Moreira, C. G. Isolamento, purificação e caracterização físico-química parcial de uma lectina presente em sementes de Andira sp. 2013. 56 f. Dissertação (mestrado em Biotecnologia)Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:45:56Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_cgmoreira.pdf: 1843502 bytes, checksum: ab574e3231ba9a51db6e77eb9462d755 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:47:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_cgmoreira.pdf: 1843502 bytes, checksum: ab574e3231ba9a51db6e77eb9462d755 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-15T15:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_cgmoreira.pdf: 1843502 bytes, checksum: ab574e3231ba9a51db6e77eb9462d755 (MD5) Previous issue date: 2013 / Lectins are ubiquitous proteins in nature, of non-immune origin, which have at least one non-catalytic domain that binds carbohydrates specifically and reversibly. They can be found in vegetables leaves, stems and seeds. The Dalbergieae tribe has lectins which have specificity for different carbohydrates and also have several biological activities such as induction of rat paw edema, release of chemotactic mediators by macrophages, vasorelaxant effect in rat aortas, and others. This study aimed to isolate, purify and physiochemically characterize a lectin found in seeds of Andira pisonis (Dalbergieae tribe). Andira pisonis seeds were ground into a fine powder and subjected to total protein extraction in 1 M ammonium sulfate. Soluble proteins were subjected to hemagglutination activity, quantification by the Bradford method and essays of hemagglutination inibition activity by sugar. The lectin from Andira pisonis (APL) was purified by affinity chromatography on Sepharose- Mannose matrix eluted in 0.1 M glycine buffer pH 2.6 with 0.15 M NaCl. The eluted fraction was dialyzed against distilled water, lyophilized and subjected to ion exchange chromatography on HiTrap SP XL 01. APL was eluted on 20 mM sodium acetate buffer pH 4.5 gradient of 0-1M NaCl. APL hemagglutinated rabbit erythrocytes (enzymatically treated) and other lectins from the tribe Dalbergieae and showed specificity for mannose (25 mM). SDS-PAGE analysis showed that APL is composed of a major 34 kDa double band and a minor 8 and 9 kDa double band. APL showed thermostability at 60° C. Further studies are required in order to better physicochemically characterize this protein. / Lectinas são proteínas ubíquas na natureza, de origem não imune, que possuem ao menos um domínio não catalítico que se liga de forma específica e reversível a carboidratos. Em vegetais estão distribuídas em folhas, caules e sementes. A tribo Dalbergieae apresenta lectinas que mostram especificidade por diferentes carboidratos e apresentam atividades biológicas diversas como indução de edema em pata de rato, liberação de mediadores quimiotáticos por macrófagos, atividade vasorelaxante em aortas de ratos, dentre outras. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e caracterizar físico-quimicamente uma lectina presente em sementes de Andira pisonis (tribo Dalbergieae). Sementes de Andira pisonis foram trituradas até obtenção de fino pó e as proteínas totais foram extraídas em sulfato de amônio 1M. As proteínas solúveis foram submetidas a atividade hemaglutinante, quantificação pelo método de Bradford e ensaios de inibição da atividade hemaglutinante. A lectina de sementes de Andira pisonis (APL) foi purificada através de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose, eluída em tampão glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M. A fração eluída foi dialisada contra água destilada, liofilizada e submetida a cromatografia de troca iônica em HiTrap SP XL 01. APL foi eluída com tampão acetato de sódio 20mM pH 4,5 em gradiente de NaCl 0-1M. APL hemaglutinou eritrócitos de coelho (tratados enzimaticamente), assim como outras lectinas da tribo Dalbergieae e apresentou especificidade por manose (25mM). Análise em PAGE-SDS mostrou que APL é composta por uma banda de 34 kDA e uma dupla banda de 8 e 9 kDA. APL apresentou termoestabilidade até 60°C. São necessários mais estudos de caracterização físico-química para melhor caracterizar esta proteína.

