar a proteína recombinante desejada em grande quantidade permite a sua caracterização bioquímica e o uso em processos industriais. Numerosas lectinas vegetais têm sido produzidas em sistemas heterólogos, especialmente em Escherichia coli. Por reconhecer e se ligar especificamente a carboidratos, essas moléculas podem desempenhar diversas funções biológicas, como o reconhecimento célula-célula, adesão celular, fertilização e mecanismos de defesa. Dentre as lectinas vegetais, lectinas de leguminosas têm sido extensivamente investigadas. A lectina de Canavalia brasiliensis, isolada pela primeira em 1984 por Moreira e Cavada, é uma proteína amplamente estudada e mostrou efeito imonuestimulatório, antidepressivo, antinociceptivo, antiproliferativo em linhagens celulares de leucemia humana e efeito neuroprotetor, dentre outras atividades biológicas testadas. Entretanto, as propriedades biológicas de muitas lectinas têm sido atribuídas a misturas de isolectinas, uma vez que é difícil separar isoformas utilizando técnicas convencionais. Neste estudo foi produzida a lectina recombinante (cadeia α) de Canavalia brasiliensis a partir do gene sintético inserido no vetor pET28a. As cepas DH5α e BL21 (DE3) foram utilizadas para clonagem e expressão, respectivamente. A rConBr foi expressa em todas as condições testadas e foi escolhida a condição de 16oC, 16 horas e 1,0 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) para produção da proteína. A proteína foi purificada, sendo obtida na sua forma ativa. A lectina mostrou-se ativa quando testada contra eritrócitos de coelho e foi inibida por manose e α-metil-manopiranosídeo. A atividade da rConBr é ótima em pH 4,0 a 7,0, mantém-se estável até 60°C e não é dependente de cátion divalentes. Além disso, a rConBr não foi tóxica contra náuplios de Artemia sp. e não mostrou efeito citotóxicos em células de glioma linhagem C6.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1544_1.pdf: 2210014 bytes, checksum: f0b8010a969a882f4bd43af5029b827c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Neste trabalho são relatados os resultados obtidos na utilização da lectina obtida das sementes de Canavalia brasiliensis, sobre a expressão e atividade de metaloproteinases extraídas de lesões de pele experimentais. O efeito da lectina foi testado em quatro esquemas terapêuticos (2º, 7º e 12º dia após a cirurgia), em camundongos os quais foram divididos em quatro grupos: ConBr (10μg), NaCl (150mM), ConBr/manose (10μg preparadas em solução fisiológica com manose 0,1M) e manose (0,1M). O estudo prosseguiu com a coleta das lesões para as análises da área da lesão, histopatológica, atividade colagenolítica utilizando azocolágeno e PCR em tempo real com primers específicos para metaloproteinase 2 (MMP-2) e metaloproteinase 9 (MMP-9). O grupo tratado ConBr apresentou sinais inflamatórios macroscópicos menos intensos e uma maior evolução cicatricial quando comparado aos demais grupos. A atividade colagenolítica esteve presente nos quatro grupos estudados, porém o grupo ConBr apresentou a menor atividade no 2º dia após a cirurgia, já o grupo ConBr/manose obteve a maior atividade no tempo referido acima, este perfil de atividade manteve-se para o grupo ConBr/manose no 12º dia após a cirurgia. Este resultado da atividade pode está relacionado com os achados histopatológicos, os quais demonstraram um padrão semelhante na organização tecidual entre os grupos ConBr e ConBr/manose, porém este último apresentou uma melhor organização das fibras de colágeno. Observou-se quanto a área das lesões que houve uma diferença estatisticamente significativa entre o Grupo ConBr e o grupo controle NaCl no 7º e 12º dia após a cirurgia. A expressão dos genes de MMP-2 e MMP-9 foi observada em todos os tempos para os grupos ConBr, ConBr/manose e manose, com diferentes quantidades, porém no grupo NaCl não houve expressão no 2º dia de tratamento da MMP-2 e MMP-9 e no 12º dia para o gene de MMP-9. Apesar do grupo ConBr/manose ter apresentado uma melhor organização das fibras colágenas, o grupo ConBr favoreu positivamente o fechamento da ferida em relação aos demais grupos

