Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.

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Devant des besoins grandissants en produits biopharmaceutiques pour la santé humaine, les plateformes d'expression végétales proposent une alternative prometteuse aux approches classiques pour la production efficiente de protéines recombinantes. Alors que des études récentes mettaient en lumière l'importance des conditions de culture sur le rendement en protéines dans les plantes, l'impact d'un mode de culture hydroponique sur l'accumulation de ces protéines demeure méconnu, notamment pour l'hôte d'expression Nicotiana benthamiana utilisé couramment pour l'expression de protéines d'intérêt médical. Jusqu'ici, les études s'intéressant à l'impact des conditions de culture ont considéré des plants cultivés en pots alors que l'industrie s'oriente désormais vers des systèmes culturaux hydroponiques mieux adaptés à l'automatisation des procédures et à une utilisation plus rationnelle des ressources du milieu. Dans ce contexte, nous avons testé ici l'hypothèse de recherche selon laquelle un mode de culture hydroponique influence la distribution et l'accumulation d'un vaccin antigrippal, l'hémagglutinine H1, dans N. benthamiana. L'objectif général du projet était de cartographier le patron d'accumulation de l'antigène H1 dans la plante cultivée sous différentes conditions, incluant le mode de culture à proprement parler, différentes densités de culture et des intensités lumineuses variables. En bref, nos résultats indiquent qu'une plante cultivée en gouttières hydroponiques montre une biomasse foliaire redistribuée vers le sommet et un rendement en H1 supérieur comparé aux plantes cultivées en pots. Une densité de culture élevée en mode hydroponique a peu d'incidence sur la production de biomasse foliaire et le rendement en H1 à l'échelle de la plante, y compris lorsqu'exprimé par unité de surface de serre. Enfin, une intensité lumineuse élevée pendant la phase de croissance des plantes en cultures hydroponiques conduit à une biomasse foliaire plus importante avant l'étape d'expression protéique à proprement parler, sans influence marquée toutefois sur le rendement spécifique en antigène H1 dans les feuilles.

L’Ataxie de Friedreich est une maladie génétique rare et grave, associant une neurodégénérescence, une cardiomyopathie et un diabète. Elle est causée par une réduction drastique d’une protéine mitochondriale appelée frataxine. L’approche de notre laboratoire sera donc de développer sur des cellules en culture et dans un modèle animal une thérapie moléculaire qui aura pour but de fournir aux cellules une protéine frataxine recombinante et réduire si possible les symptômes de la maladie. Afin de permettre la transduction de la frataxine, nous l'avons fusionné à un domaine de transduction protéique (Cell Penetrating Peptides, CPP) comme Tat ou Pep-1. Ces peptides sont bien connus pour leur capacité d’acheminer, dans les cellules, les protéines auxquelles ils sont fusionnés par des vésicules d’endocytose, mais également d’être libérées de ces derniers pour participer au métabolisme de la cellule. Des observations préliminaires obtenues, nous concluons que les protéines Tat-Frataxine et Pep-1-Frataxine assurent in vitro et in vivo la viabilité des cellules déficientes en frataxine endogène. / Friedreich Ataxia is a rare and serious genetic disease involving neurodegeneration, cardiomyopathy and diabetes. It is caused by a drastic reduction of a mitochondrial protein called frataxin. The approach of the laboratory will be to develop on in vitro cells and in vivo mice models, a molecular therapy that will aim to provide the cells with a recombinant protein frataxin and if possible reduce the symptoms of the disease. To enable transduction of frataxin, we fused it to a protein transduction domain (Cell Penetrating Peptides, CPP), Tat or Pep-1. These peptides are well known for their ability to allow the penetration into the cells of the proteins to which they are fused through endocytosis vesicles, but also to be released from these vesicles to take part in the cell metabolism. Preliminary observations led us to conclude that the Tat-Frataxin and Pep-1-Frataxin protein enhance in vitro and in vivo the viability of cells deficient in endogenous frataxin.