CARNEIRO, Victor Alves. Inibição de formação de biofilme bacteriano através de lectinas vegetais. 2007. 89 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-15T13:40:45Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:25:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) Previous issue date: 2007 / Natural and complementary medicine, especially phytotherapy, is becoming more and more useful to fulfill the needs of great part of the population when it comes to oral health, particularly in the developing countries. Among the phytotherapics, lectins may be valuable as anti-plaque and antimicrobial agents, since they can be intimately related with inference in biofilm formation, given that these proteins recognize carbohydrates in a specific and reversible way. Within that context, this study aimed to test the ability of five lectins (extracted from Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana and Hypnea cervicornis) in inhibiting the formation of biofilm and killing oral microorganisms(Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). The antimicrobial activity of the five lectins tested was determined by the convetional test of microdilution in polystyrene plaques. The lectin concentrations assayed against the microorganisms varied from 2mg/mL to 31. 5μ g/mL. To evaluate the adherence, a semi -quantitative assay was perfomed within microtitulation plaques (96 wells), to where were added 100μL of each lectin, and then 100μL of bacterial suspension (108 CFU/mL). This material was incubated in 10% CO 2 atmosphere at 37ºC. Adherence was revealed and quantified by violet crystal staining. Absorption of violet crystal was determined by spectophotometry (595nm). Only ConA presented bactericide or bacteriostatic activity against the strains tested. The assay of inhibition of biofilm formation revealed that almost all lectins had this kind of activity, reducing the adherence in a significant way (p<0.05). ConA had no effect on the formation of biofilm for any bacteria tested. / A medicina natural e complementar, especialmente a fitoterapia, se torna cada vez mais utilizada no combate as necessidades de grande parte da população em saúde bucal, particularmente nos países em desenvolvimento. Dentre os fitoterápicos, as lectinas podem ter um valor como agentes antiplaca e antimicrobianos, uma vez que podem estar intimamente relacionadas com a interferência da formação do biofilme dos microrganismos, já que se tratam de proteínas que reconhece carboidratos de forma específica e reversível. O objetivo deste estudo foi testar in vitro a capacidade de inibição das lectinas isoladas das espécies de Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana e Hypnea cervicornis, na formação de biofilmes bacterianos e atividade antimicrobiana contra microrganismos orais (Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). A atividade antimicrobiana das cinco lectinas testadas foi determinada pelo teste convencional da microdiluição em placas de poliestireno, sendo testada as concentrações de 2mg/mL à 31,5μg/mL contra os microrganismos em estudo. Para avaliação de aderência foi feito um ensaio semiquantitativo de aderência em placas de microtitulação de poliestireno (96 poços), onde foi adicionado 100 μL de cada uma das lectinas, em seguida adicionada 100 μL de suspensão bacteriana (108 UFC/mL) e incubado a 37ºC em uma atmosfera de 10% de CO2. A aderência foi revelada e quantificada por tintura com cristal violeta. A absorção do cristal violeta foi determinada através da leitura no espectrofotômetro (595nm). Somente a lectina de ConA apresentou a atividade bactericida ou bacteriostática contra os microorganismos estudados. No teste de inibição da formação do biofilme, todas as lectinas testadas foram favoráveis na inibição, reduzindo significativamente a aderência (p< 0,05). A lectina de ConA não teve ação sobre a formação do biofilme de nenhumas das bactérias testadas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A medicina natural e complementar, especialmente a fitoterapia, se torna cada vez mais utilizada no combate as necessidades de grande parte da populaÃÃo em saÃde bucal, particularmente nos paÃses em desenvolvimento. Dentre os fitoterÃpicos, as lectinas podem ter um valor como agentes antiplaca e antimicrobianos, uma vez que podem estar intimamente relacionadas com a interferÃncia da formaÃÃo do biofilme dos microrganismos, jà que se tratam de proteÃnas que reconhece carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. O objetivo deste estudo foi testar in vitro a capacidade de inibiÃÃo das lectinas isoladas das espÃcies de Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana e Hypnea cervicornis, na formaÃÃo de biofilmes bacterianos e atividade antimicrobiana contra microrganismos orais (Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). A atividade antimicrobiana das cinco lectinas testadas foi determinada pelo teste convencional da microdiluiÃÃo em placas de poliestireno, sendo testada as concentraÃÃes de 2mg/mL à 31,5&#956;g/mL contra os microrganismos em estudo. Para avaliaÃÃo de aderÃncia foi feito um ensaio semiquantitativo de aderÃncia em placas de microtitulaÃÃo de poliestireno (96 poÃos), onde foi adicionado 100 &#956;L de cada uma das lectinas, em seguida adicionada 100 &#956;L de suspensÃo bacteriana (108 UFC/mL) e incubado a 37ÂC em uma atmosfera de 10% de CO2. A aderÃncia foi revelada e quantificada por tintura com cristal violeta. A absorÃÃo do cristal violeta foi determinada atravÃs da leitura no espectrofotÃmetro (595nm). Somente a lectina de ConA apresentou a atividade bactericida ou bacteriostÃtica contra os microorganismos estudados. No teste de inibiÃÃo da formaÃÃo do biofilme, todas as lectinas testadas foram favorÃveis na inibiÃÃo, reduzindo significativamente a aderÃncia (p< 0,05). A lectina de ConA nÃo teve aÃÃo sobre a formaÃÃo do biofilme de nenhumas das bactÃrias testadas. / Natural and complementary medicine, especially phytotherapy, is becoming more and more useful to fulfill the needs of great part of the population when it comes to oral health, particularly in the developing countries. Among the phytotherapics, lectins may be valuable as anti-plaque and antimicrobial agents, since they can be intimately related with inference in biofilm formation, given that these proteins recognize carbohydrates in a specific and reversible way. Within that context, this study aimed to test the ability of five lectins (extracted from Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana and Hypnea cervicornis) in inhibiting the formation of biofilm and killing oral microorganisms(Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). The antimicrobial activity of the five lectins tested was determined by the convetional test of microdilution in polystyrene plaques. The lectin concentrations assayed against the microorganisms varied from 2mg/mL to 31. 5&#956; g/mL. To evaluate the adherence, a semi -quantitative assay was perfomed within microtitulation plaques (96 wells), to where were added 100&#956;L of each lectin, and then 100&#956;L of bacterial suspension (108 CFU/mL). This material was incubated in 10% CO 2 atmosphere at 37ÂC. Adherence was revealed and quantified by violet crystal staining. Absorption of violet crystal was determined by spectophotometry (595nm). Only ConA presented bactericide or bacteriostatic activity against the strains tested. The assay of inhibition of biofilm formation revealed that almost all lectins had this kind of activity, reducing the adherence in a significant way (p<0.05). ConA had no effect on the formation of biofilm for any bacteria tested.