SANTIAGO, Mayara Queiroz de. Caracterização de bioconjugados de pontos quânticos de ZnCdTe com a lectina de Canavalia brasiliensis. 2016. 61 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-19T17:21:52Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T20:14:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T20:14:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) Previous issue date: 2016 / In recent years, researchers have focused their effort to the development of techniques with an interest in diagnostic strategies. To understand the onset and progression of various diseases before the action of any drug is necessary to evaluate the interactions of biological molecules in various cellular processes, this can be done by the use of biomarking strategies. Quantum dots (QDs) are fluorescent inorganic semiconductor compounds, which exhibit quantum confinement in three dimensions and unique optical properties and may be used in the imaging and detection of diagnostic signals. Lectins, proteins/glycoproteins that interact reversibly to specific carbohydrates, are already applied in several studies of biological activities due to its recognition properties. In view of this, the objective of this work was the bioconjugation of quantum dots ZnCdTe with the lectin of Canavalia brasiliensis (ConBr), the physicochemical characterization, evaluation of fluorescence properties and hemagglutination the formed system. The ZnCdTe synthesized nanoparticles were functionalized with a glutaraldehyde linker and then, submitted to bioconjugation reaction with the lectin. The obtained system ZnCdTe-ConBr was subjected to various analyzes such as particle size by Dynamic Light Scattering (DLS); evaluation of optical properties by UV/Visible Spectroscopy Absorption (UV/Vis) and photoluminescence spectroscopy; chemical evaluation of bioconjugation by Infrared Spectroscopy (FT-IR); assessment of morphology and microcomposition by Scanning Electron Microscopy (SEM); topographical evaluation, mechanical and physicochemical properties by Atomic Force Microscopy (AFM); and evaluation of lectin carbohydrate binding site integrity for haemagglutinating activity (H.A.). The results suggest that ZnCdTe-ConBr system was covalently conjugated after the reaction. It was also observed an increase in particle size and a greater homogeneity compared to non-conjugated quantum dots. The optical and functional properties of ZnCdTe-ConBr system was kept displaying a degree of high colloidal stability and functional over a period of 60 days. It was concluded that the system obtained here can be used as a biotechnological tool for use in diagnostic imaging technique. / Nos últimos anos, pesquisadores da área da saúde têm somado esforços voltados para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas biotecnológicas com um interesse especial em estratégias de diagnósticos. Para compreender o surgimento e a progressão de várias doenças diante de qualquer fármaco é necessário compreender a interação espaço-temporal das moléculas biológicas em vários processos celulares com o uso de estratégias de biomarcação para o monitoramento. Os pontos quânticos (PQs) são compostos inorgânicos semicondutores fluorescentes, que apresentam confinamento quântico em três dimensões e propriedades ópticas únicas e podem ser empregados na geração de imagens e detecção de sinais em diagnósticos. As lectinas, proteínas/glicoproteínas que interagem de forma reversível a carboidratos específicos, já são aplicadas em diversos estudos de atividades biológicas por esta propriedade de reconhecimento. Diante disto, o presente trabalho objetiva a bioconjugação de pontos quânticos de ZnCdTe com a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr), a caracterização físico-química e avaliação das propriedades de fluorescência e hemaglutinação do sistema formado. As nanopartículas de ZnCdTe foram obtidas do Laboratório de Quimica Biologica e Materiais (Quibiom) do Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (UFS), funcionalizadas com um linker de glutaraldeído, e em seguida foram submetidas à reação de bioconjugação com a lectina. O sistema obtido ZnCdTe-ConBr foi submetido a diversas análises como: tamanho de partícula por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS - Dynamic light scattering); avaliação das propriedades óticas por Espectroscopia de Absorção Ultravioleta/Visível (UV/Vis) e Espectroscopia de Fotoluminescência; avaliação química da bioconjugação por Espectroscopia no Infravermelho (FT-IR - Fourier Transform InfraRed); avaliação da morfologia e microcomposição por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); avaliação topográfica, propriedades mecânicas e físico-químicas por Microscopia de Força Atômica (AFM - Atomic Force Microscopy); e avaliação da integridade do sítio de ligação à carboidratos por Atividade Hemaglutinante (A.H.). Os resultados obtidos sugerem que o sistema ZnCdTe- ConBr foi conjugado covalentemente após a reação. Observou-se também um aumento do tamanho de partícula e uma homogeneidade maior comparado aos pontos quânticos não-conjugados. As propriedades óticas e funcionais (hemaglutinação) do sistema ZnCdTe-ConBr foram mantidas apresentando uma certa estabilidade coloidal e funcional durante um período de até 60 dias. Conclui-se então que o sistema aqui obtido pode ser utilizado como uma nova ferramenta biotecnológica para o desenvolvimento de uma técnica de diagnóstico por imagem.