La vision est rendue possible grâce à la conversion du signal lumineux en un signal électrique par la cascade de phototransduction visuelle, qui implique plusieurs protéines incluant la phosphodiestérase (PDE). L’inactivation des différentes protéines de la phototransduction est primordiale pour que les photorécepteurs retrouvent leur sensibilité aux changements d’intensité lumineuse. Au cours de ce processus, un complexe de protéines incluant la R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactive la PDE. La R9AP permet l’ancrage d’un complexe protéique à la membrane des disques des photorécepteurs via son segment C-terminal hydrophobe. Des mutations au niveau de la séquence de la R9AP mènent à une maladie appelée bradyopsie qui se caractérise notamment par une photophobie et une difficulté à suivre des objets en mouvement. Cette maladie peut être causée par la perte de la liaison membranaire de la R9AP en raison de mutations menant à une modification de la séquence en acides aminés de son segment C-terminal. La liaison membranaire de la R9AP joue donc un rôle majeur dans l’inactivation de la PDE. Par contre, aucune donnée de liaison membranaire et structurale n’est disponible pour cette protéine. Nous avons donc initié la caractérisation de la structure et de la liaison membranaire de différentes formes de la R9AP, soit la protéine avec et sans son segment C-terminal (∆TM, R9AP∆TM) ainsi que le segment C-terminal seul. Afin d’obtenir la R9AP pure, nous avons cloné, surexprimé et purifié la R9AP∆TM en fusion avec différentes étiquettes de solubilisation/purification. Les protéines recombinantes ont été produites à l’aide d’un système d’expression bactérien. En plus de permettre d’obtenir la R9AP pure pour caractériser sa structure et sa liaison membranaire, ces travaux ont significativement contribué à faire avancer les connaissances à propos de l’utilisation des étiquettes de purification/solubilisation en fusion avec une protéine d’intérêt. En effet, nous avons effectué une étude systématique pour étudier l’impact de la conception des protéines de fusion sur la solubilité, l’expression et la purification de protéine d’intérêt. Il s’agit de la première étude systématique évaluant l’effet du positionnement et de l’identité des différentes étiquettes de purification/solubilisation sur ces paramètres. Également, la production des protéines recombinantes a permis d’identifier un site alternatif d’initiation de la traduction dans la séquence de l’étiquette GST (glutathione S-transférase) qui cause l’expression d’une protéine de fusion tronquée. Cette observation aura certainement un fort impact compte tenu de l’utilisation répandue de l’étiquette GST. Concernant les résultats obtenus avec la R9AP, des données de centrifugation ont montré que la protéine complète est beaucoup moins soluble que la R9AP∆TM, ce qui suggère un rôle important du segment C-terminal hydrophobe dans la solubilité de cette protéine. Ainsi, seulement la structure et la liaison membranaire de la R9AP∆TM ont pu être investiguées dans le cadre de cette thèse. Des mesures par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont montré que la R9AP∆TM ainsi que le peptide C-terminal sont majoritairement constitués d’hélices alpha, ce qui appuie les prédictions structurales de cette protéine et un rôle d’ancrage membranaire de son segment C-terminal. Également, les mesures de liaison membranaire à l’aide des monocouches de Langmuir ont montré que ce segment C-terminal seul possède une forte affinité pour la majorité des phospholipides qui sont représentatifs de la composition lipidique des photorécepteurs. En revanche, la R9AP sans son segment transmembranaire a montré une faible affinité pour la majorité de ces phospholipides. Ainsi, nos travaux suggèrent fortement que la spécificité de liaison membranaire de la R9AP est en majorité dictée par son segment C-terminal, ce qui supporte son rôle important dans l’ancrage du complexe protéique aux membranes des disques des photorécepteurs et dans la bradyopsie. / Visual phototransduction involves many proteins including phosphodiesterase, which leads to photoreceptor hyperpolarization and then signal transmission to the brain. Inactivation of the different proteins involved in this process is essential such that photoreceptors remain sensitive to changes in light intensity. In the course of this inactivation, a protein complex including R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactivates phosphodiesterase (PDE). R9AP anchors a protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments most likely by use of its C-terminal hydrophobic domain. Mutations in the coding sequence of R9AP lead to a visual disease called bradyopsia, which results in problems with adjusting to light variations and difficulties to follow moving objects. This disease can be caused by the loss of the membrane binding of R9AP as a result of mutations that modify the amino acid sequence of its C-terminal domain. Membrane binding of R9AP thus plays a major role in the inactivation process of PDE. However, membrane binding and structural data are still lacking for this particular protein. We have thus initiated the characterization of the structure