Lectinas estão situadas dentro de um grupo estruturalmente diverso de proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados com grande especificidade. Encontradas em diversos organismos, elas são moléculas extremamente úteis na caracterização de sacarídeos, como agentes mediadores de endereçamento de fármacos ou até mesmo como marcadores de superfície celular. A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica ligante de D-Galactose oriunda de sementes de Abrus pulchellus e classificada como proteína inativadora de ribossomo do tipo 2 (“type 2 ribosome-inactivating protein" - type 2 RIP). A cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC) foi previamente produzida em E. coli BL21(DE3). Neste presente trabalho, a rPBC é analisada quanto a sua atividade, interação com células de mamíferos “in vitro" e estabilidade estrutural. Os resultados indicam que a rPBC possui seletividade quanto a tipos celulares alvo e é endocitada ativamente, provavelmente compartilhando a via de endocitose descrita para outras RIPs. Além disto, a rPBC foi unida à cadeia catalítica e o heterodímero resultante demonstrou toxicidade similar à da holotoxina nativa, confirmando a atividade da rPBC e atribuindo-lhe papel essencial no mecanismo de intoxicação. Uma segunda parte deste trabalho tratou de outra lectina, extraída de sementes de Camptosema ellipticum. Recentemente, experimentos com extratos aquosos obtidos a partir de sementes de Camptosema ellipticum demonstraram possuir atividade hemaglutinante frente a hemácias humanas. Tal atividade foi atribuída a um dado componente protéico que foi então purificado através de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A proteína, então chamada camptosemina, demonstrou ocorrer na forma de um tetrâmero e cujo estado de oligomerização pode ser controlado pelo pH do meio. Informações sobre a seqüência primária na porção amino-terminal, obtidas por seqüenciamento de aminoácidos, permitiram o desenho de oligonucleotídeos degenerados para a amplificação e clonagem de seu cDNA. As seqüências dos clones obtidos foram submetidas a diversas rotinas de procura de dados do NCBI. Entre os resultados retornados encontraram-se a concanavalina e a aglutinina de amendoim, dois representantes da chamada família de lectinas de leguminosas. Representantes deste grupo compartilham com a camptosemina o tamanho de seus monômeros e a forma de controle de seus graus de oligomerização. O presente trabalho traz a caracterização preliminar da camptosemina quanto a sua seqüência primária e oligomerização através de técnicas de clonagem e de espectroscopia. Foi possível a clonagem de duas variantes para o cDNA da camptosemina cujas seqüências prevêem um peptídeo sinal N-terminal ausente na proteína madura. As seqüências primárias deduzidas são muito semelhantes entre si e em comparação com outros membros da família de lectinas de leguminosas. A camptosemina se demonstrou extremamente resistente a mudanças de temperatura, exibindo sua dissociação em monômeros somente sob pHs extremamente ácidos ou alcalinos. / Lectins have been placed in a structurally diverse group of proteins that bind carbohydrates and glycoconjugates with high specificity. Found in several organisms, they are extremely useful molecules in the characterization of saccharides, as drug delivery mediators, and even as cellular surface markers. Pulchellin is a D-Galactose-binding heterodimeric glycoprotein from Abrus pulchellus seeds and classified as a type-2 ribosome-inactivating protein (type-2 RIP). The recombinant pulchellin B (rPBC) was previously produced in E. coli BL21 (DE3). In the present work, rPBC is analyzed with respect to its interaction with mammal cells “in vitro" and structural stability. Results show that rPBC has selectivity for targeted cell types and that it is actively endocytosed, probably by the same route described for other RIPs. Furthermore, rPBC was bond to the catalytic chain and the resulting heterodimer has shown toxicity degree very similar to the native holotoxin, confirming rPBC activity and attributing it a essential role in the intoxication mechanism. A second part of this work has dealed with another lectin extracted from the seeds of Camptosema ellipticum. Recently, experiments with water-soluble extracts obtained from the seed of Camptosema ellipticum have shown to have hemagglutinative properties when assayed with human erythrocytes. Such biological activity was attributed to a certain proteic component that was purified by ion-exchange and size-exclusion chromatographies. The protein, so called camptosemin, has shown to occur as a tetramer and which oligomerization’s state could be driven by the environmental pH. Primary sequence information from the amino-terminal portion, obtained by aminoacid sequencing, allowed the design of degenerated oligonucleotides for the amplification and cloning of its cDNA. The obtained clones’ sequences were submitted to several NCBI data bank search scripts. Among the retrieved results were found concanavalin and peanut agglutinin, two representatives of the called legume lectins family. Members of this group share with camptosemin their monomer sizes and the way their oligomerization state can be driven. This present work characterizes camptosemin with respect to its sequence and oligomerization using cloning and spectroscopy techniques. It was possible the cloning of two cDNA variants for camptosemin which sequences deduce an N-terminal signal peptide absent in the mature protein. Deduced primary sequences are very similar to each other and to other legume lectin members. Camptosemin has shown being extremely temperature resistant, only dissociating in monomeric subunits under extremely acid or alkaline pHs.