NÓBREGA, Raphael Batista da. Estruturas cristalográficas da lectina de canavalia brasiliensis complexadas com adenina e ribose: analise estrutural e perspectivas. 2016. 100 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-08-11T17:17:13Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-08-22T21:09:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T21:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) Previous issue date: 2016 / Legume lectins (e.g ConA) are the most studied plant lectin family. The physiological and biological activities attribute to them, such as plant defense and antidepressant function, take into account their interactions with mono- and oligosaccharides in a specific and reversible manner. However, several studies show that these proteins can bind other biomolecules, such as hydrophobic compounds (e.g. adenine and indole acetic acid) and non protein amino acids (e.g. α-aminobutyric acid, AABA), although the structure-function relationship of these interactions remained poorly understood. In this study, we described two crystallographic structures of ConBr lectin isolated from the seeds of C. brasiliensis, complexed with two different ligands: a complex of the lectin with β-D-ribofuranose and another with adenine, both compounds found in the Carbohydrate-Recognition Domain (CRD). Based on the location of these binders, it is suggested by the docking ConBr can bind to adenosine. In addition, this study shows that AABA can take different provisions in its binding site. Taken together, these results reveal new insights into the physiological and biological activities legume lectins. / A família de lectinas vegetais mais estudadas é a das plantas leguminosas como a Concanavalina A (ConA) – Canavalia ensiformes. As atividades fisiológicas e biológicas atribuídas, tais como defesa da planta e ação antidepressiva, leva em consideração as suas interações com mono e oligossacarídeos de uma maneira específica e reversível. Embora lectinas da subtribo Diocleinae, como a ConA, sejam consideradas específicas para glicose e manose, estudos comparativos mostram que lectinas de diferentes espécies apresentam desempenhos diferenciados frente a um determinado modelo de atividade biológica, algo que parece estar relacionado à arquitetura do Domínio de Reconhecimento a Carboidrato (CRD) e à capacidade (ou não) de ligação a determinados mono- e oligossacarídeos. Além disso, tais atividades parecem não depender apenas da interação com carboidratos, haja vista que diversos estudos mostram que estas proteínas podem se ligar a outras biomoléculas, como compostos hidrofóbicos (a exemplo de adenina e ácido indolacético) e aminoácidos não protéicos (a exemplo do ácido α-aminobutírico – AABA). Neste trabalho, foram descritas duas estruturas cristalográficas da lectina ConBr, isolada de sementes da Canavalia brasiliensis (feijão-bravo-do-Ceará), complexada com dois diferentes ligantes: um complexo da lectina com a β-D-ribofuranose e outro com a adenina, ambos compostos localizados no CRD. Baseado na localização desses ligantes, sugere-se, por Docking que a ConBr pode se ligar à adenosina. Além disso, esse estudo mostra que o AABA pode assumir diferentes disposições em seu sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes resultados revelam novas perspectivas para as atividades fisiológicas e biológicas de lectinas de leguminosas.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1211143 bytes, checksum: 23a2b34a9ee3ee070ebfce58519b026d (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Canavalia brasiliensis belongs to the family of Leguminosae and known as feijão-bravo-do-Ceará, it s a species from Americas. In Brazil it can be found in the North, Northeast, Midwest and Southeast. Many species of plant contain carbohydrate-binding proteins which are commonly called lectins or agglutinins which are distributed in virtually all living organisms. That study aimed to detect, purify and characterize physico-chemically a ConBr new lectin from extract of the seeds of C. brasiliensis and to evaluate its relationship with pathogenic bacteria and inflammatory processes. The lectin, with affinity for rabbit erythrocytes, was isolated by affinity chromatography on matrix Sephadex G-50 followed by chitin, and molecular exclusion in HPLC system. The purity and the molecular weight of the lectin were determined by SDS-PAGE. The protein was characterized as to the nature glycoprotein, the specific sugars and glycoproteins, resistance to pH, temperature, denaturing agents, reducing, oxidizing and chelating agents. The lectin on SDS-PAGE showed two bands of 25 and 45 kDa and a content of 47 μg of carbohydrates. It was specific for mannose, fructose and maltose. It was inactivated when heated to 90 °C and 100 °C for 10 minutes and at pH 5,0 and 13.0. It had reduced their activity in the presence of urea 4 and 8 M and sodium metaperiodate, and increased with β-mercaptoethanol. It s a metalloprotein which depend of Mg2+ for stabilizing its carbohydrate biding site. It didn t present activity against Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 and in the carrageenan-induced peritonitis model in mice, the lectin didn t have toxicity to animals and showed anti-inflammatory effect reducing the blood vessel permeability and migration of neutrophils in the peritoneum of mice. / Canavalia brasiliensis pertence à família Leguminosae e sendo conhecida como feijão-bravo-do-Ceará, é uma espécie predominante do Continente Americano. No Brasil pode ser encontrada nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Muitas espécies de plantas contêm proteínas de ligação a carboidratos as quais são comumente chamadas de lectinas ou aglutininas as quais são distribuídas em praticamente todos os organismos vivos. O referido trabalho objetivou detectar, purificar e caracterizar fisico-quimicamente uma nova lectina ConBr do extrato das sementes de C. brasiliensis e avaliar sua relação com bactérias patogênicas e processos