and membrane binding of R9AP, including the fulllength protein, R9AP without its C-terminal domain (R9AP∆TM), as well as its Cterminal domain alone. In order to get pure R9AP, we have cloned, overexpressed and purified R9AP∆TM in fusion with solubility-enhancing/purification tags. Recombinant proteins were expressed using a bacterial expression system. This study allowed us to develop a procedure to obtain pure R9AP∆TM as well as to significantly improve our understanding of the use of fusion proteins. Indeed, we have performed a systematic analysis of the impact of the design of fusion proteins on their solubility, expression and purification. This study was the first one to evaluate the effect of both the identity and the position of the tags on the solubility, expression and purification of proteins of interest. Also, the production of R9AP∆TM recombinant proteins allowed us to identify an alternative translation initiation site in the coding sequence of the GST (glutathione S-transferase) tag, which results in the expression of a truncated fusion protein. This finding will certainly have an important impact when considering the extensive use of the GST tag. Results have shown that the R9AP∆TM protein is much more soluble than the fulllength protein, which suggests a major role of the C-terminal domain of R9AP for its solubility. Thus, the structure and the membrane binding of R9AP∆TM have been investigated within the scope of this thesis. Infrared spectroscopy as well as circular dichroism measurements have allowed determining that R9AP∆TM as well as the C-terminal domain adopt an alpha-helical structure, which is in good agreement with both the predicted structure of R9AP and the transmembrane role of its C-terminal domain. Also, Langmuir monolayer measurements revealed that the C-terminal segment has a high affinity for most of the phospholipids found in photoreceptor membranes. In contrast, R9AP∆TM has a low affinity for these phospholipids. Thus, our results demonstrate that the membrane binding of R9AP is highly dependent on its C-terminal segment, which is consistent with its important role in anchoring the protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments and in bradyopsia.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La población canina en Chile y el mundo, va en un permanente aumento, generando problemas tanto para los humanos como para los mismos animales. Por esto, existe actualmente gran interés en encontrar métodos eficientes, seguros y económicamente viables para la implementación de programas de control poblacional. Para controlar la población existen diversos mecanismos. Aquellos que pretenden disminuir la natalidad y por consiguiente, frenar el crecimiento, están enfocados en disminuir la reproducción de los individuos. Alternativas que involucran incluyan a los machos son altamente atractivas, por el mayor potencial reproductivo de los mismos, en relación al potencial de las hembras. Entre las diferentes técnicas, la inmunocastración surge como una posible herramienta para lograr estos objetivos, ya que ofrece ventajas en comparación a tratamientos hormonales, químicos, irradiatiavos y a la esterilización quirúrgica. Por lo anteriormente descrito se realizó este estudio, que tuvo como objetivo, visualizar los efectos de una vacuna recombinante contra la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) en la fertilidad canina, mediante la evaluación y observación de cambios en la espermatogénesis, esteroidogénesis y en conductas asociadas a la testosterona, tales como la agresividad, marcaje territorial y libido. Para esto, se inmunizaron 7 perros adultos mestizos con el péptido recombinante GnRX G/Q. Se aplicó una dosis única al día 1 y 21 con 250µg de proteína en 1 ml de adyuvante y al día 425, a dosis única con 500µg de proteína en 1 ml de adyuvante. Se evaluaron las concentraciones de inmunoglobulinas, concentraciones séricas de testosterona y, se realizaron observaciones y estudios conductuales. Además, se realizó un estudio histopatológico de testículo y epidídimo, al final del ensayo. En todos los animales inmunizados con la proteína recombinante GnRXG/Q hubo un aumento en la producción de inmunoglobulinas anti GnRXG/Q a partir del día 60 post vacunación. Además, fue posible observar que existe inmunogenicidad cruzada entre la hormona nativa GnRH-I y la proteína recombinante inoculada. Así mismo, se pudo visualizar una gran variabilidad individual en las respuestas de esteroidogénesis y conductuales. Recomendamos continuar con estudios para estandarizar dosificación y para evaluar la sensibilidad de diferentes kits disponibles para la estimación de las concentraciones plasmáticas o séricas de testosterona. Sin embargo, la inmunización fue capaz de disminuir la actividad espermatogénica y generar alteraciones en testículo y epidídimo de los animales vacunados, en relación al control no tratado. Por lo tanto, creemos que la vacuna creada en el laboratorio BIOVETEC de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, puede proponerse como una alternativa para el futuro control de la fertilidad e intervenir de manera efectiva en el problema de los caninos como plaga urbana