CARNEIRO, Victor Alves. Efeito do metabólito bioativo e de lectinas vegetais sobre o crescimento de micro-organismos patogênicos. 2011. 144 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T14:20:26Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_vacarneiro.pdf: 5022871 bytes, checksum: 86384f0abc8798b9c8b5ca8856ae2d84 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:44:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_vacarneiro.pdf: 5022871 bytes, checksum: 86384f0abc8798b9c8b5ca8856ae2d84 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:44:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_vacarneiro.pdf: 5022871 bytes, checksum: 86384f0abc8798b9c8b5ca8856ae2d84 (MD5) Previous issue date: 2011 / Biofilms are communities of microbial cells embedded in a matrix of polymeric material consists mainly of polysaccharides that form on biotic or abiotic surface. The search for phytochemicals agents with potential anti-biofilm became an active area in scientific research. Lectins are proteins that bind carbohydrates of form specifically and reversibly, being able to agglutinate and precipitate cells and/or glycoconjugates. Due to their capacity to bind and recognize specific carbohydrates, lectins can be a potent toolin biofilm studies. These proteins can bind to the bacteria or prevent the interaction with the surface and consequently decrease biofilm formation. Other classes of biomolecules with applicability in this type of bacterial communities are the secondary metabolites isolated from plant tissues. The class of diterpenes, substances very common in plants, corresponds to a class of natural molecules with antimicrobial properties well established. T hus, the present study was to evaluate the antibacterial activity "in vitro" of plant lectins and diterpene casbano(CD), a secondary metabolite isolated from Croton nepetaefolius, aplant native to northeastern Brazil, against different pathogens microorganisms. The minimum inhibitory concentration, MIC, of planktonic growth was made by the standard techinique of microdilution determined by optical density at 640nm. Analisys of initial adhesion and biofilm formation were performed using polystyrene microtiter plates with quantification of biomass by the method of staining with crystal violet. The tests were performed with different concentrations of the products tested. The results showed that the lectin from Canavalia ensiformis had an antibacterial effect, inhibiting the planktonic growth of gram-positive bacteria. Other lectins showed an inhibition of initial adhesion and an inhibition of biofilm formation of some microorganisms. The CD had a biocidal activity and biostatic for most species tested, being able to affect also the formation of biofilm. In conclusion, these results showed that the lectins and casbane diterpene have a promising antibacterial activity, suggesting a possible application therapeutic for pharmacological treatment of infections associated with different infectious agents. / Biofilmes são comunidades de células microbianas incluídas em uma matriz de material polimérico constituído principalmente por polissacarídeos que se formam sobre uma superfície biótica ou abiótica. A busca de agentes fitoquímicos com potencial anti-biofilme tornou-se uma área ativa na pesquisa cientifica. Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos de forma específica e reversível, sendo capazes de aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados. Devido à sua capacidade de ligar e reconhecer carboidratos específicos, as lectinas podem ser uma potente ferramenta para estudos de biofilmes. Estas proteínas podem se ligar às bactérias ou impedir a interação com a superfície e, conseqüentemente, diminuir a formação de biofilme. Outras classes de biomoléculas com grande aplicabilidade nesse tipo de comunidades bacterianas são os metabólitos secundários isolados de tecidos vegetais. A classe dos diterpenos, substancias bastante comuns em plantas, corresponde a uma classe de moléculas naturais com propriedades antimicrobianas bem estabelecidas. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antibacteriana “in vitro” de lectinas vegetais e do diterpeno casbano (DC), um metabólito secundário isolado de Croton nepetaefolius, uma planta nativa do Nordeste brasileiro, contra diferentes microrganismos patogênicos. A concentração mínima inibitória do crescimento planctônico foi realizado pela técnica padrão de microdiluição determinada através da densidade óptica a 640nm. Os ensaios de adesão inicial e formação de biofilme foram realizados utilizando placas de microtitulação de poliestireno com quantificação da biomassa pelo método de coloração com cristal de violeta. Os ensaios foram realizados com diferentes concentrações dos produtos testados. Os resultados demonstraram que a lectina de Canavalia ensiformis apresentou um efeito antibacteriano, inibindo o crescimento planctônico de bactérias Gram- positivas. Outras lectinas apresentaram uma inibição da adesão inicial, assim como na inibição da formação do biofilme de alguns microrganismos. O DC teve uma atividade biocida e bioestática para a maioria das espécies testadas, sendo capaz de prejudicar também a formação do biofilme. Em conclusão, estes resultados mostraram que as lectinas e diterpeno casbano, importantes classes de produtos naturais, podem desempenhar atividade antibacteriana promissora, sugerindo um possível potencial terapêutico para o tratamento farmacológico de infecções associadas a diferentes agentes infecciosos.