inflamatórios. A lectina com afinidade por eritrócitos de coelho foi isolada através de cromatografia de afinidade em matriz de sephadex G-50 seguida de quitina; e exclusão molecular em sistema HPLC. O grau de pureza e o peso molecular da lectina foram determinados por eletroforese SDS-PAGE. A proteína foi caracterizada quanto à natureza glicoproteica, especificidade a açúcares e glicoproteínas, resistência ao pH, temperatura, agentes desnaturantes, redutores, oxidantes e quelantes. A lectina apresentou na SDS-PAGE duas bandas de 25 e 45 kDa e um teor de 47 μg de carboidratos. Foi específica para manose, frutose e maltose. Foi inativada quando aquecida a 90 °C e 100 °C durante 10 minutos e em pH 5,0 e 13,0. Teve sua atividade reduzida na presença de ureia 4 e 8 M e do metaperiodato de sódio; e aumentada com o β-mercaptoetanol; é uma etaloproteína dependente de Mg2+ para a estabilização do seu sítio de ligação a carboidratos. Não apresentou atividade frente às bactérias Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 e no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, a lectina não se mostrou tóxica para os animais e exibiu efeito antiinflamatório através da redução da permeabilidade dos vasos sanguíneos e da migração dos neutrófilos no peritôneo dos animais.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas podem ser definidas como proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente de maneira especÃfica a mono ou oligossacarÃdeos. Dentre as lectinas de origem vegetal, as lectinas de leguminosas sÃo as mais estudas, em especial as lectinas pertencentes subtribo Diocleinae. As lectinas da subtribo Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade em sua seqÃÃncia primÃria e estrutura tridimensional, mas apresentam diferentes intensidades em suas atividades biolÃgicas em que sÃo aplicadas, como a induÃÃo da produÃÃo de Ãxido nÃtrico. A estrutura da recÃm cristalizada lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) objetiva esclarecer como essas variaÃÃes ocorrem baseado na geometria dos resÃduos que compÃe o domÃnio de reconhecimento à carboidrato (DRC). A lectina de Canavalia brasiliensis foi purificada e cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor a 293 K. Cristais adequados foram obtidos na condiÃÃo contendo 200 mM de cloreto de sÃdio, 100 mM de hepes pH 8.5 e 1.8 M e sulfato de amÃnio. O cristais apresentam um grupo espacial ortorrÃmbico I222, a cela unitÃria tem dimensÃes de a=68.3 Ã, b=73.0 Ã, c=99.5 à e Ãngulos de α = β = γ = 90Â, sendo observado um monÃmero na unidade assimÃtrica e um conteÃdo de 49.5 % de solvente. O refinamento satisfatÃrio apresentou um âRfactorâ e âRfreeâ de respectivamente 20.4% e 25.3%. Foram determinados parÃmetros no potencial de atividade biolÃgica registrada na literatura, onde a lectina de Canavalia maritima (ConM) tem alto potencial de induÃÃo a produÃÃo de Ãxido nÃtrico comparado com a lectina de Canavalia ensiformis (ConA) que tem um baixo potencial de induÃÃo. DiferenÃas significativas foram encontradas entre coordenadas dos resÃduos que compÃe o DRC de lectinas da subtribo Diocleinae, e comparando esses dados com os potenciais de atividade biolÃgica foi estipulado um padrÃo distinto de distancias para lectinas com alto e baixo potencial de induÃÃo. A lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) apresenta um padrÃo de distancias de uma Ãtima indutora de Ãxido nÃtrico como ConM, porÃm apresenta uma atividade inferior que ConA. As distancias da DRC explicam a diferenÃa na atividade, mas a ConBr se mostra um caso excepcional, onde uma avaliaÃÃo do volume do sÃtio mostra um sÃtio extremamente reduzido, o que explica sua discrepÃncia na atividade biolÃgica. / Lectins may be defined as proteins of nonimmune origin that have at least one non-catalytic domain that reversibly binds specifically to mono or oligosaccharides. Among plant lectins, legume lectins are the most studied, in particular those lectins belonging to subtribe Diocleinae. The lectins from subtribe Diocleinae show a high degree of similarity in their primary sequence and three-dimensional structure but have different intensities in their biological activities in which they are applied, such as induction of nitric oxide production. The structure of the newly crystallized lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) aims to clarify how these variations are based on the geometry of the residues that comprise the carbohydrate recognition domain (CRD). The lectin from Canavalia brasiliensis was purified and crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Suitable crystals were obtained under the condition containing 200 mM sodium chloride, 100 mM HEPES pH 8.5 and 1.8 M ammonium sulfate. The crystals have a space group orthorhombic I222, the unit cell has dimensions a = 68.3 Ã, b = 73.0 Ã, c = 99.5 à and angles α = β = γ = 90  been observed a monomer in the asymmetric unit with a content of 49.5% solvent. The refinement showed a satisfactory "Rfactor" and "Rfree" of respectively 20.4% and 25.3%. Parameters were determined in the potential of biological activity reported in literature, where the lectin from Canavalia maritima (ConM) has high potential for inducing nitric oxide production compared with the lectin from Canavalia ensiformis (ConA), which has a low potential for induction. Significant differences were found between coordinates of the residues that comprise the CRD of lectins from the subtribe Diocleinae, and comparing these data with potential biological activity was provided a distinct pattern of distances to lectins with high and low potential for induction. The lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) shows a pattern of distances for a great inducer of nitric oxide as ConM, but shows a lower activity than ConA. The distances of CRD explain the difference in activity, but ConBr shown an exceptional case where an assessment of the volume of the site shows a very small site, which explains their discrepancy in biological activity.