El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado “Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography”, cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coliBL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantesCutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimiento equivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

Au cours des dernières années, les plantes ont émergé comme une plateforme de choix pour la production de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou industriel. La moléculture n'est par contre pas exempte de difficultés alors que les protéines hétérologues rencontrent souvent, par exemple, des problèmes de dégradation causés par les protéases endogènes, avec un impact direct sur le rendement et la qualité du produit. Pour répondre à cette problématique, nous avons exprimé des inhibiteurs de protéases hétérologues dans le but de moduler in vivo l'activité protéolytique des plantes et ainsi permettre une protection de protéines recombinantes coexprimées. Afin d'évaluer sur une base globale le potentiel des inhibiteurs de protéases en moléculture, ces expériences furent réalisées avec différents systèmes d'expression et à différents endroits dans la cellule. La transformation de plants de pommes de terre (Solanum tuberosum) avec l'inhibiteur de cathepsine D de tomate (SICDI) ciblé dans le cytosol a provoqué une augmentation marquée du contenu en protéines foliaires associée à une hausse générale de la majorité des protéines endogènes. L'expression de cet inhibiteur à large spectre a par ailleurs permis la protection d'une protéine d'intérêt médical, l' alpha-l-antichymotrypsine humaine, exprimée de façon transitoire dans le cytosol des feuilles d'une lignée transgénique, illustrant le potentiel de la plateforme pour ce compartiment de la cellule. Puisque de nombreuses protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles complexes qui ont lieu dans le système de sécrétion, il apparaissait par la suite pertinent de vérifier l'effet des inhibiteurs de protéases dans ce dernier compartiment. Cette évaluation fut réalisée à l'aide d'un système d'expression transitoire par agroinfiltration chez Nicotiana benthamiana. La plateforme étant encore peu caractérisée, une attention particulière ad' abord été accordée aux réactions de la plante au cours du processus d'infiltration, résultant en l'élaboration d'une carte protéomique de l' apoplaste foliaire de N. benthamiana. La coexpression de deux inhibiteurs de protéases dans le système de sécrétion de N. benthamiana, soit SICDI et la cystatine 9 de tomate, avec l'anticorps d'intérêt médical C5-1 a par ailleurs permis une augmentation du rendement de l'anticorps, confirmant l'utilité des inhibiteurs de protéases dans la protection des protéines recombinantes sécrétées.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los streptococos patógenos para los equinos incluyen S. equi subsp. equi (S. equi), S. equi subsp. zooepidemicus, S. dysgalactiae subsp. equisimilis y S. pneumoniae cápsula Tipo III. S. equi causa gurma, una linfoadenitis purulenta altamente contagiosa que afecta a los miembros de la familia Equidae. Rápidos progresos se han realizado para la identificación de factores de virulencia y proteínas de S. equi. La mayoría de éstas son expresadas en la superficie bacteriana o son secretadas. Se ha demostrado la presencia de una proteína homóloga a la pneumococcal surface adhesin A (PsaA) de S. pneumoniae, en S. zooepidemicus y S. equi. La PsaA de S. pneumoniae, como otras proteínas, es inmunogénica y protege animales de laboratorio ante un desafío con neumococos. El objetivo de esta memoria fue obtener desde un aislado clínico de S. pneumoniae, una PsaA recombinante purificada desde E. coli BL21DE3. La metodología consistió en amplificar el gen PsaA por PCR y ligarlo al plasmidio de clonamiento (pETBlue-1), luego con la mezcla de ligación PsaA/pSTBlue-1 se transformó la cepa E. coli DH5; de las colonias transformadas, se purificó el plasmidio (PsaA/pSTBlue-1) por lisis alcalina, el cual fue sometido a digestión doble y, el fragmento liberado, fue ligado finalmente a un vector de expresión (pET-15b). Con la mezcla de ligación PsaA/pET-15b, se transformó la cepa E. coli BL21DE3, que expresó una proteína fusionada a una cola de histidina; la proteína fusionada, a su vez, se purificó en una columna con afinidad por histidina (Ni-Nta). La presencia de rPsaA fue analizada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y por Western blot, observándose la presencia de una proteína de 37 kDa., con la que reaccionó específicamente el anticuerpo policlonal de conejo anti His-tag. La secuencia nucleotídica del fragmento fue comparada en la base de datos BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov), encontrándose un 98% de identidad con la cepa S. pneumoniae R6. Además se identificaron cuatro regiones, con identidades superiores al 80%, similares a las del gen parcial mba de la proteína ligadora de metal/adhesina de S. equi, homóloga a PsaA de S. pneumoniae. El producto obtenido permitirá realizar estudios de formulación y evaluación, en modelo animal, de un prototipo de vacuna contra el gurma, basado en la proteína PsaA de S. pneumoniae.