Lectinas estão situadas dentro de um grupo estruturalmente diverso de proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados com grande especificidade. Encontradas em diversos organismos, elas são moléculas extremamente úteis na caracterização de sacarídeos, como agentes mediadores de endereçamento de fármacos ou até mesmo como marcadores de superfície celular. A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica ligante de D-Galactose oriunda de sementes de Abrus pulchellus e classificada como proteína inativadora de ribossomo do tipo 2 (“type 2 ribosome-inactivating protein” - type 2 RIP). A cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC) foi previamente produzida em E. coli BL21(DE3). Neste presente trabalho, a rPBC é analisada quanto a sua atividade, interação com células de mamíferos “in vitro” e estabilidade estrutural. Os resultados indicam que a rPBC possui seletividade quanto a tipos celulares alvo e é endocitada ativamente, provavelmente compartilhando a via de endocitose descrita para outras RIPs. Além disto, a rPBC foi unida à cadeia catalítica e o heterodímero resultante demonstrou toxicidade similar à da holotoxina nativa, confirmando a atividade da rPBC e atribuindo-lhe papel essencial no mecanismo de intoxicação. Uma segunda parte deste trabalho tratou de outra lectina, extraída de sementes de Camptosema ellipticum. Recentemente, experimentos com extratos aquosos obtidos a partir de sementes de Camptosema ellipticum demonstraram possuir atividade hemaglutinante frente a hemácias humanas. Tal atividade foi atribuída a um dado componente protéico que foi então purificado através de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A proteína, então chamada camptosemina, demonstrou ocorrer na forma de um tetrâmero e cujo estado de oligomerização pode ser controlado pelo pH do meio. Informações sobre a seqüência primária na porção amino-terminal, obtidas por seqüenciamento de aminoácidos, permitiram o desenho de oligonucleotídeos degenerados para a amplificação e clonagem de seu cDNA. As seqüências dos clones obtidos foram submetidas a diversas rotinas de procura de dados do NCBI. Entre os resultados retornados encontraram-se a concanavalina e a aglutinina de amendoim, dois representantes da chamada família de lectinas de leguminosas. Representantes deste grupo compartilham com a camptosemina o tamanho de seus monômeros e a forma de controle de seus graus de oligomerização. O presente trabalho traz a caracterização preliminar da camptosemina quanto a sua seqüência primária e oligomerização através de técnicas de clonagem e de espectroscopia. Foi possível a clonagem de duas variantes para o cDNA da camptosemina cujas seqüências prevêem um peptídeo sinal N-terminal ausente na proteína madura. As seqüências primárias deduzidas são muito semelhantes entre si e em comparação com outros membros da família de lectinas de leguminosas. A camptosemina se demonstrou extremamente resistente a mudanças de temperatura, exibindo sua dissociação em monômeros somente sob pHs extremamente ácidos ou alcalinos. / Lectins have been placed in a structurally diverse group of proteins that bind carbohydrates and glycoconjugates with high specificity. Found in several organisms, they are extremely useful molecules in the characterization of saccharides, as drug delivery mediators, and even as cellular surface markers. Pulchellin is a D-Galactose-binding heterodimeric glycoprotein from Abrus pulchellus seeds and classified as a type-2 ribosome-inactivating protein (type-2 RIP). The recombinant pulchellin B (rPBC) was previously produced in E. coli BL21 (DE3). In the present work, rPBC is analyzed with respect to its interaction with mammal cells “in vitro” and structural stability. Results show that rPBC has selectivity for targeted cell types and that it is actively endocytosed, probably by the same route described for other RIPs. Furthermore, rPBC was bond to the catalytic chain and the resulting heterodimer has shown toxicity degree very similar to the native holotoxin, confirming rPBC activity and attributing it a essential role in the intoxication mechanism. A second part of this work has dealed with another lectin extracted from the seeds of Camptosema ellipticum. Recently, experiments with water-soluble extracts obtained from the seed of Camptosema ellipticum have shown to have hemagglutinative properties when assayed with human erythrocytes. Such biological activity was attributed to a certain proteic component that was purified by ion-exchange and size-exclusion chromatographies. The protein, so called camptosemin, has shown to occur as a tetramer and which oligomerization’s state could be driven by the environmental pH. Primary sequence information from the amino-terminal portion, obtained by aminoacid sequencing, allowed the design of degenerated oligonucleotides for the amplification and cloning of its cDNA. The obtained clones’ sequences were submitted to several NCBI data bank search scripts. Among the retrieved results were found concanavalin and peanut agglutinin, two representatives of the called legume lectins family. Members of this group share with camptosemin their monomer sizes and the way their oligomerization state can be driven. This present work characterizes camptosemin with respect to its sequence and oligomerization using cloning and spectroscopy techniques. It was possible the cloning of two cDNA variants for camptosemin which sequences deduce an N-terminal signal peptide absent in the mature protein. Deduced primary sequences are very similar to each other and to other legume lectin members. Camptosemin has shown being extremely temperature resistant, only dissociating in monomeric subunits under extremely acid or alkaline pHs.