BEZERRA, E. H. S. Análise estrutural do domínio de reconhecimento à carboidrato da lectina de Canavalia brasiliensis e sua relação na indução da produção de óxido nítrico. 2011. 70 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-03T13:00:45Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_ehsbezerra.pdf: 1637358 bytes, checksum: f8530ac9d90a713ba0b055c86b862062 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-13T14:51:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_ehsbezerra.pdf: 1637358 bytes, checksum: f8530ac9d90a713ba0b055c86b862062 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-13T14:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_ehsbezerra.pdf: 1637358 bytes, checksum: f8530ac9d90a713ba0b055c86b862062 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectins may be defined as proteins of nonimmune origin that have at least one non-catalytic domain that reversibly binds specifically to mono or oligosaccharides. Among plant lectins, legume lectins are the most studied, in particular those lectins belonging to subtribe Diocleinae. The lectins from subtribe Diocleinae show a high degree of similarity in their primary sequence and three-dimensional structure but have different intensities in their biological activities in which they are applied, such as induction of nitric oxide production. The structure of the newly crystallized lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) aims to clarify how these variations are based on the geometry of the residues that comprise the carbohydrate recognition domain (CRD). The lectin from Canavalia brasiliensis was purified and crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Suitable crystals were obtained under the condition containing 200 mM sodium chloride, 100 mM HEPES pH 8.5 and 1.8 M ammonium sulfate. The crystals have a space group orthorhombic I222, the unit cell has dimensions a = 68.3 Å, b = 73.0 Å, c = 99.5 Å and angles α = β = γ = 90 ° been observed a monomer in the asymmetric unit with a content of 49.5% solvent. The refinement showed a satisfactory "Rfactor" and "Rfree" of respectively 20.4% and 25.3%. Parameters were determined in the potential of biological activity reported in literature, where the lectin from Canavalia maritima (ConM) has high potential for inducing nitric oxide production compared with the lectin from Canavalia ensiformis (ConA), which has a low potential for induction. Significant differences were found between coordinates of the residues that comprise the CRD of lectins from the subtribe Diocleinae, and comparing these data with potential biological activity was provided a distinct pattern of distances to lectins with high and low potential for induction. The lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) shows a pattern of distances for a great inducer of nitric oxide as ConM, but shows a lower activity than ConA. The distances of CRD explain the difference in activity, but ConBr shown an exceptional case where an assessment of the volume of the site shows a very small site, which explains their discrepancy in biological activity. / Lectinas podem ser definidas como proteínas de origem não imune que possuem pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversivelmente de maneira específica a mono ou oligossacarídeos. Dentre as lectinas de origem vegetal, as lectinas de leguminosas são as mais estudas, em especial as lectinas pertencentes subtribo Diocleinae. As lectinas da subtribo Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade em sua seqüência primária e estrutura tridimensional, mas apresentam diferentes intensidades em suas atividades biológicas em que são aplicadas, como a indução da produção de óxido nítrico. A estrutura da recém cristalizada lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) objetiva esclarecer como essas variações ocorrem baseado na geometria dos resíduos que compõe o domínio de reconhecimento á carboidrato (DRC). A lectina de Canavalia brasiliensis foi purificada e cristalizada pelo método de difusão de vapor a 293 K. Cristais adequados foram obtidos na condição contendo 200 mM de cloreto de sódio, 100 mM de hepes pH 8.5 e 1.8 M e sulfato de amônio. O cristais apresentam um grupo espacial ortorrômbico I222, a cela unitária tem dimensões de a=68.3 Å, b=73.0 Å, c=99.5 Å e ângulos de α = β = γ = 90º, sendo observado um monômero na unidade assimétrica e um conteúdo de 49.5 % de solvente. O refinamento satisfatório apresentou um “Rfactor” e “Rfree” de respectivamente 20.4% e 25.3%. Foram determinados parâmetros no potencial de atividade biológica registrada na literatura, onde a lectina de Canavalia maritima (ConM) tem alto potencial de indução a produção de óxido nítrico comparado com a lectina de Canavalia ensiformis (ConA) que tem um baixo potencial de indução. Diferenças significativas foram encontradas entre coordenadas dos resíduos que compõe o DRC de lectinas da subtribo Diocleinae, e comparando esses dados com os potenciais de atividade biológica foi estipulado um padrão distinto de distancias para lectinas com alto e baixo potencial de indução. A lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) apresenta um padrão de distancias de uma ótima indutora de óxido nítrico como ConM, porém apresenta uma atividade inferior que ConA. As distancias da DRC explicam a diferença na atividade, mas a ConBr se mostra um caso excepcional, onde uma avaliação do volume do sítio mostra um sítio extremamente reduzido, o que explica sua discrepância na atividade biológica.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5234_1.pdf: 6381306 bytes, checksum: 57ff4799833e76675f1745a6e25280bb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Lectinas são proteínas (ou glicoproteínas) não pertencentes ao sistema imunológico, capazes de reconhecer sítios específicos em moléculas e ligar-se a carboidratos, sem alterar a estrutura covalente das ligações glicosídicas desses sítios. Canavalia brasiliensis e a Dioclea violacea são leguminosas pertencentes à subtribo Diocleinae, das quais são extraídas as lectinas ConBr e DVioL, respectivamente. Com o objetivo de avaliar a influência do tratamento tópico com estas lectinas no processo cicatricial de feridas cutâneas, foi produzida uma ferida na região dorsal torácica (1 cm²) em camundongos (Mus musculus) albinos suíços, divididos em cinco grupos (n=15/grupo), segundo o tratamento empregado: Grupo C (NaCl 150 mM); Grupo ConBr50 (ConBr 50 mg/mL); Grupo ConBr 100 (ConBr 100 mg/mL); Grupo DVioL50 (DVioL 50 mg/mL) e Grupo DVioL100 (DVioL 100 mg/mL). Foram aplicados diariamente 100 μL de cada solução e ao longo de todo o período pós-operatório (PO) (até o 12o dia), as feridas foram submetidas à avaliação clínica. Biópsias para análise histopatológica e exames microbiológicos foram realizados nos 2o, 7o e 12o dias de pós-operatório (PO). A atividade antimicrobiana das lectinas citadas foi testada frente às bactérias Bacillus sp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. Durante a avaliação clínica, foi observado que os grupos tratados com a lectina apresentaram sinais flogísticos menos intensos quando comparados ao grupo controle (NaCl 150mM). No 12o dia PO, os animais tratados com a lectina ConBr 100 mg/mL apresentaram um percentual de contração na ordem de 96,40%, superior aos demais grupos estudados. As lectinas testadas não apresentaram atividade antimicrobiana in vitro frente aos microrganismos testados, porém durante os testes in vivo, no grupo ConBr100, nenhum microrganismo foi isolado das lesões cutâneas. Sob o aspecto histopatológico, o grupo ConBr100 apresentou o processo cicatricial mais avançado no 12o dia de avaliação,observando-se reepitelização, tecido de cicatricial de padrão fibroso com fibras colágenas bem organizadas e início de formação dos anexos cutâneos. O presente estudo oferece evidência farmacológica preliminar sobre o uso das lectinas ConBr e DVioL para promover o processo de cicatrização

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-11T13:20:49Z No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 672464 bytes, checksum: 70191679dda58a1314e6dce99c1b08da (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-11T13:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 672464 bytes, checksum: 70191679dda58a1314e6dce99c1b08da (MD5) Previous issue date: 2007-02-05 / Lectins, carbohydrate binding proteins of non immune origin, agglutinate cells and glycoconjugates. Some proteins as the lectins from the Diocleinae tribe have described as pharmacological active molecules. Lectins form an important class of carbohydrate-binding proteins. Canavalia brasiliensis (ConBr) is a sugar-binding specificity [D-mannose (Dglucose)] protein. The aim of this study was evaluate the proteins profile and to evaluate histhopathologically treated wounds with ConBr seeds lectins. Surgical wounds were produced in the dorsal region in albino Swiss mice. Each wound was daily treated topically along 11 days, as follow: ConBr (10μg), ConBr/Manose (10μg in manose 0,1M), manose (0,1M) and NaCl (150mM). Protein profile has done through SDS-PAGE and showed proteins with molecular weight between 30 and 70KDa, suggesting the presence of metalloproteinases in the homogenates gotten from the cutaneous injuries. In 2nd day of postoperative (PO), the ConBr/Manose group was what it presented the highest proteolitic activity, in 7th day of P.O., the highest activity was observed in the ConBr and NaCl groups. Finally, in 12th day of PO ConBr/manose group showed a maxim proteolitic activity. ConBr group showed flogistic signs less intense than others groups, had presented contraction percentile superior during the fibroplasia phase. In the first 48 hours it was observed, in all the studied groups, the presence of polymorphonuclear leukocyte infiltrate, crust and angiogenesis. At 7th day there was