LANDIM, Patrícia Gadelha de Castro. Xiloglucanas e galactomananas de leguminosas: interação com lectinas D-galactose-ligantes. 2007. 100 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-27T12:54:01Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_pgclandim.pdf: 1768165 bytes, checksum: f8cb9e6a16de4f08d984b33f047c8bd5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:08:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_pgclandim.pdf: 1768165 bytes, checksum: f8cb9e6a16de4f08d984b33f047c8bd5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:08:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_pgclandim.pdf: 1768165 bytes, checksum: f8cb9e6a16de4f08d984b33f047c8bd5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Polysaccharides are found in large quantity in seeds and they represent the main compounds of cell wall or reservoir. Among reservoir compounds, it included cotyledonary xyloglucans and endospermic galactomannans. The xyloglucans are made of a main chain of β-D-(1→4)-glucan with α-(1→6) ramifications of D-xylopyranoside or β-D-galactopyranoside-(1→2)-D-xylopyranoside residues. Endospermic galactomannans are polimeric chains of β-D-mannopyranosil (1→4) and replaceabled in O-6 for units of α-D-galactopyranosil. The aim of this work is investigate the interaction of xyloglucans and galactomannans with galactose bounding lectins and show the possibility of the usage of these polysaccharides as cheap and useful chromatographic matrices for isolation and determination of anomeric specificity of galactose bounding lectins. The interactions of lectins from seeds of Artocarpus integrifolia (frutalin), Artocarpus incisa (jacalin), Ricinus communis (ricin) e Arachis hypogaea (PNA) were performed with coluns of xyloglucans of seeds from Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei and Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectively) and galactomannans from Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina and Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectively). The galactomannans showed the best colun interaction capacity for the jacalin (MA – 0,92 mg ; MM – 1,48 mg ; MD –0,88 mg ; MS – 0,83 mg) and frutalin (MA – 0,99 mg ; MM – 1,09 mg ; MD - 0,94 mg ; MS - 0,85 mg) lectins. Remarkably the M. scabrella galactomannan showed the best colun interaction among all lectins analysed. On the other hand, ricin was better hold in coluns made of xyloglucan (MMu – 2,17 mg ;MJ – 1,30 mg; MC – 2,83 mg). For PNA lectin, differences were detected in colun interaction capacity. The best colun interaction was with the M. sloanei matrix (0,12 mg) for PNA lectin. All coluns were fill with sample extract of flour from seeds and hemagglutination assays was performed with PI and PII. In these assays, hemagglutination activity was detected in both PI and PII from the coluns. For ricin, toxic activity was made and it was detected for all obtained chromatographic samples. With SDS-PAGE it was possible confirmed the purification of the studied lectins. The bands in polyacrilamid gel were the same for the lectins purified. In conclusion, it can be suggested the usage of xyloglucans and galactomannans for isolation, purification and determination of anomeric specificity of galactose-bounding lectins. / Polissacarídeos ocorrem em grandes quantidades nas sementes como componentes da parede celular ou como reserva. Dentre estes últimos, incluem-se as xiloglucanas cotiledonárias e as galactomananas endospérmicas. As xiloglucanas apresentam uma cadeia principal de β-D-(1→4)-glucana ramificada com ligações α-(1→6) por resíduos D-xilopiranosídeos ou β-D-galactopiranosídeo-(1→2)-D-xilopiranosídeos, enquanto as galactomananas endospérmicas consistem em cadeias poliméricas de resíduos β-D-manopiranosil (1→4) ligados, substituídos em O-6 por unidades de α-D-galactopiranosil. O objetivo deste trabalho foi analisar a interação de xiloglucanas e galactomananas com lectinas galactose-ligantes e, assim, sugerir o uso de tais polissacarídeos como alternativa barata e eficaz na preparação de matrizes cromatográficas para o isolamento e determinação da especificidade anomérica de novas lectinas. Dessa forma, as interações das lectinas das sementes de Artocarpus integrifolia (frutalina), Artocarpus incisa (jacalina), Ricinus communis (ricina) e Arachis hypogaea (PNA) com matrizes de xiloglucanas de sementes de Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei e Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectivamente) e de galactomananas de Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina e Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectivamente) foram analisadas. As galactomananas apresentaram melhor capacidade de retenção da jacalina (MA – 0,92 mg ; MM – 1,48 mg ; MD –0,88 mg ; MS – 0,83 mg) e da frutalina (MA – 0,99 mg ; MM – 1,09 mg ; MD – 0,94 mg ; MS – 0,85 mg), lectinas que possuem especificidade por α-D-galactose. Vale destacar que a galactomanana de M. scabrella apresentou melhor capacidade de retenção da lectinas testadas. Por outro lado a ricina, capaz de ligar-se aos dois anômeros, mas que se liga preferencialmente ao anômero β, teve maior massa retida nas colunas de xiloglucana (MMu – 2,17 mg ;MJ – 1,30 mg; MC – 2,83 mg). Houve diferença nos perfis de retenção da PNA, que também se liga aos anômeros α e β da galactose, sendo que a melhor retenção foi na coluna contendo matriz de M. sloanei (0,12 mg). As colunas foram todas saturadas com extrato bruto a partir das farinhas das sementes, para que se utilizasse a capacidade máxima de retenção de cada matriz. Atividade hemaglutinante foi detectada em ambos os picos PI e PII. Para a ricina, atividade tóxica foi realizada e detectada para todos os PII obtidos. Por meio de SDS-PAGE, a pureza de cada uma das lectinas foi confirmada. Diante dos resultados expostos, pode-se sugerir o uso de xiloglucanas e galactomananas para o isolamento, purificação e determinação da especificidade anomérica de lectinas galactose-ligantes.