presence of fibrovascular (manose, ConBr Manose and ConBr) and vascular granulation tissue (NaCl) in studied groups. Finally, at 12th day, wounds showed reepithelization. In ConBr/manose group there was presence of fibrovascular granulation tissue with more organized collagen network. Results suggests that wound healing it was better in ConBr group, having presented one better effect when used in association with manose. / Lectinas são proteínas de origem não imune que se ligam a carboidratos, podendo aglutinar células e glicoconjugados. Algumas dessas lectinas, como as obtidas de leguminosas da tribo Diocleinae possuem atividade farmacológica, a exemplo da Canavalia brasiliensis (ConBr) a qual exibe especificidade de ligação D-manose/D-glicose. O objetivo desse estudo foi determinar o perfil de proteases e avaliar clínica e histopalogicamente o efeito do tratamento tópico de feridas cutâneas com a ConBr livre e conjugada com o seu açúcar específico. Para isso, lesões cirúrgicas foram produzidas na região dorsal de camundongos, divididos em grupos, de acordo com o tratamento que se segue: NaCl (150mM), manose (0,1M), ConBr (10μg) e ConBr/manose (10μg em solução fisiológioca com manose 0,1M). O perfil das proteínas realizado através de eletroforese SDS-PAGE demonstrou a presença de proteínas com peso molecular compreendidos na faixa de 30 a 67 kDa, sugerindo a presença de metaloproteinases nos homogenatos obtidos a partir das lesões cutâneas. No 2º dia de pósoperatório (P.O.), o grupo ConBr/Manose foi o que apresentou a maior atividade proteolítica, no 7º dia de P.O., a maior atividade foi observada nos grupos ConBr e NaCl, finalmente, no 12º dia de P.O. a maior atividade proteolítica foi observada no grupo ConBr/manose. Na avaliação clínica observou-se que o grupo ConBr apresentou sinais inflamatórios menos intensos que os outros grupos avaliados, tendo evoluído com maior percentual de contração durante a fase de fibroplasia. Nas análises histopatógicas visualizou-se no 2º dia de P.O., a presença de crosta, infitrado polimorfonuclear e neoangiogênese em todos os grupos estudados. No 7º dia de P.O., os grupos Manose, ConBr/Manose e ConBr apresentaram tecido de granulação com padrão fibrovascular enquanto no grupo NaCl foi visualizado tecido de granulação com padrão vascular. No 12º dia todos os grupos apresentaram reepitelização, porém o grupo ConBr/Manose apresentou melhor padrão de organização das fibras colágenas. A lectina isolada das sementes da Canavalia brasiliensis favoreceu o processo cicatricial das lesões cutâneas experimentais, tendo apresentado um melhor efeito sob o ponto de vista histopatológico quando usada em associação com a manose.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-14T12:26:00Z No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T12:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plant lectins represent a class of proteins that perform various biological activities, including an immunomodulatory actions. In particular, lectins ConBr (Canavalia brasiliensis) and CFL (Cratylia argentea) have demonstrated an ability to modulate cytokines of the proinflammatory cascade as well as the production of nitric oxide in the murine model of Salmonella infection. Immunomodulatory molecules represent a promising alternative in the prevention and treatment of infections and can enhance immunological and adaptive mechanisms of the host improving the efficacy of antibiotics and vaccines against pathogens. This study evaluated the biotechnological potential of the ConBr and CFL as therapeutic and vaccine adjuvants against the antigen Vi from S. typhi, which has been used with limited success for immunization against typhoid fever. Initially, cytotoxicity assays with lectins were performed with cultured murine peritoneal macrophages to define non-toxic proteins concentrations for assays. Then, macrophages were treated with lectins and infected with a virulent strain of Salmonella Typhimurium. For this purpose, macrophages were incubated with ConBr and CFL lectins (1 and 10 μg / mL) before (preventive treatment) or after (curative treatment) the onset of infection. The following analyses were conducted: macrophage cell viability, intracellular bacterial quantification, iNOS plus pro-and anti-inflammatory cytokines and Toll-like receptor´s (TLR2, TLR4 and TLR9) gene expression. Both preventive and curative treatments significantly reduced the intracellular bacterial load and increased cell viability of infected macrophages. In the preventive treatment with CFL there was an increase in the level of transcripts for IL-6 and TNF-α, whereas ConBr induced an increase of IL-12 (p40). In the curative treatment, CFL induced significant expression of IL-12 (p40), whereas ConBr increased gene expression of IL-1β and TNF-α. In addition, the curative treatment with CFL increased approximately 130 fold the expression of TLR-4 and 24 fold expression of TLR2. In view of the importance of the TLR2 and TLR4 for the control of Salmonella infection, we evaluated the participation of these receptors in the immunomodulatory action of the CFL. Thus, bone marrow-derived macrophages (BMDM) knockout for TLR2/TLR4 were treated with the lectin and gene expression for IL-1β, TNF-α and IL-6 cytokines was evaluated. Naïve BMDM demonstrated high levels of gene expression, increasing 258-fold the number of transcripts for IL-1β, 233-fold for IL-6, and 25-fold for TNF-α. Conversely, double knockout BMDM for TLR2/TLR4 produced low levels of transcripts. Finally, ConBr and CFL were tested as vaccine adjuvants in Swiss mice immunized with the purified Vi antigen through evaluation of anti-Vi IgG antibodies. The results showed that as CFL and ConBr lectins were not able to induce an increase of specific IgG anti-Vi antibodies. Although the lectins did not demonstrate a potential as vaccine adjuvant against the Vi antigen, they showed therapeutic properties beneficial to the control of Salmonella-infected macrophages and were capable to interact with Toll-like receptors, which play a key role on activation of innate immune response and development of adaptive immune response. Such results represent a promising prospect for the development of new drugs against Salmonella. / Lectinas vegetais representam uma classe de proteínas que desempenham diversas atividades biológicas, incluindo a ação imunomoduladora. Recentemente, as lectinas ConBr (Canavalia brasiliensis) e CFL (Cratylia argentea) demonstraram a capacidade de modular a cascata pró-inflamatória de citocinas, bem como a produção de óxido nítrico em modelo murino de infecção por Salmonella. Moléculas imunomoduladoras representam uma alternativa promissora na prevenção e no tratamento de infecções, podendo atuar nos mecanismos imunológicos naturais e adaptativos do hospedeiro, aprimorando a eficácia de antibióticos e vacinas contra patógenos. Diante disso, este estudo avaliou o potencial biotecnológico das lectinas, ConBr e CFL, como adjuvantes terapêuticos, frente ao antígeno vacinal Vi de S. Typhi, que tem sido usado com sucesso limitado para imunização contra a febre tifoide. Inicialmente, foram realizados ensaios de citotoxicidade das lectinas em cultura de macrófagos peritoneais murinos para definir as concentrações proteicas não tóxicas de uso nos ensaios. A seguir, os macrófagos foram tratados com as lectinas e infectados por uma cepa virulenta de Salmonella Typhimurium. Para tanto, os macrófagos foram incubados com as lectinas ConBr e CFL (1 e 10 μg/mL) antes (tratamento preventivo) ou após (tratamento curativo) infecção experimental com Salmonella. Foram realizadas análises de viabilidade celular dos macrófagos, quantificação intracelular bacteriana e expressão gênica de iNOS, citocinas pró- e anti-inflamatórias e receptores Toll-like (TLR2, TLR4 e TLR9). Ambos os tratamentos preventivo e curativo reduziram significativamente a quantificação bacteriana intracelular de Salmonella e aumentaram a viabilidade celular dos macrófagos. Os tratamentos preventivos com CFL aumentaram os níveis de transcritos para IL-6 e TNF-α, já ConBr induziu o aumento de IL-12 (p40). No tratamento curativo, CFL induziu expressão significativa de IL-12 (p40), enquanto ConBr aumentou a expressão gênica de IL-1β e TNF-α. Além disso, o tratamento curativo com CFL foi capaz de aumentar cerca de 130 vezes a expressão de TLR-4 e 24 vezes a expressão de TLR2. Considerando a importância dos receptores TLR2 e TLR4 para o controle da infecção por Salmonella, este trabalho avaliou a participação desses receptores na ação imunomoduladora da lectina CFL. Para tanto, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e duplo nocautes para TLR2/TLR4 foram tratados com a lectina e a expressão gênica das citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6 foi avaliada. Os BMDM demonstraram elevados níveis de expressão gênica, induzindo o aumento de cerca de 258 vezes para IL-1β, 233 vezes para IL-6 e 25 vezes para TNF-α. No entanto, BMDM duplo nocautes para TLR2/TLR4, produziram níveis significativamente mais baixos de transcritos. Por fim, ConBr e CFL foram testados como adjuvante vacinais em camundongos Swiss imunizados com antígeno Vi purificado, através da avaliação de anticorpos IgG anti-Vi. Os resultados mostraram que as lectinas CFL e ConBr não foram capazes de induzir o aumento no título de anticorpos específicos IgG anti-Vi. Apesar das lectinas não terem demonstrado potencial adjuvante vacinal frente ao antígeno Vi, tais proteínas apresentaram propriedades terapêuticas benéficas no controle de células infectadas por Salmonella, além de serem capazes de interagir com receptores do tipo Toll, essenciais na ativação da resposta imune inata e desenvolvimento da resposta adaptativa. Assim, tais resultados representam uma perspectiva promissora para o desenvolvimento de novos fármacos contra Salmonella.