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1211143 bytes, checksum: 23a2b34a9ee3ee070ebfce58519b026d (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Canavalia brasiliensis belongs to the family of Leguminosae and known as feijão-bravo-do-Ceará, it s a species from Americas. In Brazil it can be found in the North, Northeast, Midwest and Southeast. Many species of plant contain carbohydrate-binding proteins which are commonly called lectins or agglutinins which are distributed in virtually all living organisms. That study aimed to detect, purify and characterize physico-chemically a ConBr new lectin from extract of the seeds of C. brasiliensis and to evaluate its relationship with pathogenic bacteria and inflammatory processes. The lectin, with affinity for rabbit erythrocytes, was isolated by affinity chromatography on matrix Sephadex G-50 followed by chitin, and molecular exclusion in HPLC system. The purity and the molecular weight of the lectin were determined by SDS-PAGE. The protein was characterized as to the nature glycoprotein, the specific sugars and glycoproteins, resistance to pH, temperature, denaturing agents, reducing, oxidizing and chelating agents. The lectin on SDS-PAGE showed two bands of 25 and 45 kDa and a content of 47 μg of carbohydrates. It was specific for mannose, fructose and maltose. It was inactivated when heated to 90 °C and 100 °C for 10 minutes and at pH 5,0 and 13.0. It had reduced their activity in the presence of urea 4 and 8 M and sodium metaperiodate, and increased with β-mercaptoethanol. It s a metalloprotein which depend of Mg2+ for stabilizing its carbohydrate biding site. It didn t present activity against Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 and in the carrageenan-induced peritonitis model in mice, the lectin didn t have toxicity to animals and showed anti-inflammatory effect reducing the blood vessel permeability and migration of neutrophils in the peritoneum of mice. / Canavalia brasiliensis pertence à família Leguminosae e sendo conhecida como feijão-bravo-do-Ceará, é uma espécie predominante do Continente Americano. No Brasil pode ser encontrada nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Muitas espécies de plantas contêm proteínas de ligação a carboidratos as quais são comumente chamadas de lectinas ou aglutininas as quais são distribuídas em praticamente todos os organismos vivos. O referido trabalho objetivou detectar, purificar e caracterizar fisico-quimicamente uma nova lectina ConBr do extrato das sementes de C. brasiliensis e avaliar sua relação com bactérias patogênicas e processos inflamatórios. A lectina com afinidade por eritrócitos de coelho foi isolada através de cromatografia de afinidade em matriz de sephadex G-50 seguida de quitina; e exclusão molecular em sistema HPLC. O grau de pureza e o peso molecular da lectina foram determinados por eletroforese SDS-PAGE. A proteína foi caracterizada quanto à natureza glicoproteica, especificidade a açúcares e glicoproteínas, resistência ao pH, temperatura, agentes desnaturantes, redutores, oxidantes e quelantes. A lectina apresentou na SDS-PAGE duas bandas de 25 e 45 kDa e um teor de 47 μg de carboidratos. Foi específica para manose, frutose e maltose. Foi inativada quando aquecida a 90 °C e 100 °C durante 10 minutos e em pH 5,0 e 13,0. Teve sua atividade reduzida na presença de ureia 4 e 8 M e do metaperiodato de sódio; e aumentada com o β-mercaptoetanol; é uma etaloproteína dependente de Mg2+ para a estabilização do seu sítio de ligação a carboidratos. Não apresentou atividade frente às bactérias Bacillus subtilis ATCC 0516, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, Staphilococcus aureus ATCC 6538 e S. aureus ATCC 25925 e no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, a lectina não se mostrou tóxica para os animais e exibiu efeito antiinflamatório através da redução da permeabilidade dos vasos sanguíneos e da migração dos neutrófilos no peritôneo dos animais.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas ubÃquas na natureza, de origem nÃo imune, que possuem ao menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga de forma especÃfica e reversÃvel a carboidratos. Em vegetais estÃo distribuÃdas em folhas, caules e sementes. A tribo Dalbergieae apresenta lectinas que mostram especificidade por diferentes carboidratos e apresentam atividades biolÃgicas diversas como induÃÃo de edema em pata de rato, liberaÃÃo de mediadores quimiotÃticos por macrÃfagos, atividade vasorelaxante em aortas de ratos, dentre outras. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e caracterizar fÃsico-quimicamente uma lectina presente em sementes de Andira pisonis (tribo Dalbergieae). Sementes de Andira pisonis foram trituradas atà obtenÃÃo de fino pà e as proteÃnas totais foram extraÃdas em sulfato de amÃnio 1M. As proteÃnas solÃveis foram submetidas a atividade hemaglutinante, quantificaÃÃo pelo mÃtodo de Bradford e ensaios de inibiÃÃo da atividade hemaglutinante. A lectina de sementes de Andira pisonis (APL) foi purificada atravÃs de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose, eluÃda em tampÃo glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M. A fraÃÃo eluÃda foi dialisada contra Ãgua destilada, liofilizada e submetida a cromatografia de troca iÃnica em HiTrap SP XL 01. APL foi eluÃda com tampÃo acetato de sÃdio 20mM pH 4,5 em gradiente de NaCl 0-1M. APL hemaglutinou eritrÃcitos de coelho (tratados enzimaticamente), assim como outras lectinas da tribo Dalbergieae e apresentou especificidade por manose (25mM). AnÃlise em PAGE-SDS mostrou que APL à composta por uma banda de 34 kDA e uma dupla banda de 8 e 9 kDA. APL apresentou termoestabilidade atà 60ÂC. SÃo necessÃrios mais estudos de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica para melhor caracterizar esta proteÃna. / Lectins are ubiquitous proteins in nature, of non-immune origin, which have at least one non-catalytic domain that binds carbohydrates specifically and reversibly. They can be found in vegetables leaves, stems and seeds. The Dalbergieae tribe has lectins which have specificity for different carbohydrates and also have several biological activities such as induction of rat paw edema, release of chemotactic mediators by macrophages, vasorelaxant effect in rat aortas, and others. This study aimed to isolate, purify and physiochemically characterize a lectin found in seeds of Andira pisonis (Dalbergieae tribe). Andira pisonis seeds were ground into a fine powder and subjected to total protein extraction in 1 M ammonium sulfate. Soluble proteins were subjected to hemagglutination activity, quantification by the Bradford method and essays of hemagglutination inibition activity by sugar. The lectin from Andira pisonis (APL) was purified by affinity chromatography on Sepharose- Mannose matrix eluted in 0.1 M glycine buffer pH 2.6 with 0.15 M NaCl. The eluted fraction was dialyzed against distilled water, lyophilized and subjected to ion exchange chromatography on HiTrap SP XL 01. APL was eluted on 20 mM sodium acetate buffer pH 4.5 gradient of 0-1M NaCl. APL hemagglutinated rabbit erythrocytes (enzymatically treated) and other lectins from the tribe Dalbergieae and showed specificity for mannose (25 mM). SDS-PAGE analysis showed that APL is composed of a major 34 kDa double band and a minor 8 and 9 kDa double band. APL showed thermostability at 60 C. Further studies are required in order to better physicochemically characterize this protein.

GONÇALVES, Nidyedja Goyanna Gomes. Ação da lectina de Dioclea altissima sobre células tumorais: Citotoxidade e Perfil Proteômico da Linhagem PC3M. 2012. 106 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-27T12:21:35Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:07:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:07:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) Previous issue date: 2012 / Recently, plant lectins have attracted great interest due to their several biological activities of which stands out the antitumoral action in vivo and in vitro that in general result in inhibition of cell growth and induction of cell death by apoptosis. In the present study, it was investigated the effect of the Dioclea altissima (DAL) lectin, a legume alfa-D-mannose ligand lectin on A549 (lung cancer), OVCAR-8 (ovarian cancer) and PC3M (prostate cancer) and normal line PBMC (cell blood tissue). DAL was isolated and purified by affinity chromatography on a Sephadex G-50 column and its cytotoxicity was evaluated by MTT assay. DAL was selectively cytotoxic to cancer cells A549, PC3M after 48 and 72 hours of incubation, and OVCAR-8 after 72 hours of treatment with DAL (CI50 values between 23.0 e 55.7 μg/mL). Moreover, it was observed cell agglutination from 24 hours of incubation. Comet assay revealed DAL does not cause direct DNA damage. The line PC3M was selected for proteomic analysis by mass spectrometry (nanoUPLC® nanoESI-MSE) to present the best evidence of sensitivity to DAL. PC3M line was treated with various concentrations of DAL during 24, 48 e 72 hours, it was identified a total of 837 proteins, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). The study of differential protein expression of the DAL-treated PC3M cells compared to control demonstrated apoptotic effect generated, mainly, via ER stressed-dependent. / Nas últimas décadas, as lectinas vegetais têm atraído grande interesse devido às suas diversas atividades biológicas das quais se destaca a ação antitumoral in vivo e in vitro que, em geral, causa a inibição do crescimento celular e a indução da morte celular por apoptose. No presente estudo, foi investigado o efeito da lectina de Dioclea altissima (DAL), uma lectina de leguminosa, alfa-D-manose ligante, sobre as linhagens tumorais A549 (carcinoma pulmonar), OVCAR-8 (carcinoma de ovário) e PC3M (carcinoma de próstata) e linhagem normal CMSP (células do tecido sanguíneo). DAL foi isolada e purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50 e sua citotoxicidade foi avaliada através do ensaio do MTT. DAL foi seletivamente citotóxica para as células cancerígenas A549, PC3M, após 48 e 72 horas de incubação, e para OVCAR-8, após 72 horas de tratamento apresentando valores de CI50 entre 23,0 e 55,7 μg/mL, promovendo aglutinação celular a partir de 24 horas de incubação. DAL não se mostrou citotóxica para células normais. O teste do cometa revelou que DAL não causa dano direto ao DNA. A linhagem PC3M foi selecionada para análise proteômica por espectrometria de massas (nanoUPLC® nanoESI-MSE) por apresentar maior sensibilidade à DAL. Após tratamento das células com diversas concentrações de DAL, por 24, 48 e 72 horas, foi identificado um total de 837 proteínas válidas, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). O estudo das proteínas diferencialmente expressas das células tratadas com a lectina em relação ao controle definiu o efeito citotóxico de DAL em PC3M como apoptótico gerado, principalmente, via estresse do retículo endoplasmático.