Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T19:29:14Z No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Como a leishmaniose visceral (LV) ocorre principalmente em áreas onde os serviços de saúde são pouco desenvolvidos, o seu diagnóstico baseia-se principalmente no exame clínico, podendo ela ser confundida com outras doenças. Este estudo tem como objetivo a avaliação de antígenos recombinantes (rAg) visando o desenvolvimento e a validação de um “kit” para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral, que seja simples, barato e possa ser aplicado em condições precárias. O sistema a ser desenvolvido baseia-se no uso concomitante de múltiplas proteínas recombinantes. [MATERIAL E MÉTODOS] Vários rAg foram clonados e alguns deles foram analisados para o uso em sorodiagnóstico em 93 soros de pacientes com leishmaniose visceral, selecionados clinicamente e com diagnóstico confirmado parasitológicamente. [RESULTADOS] Um total de oito rAgs foi avaliado. Todos os soros de LV reconheceram pelo menos um dos rAgs, sendo portanto a sensibilidade do teste para o conjunto de antígenos, testados isoladamente, de 100%. A especificidade do teste para o conjunto de antígenos, avaliada bem preliminarmente em um total de 36 soros controle (de indivíduos sem leishmaniose), foi também de 100%. Nesta dissertação é descrita também uma maneira simples de identificar em bibliotecas de DNA exatamente rAgs que vão aumentar a sensibilidade de um ensaio imunodiagnóstico. / Since visceral leishmaniasis (VL) occurs in areas where health services are scarce, its diagnosis is based mainly on clinical examination, making possible it to be confounded with other diseases. The objective of this study is to evaluate recombinant antigens (rAg) aiming at developing and validating a kit for immunodiagnosis of the visceral leishmaniasis that were simple, cheap and could be put into practice under precarious CQnditions. The system to be developed is based on the concomitant use of multiple recombinant proteins. [MATERIAL AND METHODS] Several recombinant antigens have been cloned and analysed in order to be used in serodiagnosis with reference to the antibody detection in 93 sera of patients with visceral leishmaniasis, clinically selected and with diagnosis parasitologically confirmed. [RESULTS] A total of eight rAgs were evaluated. All sera of VL were recognized at least by one rAg, so that the sensitivity for the group of antigens, isolated tested, was 100%. The specificity, preliminarily evaluated in a total of 36 control sera (of individuals without leishmaniasis) was also 100%. This dissertation describes also a simple way to identify, in genetic libraries, exactly the rAgs that will increase immunoassay sensibility.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:35:56Z No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus vivo atenuado de Febre Amarela (FA) YF 17D é uma das vacinas virais mais seguras e eficazes já administradas a humanos, a qual induz uma resposta imune polivalente. Estas características tornam este vírus vacinal umaplataforma tecnológica para o desenvolvimento de novas vacinas. Através da tecnologia do clone infeccioso, nós utilizamos o arcabouço de YF 17D para expressar epítopo indutor de linfócitos T CD8 + , TEWETGQI e um fragmento imunogênico, ambos provenientes da proteína de superfície de amastigota 2 (ASP-2) de Trypanosoma cruzi, parasita causador da Doença de Chagas. Este estudo objetivou evidenciar o potencial deste vírus em expressar antígenos heterólogos. O epítopo TEWETGQI foi clonado e expresso baseando-se em doissítios distintos do genoma: na alça fgda proteína de Envelope (E) (YF17D/E200/Tc) e no sítio de clivagem proteolítico entre NS2B e NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). Uma terceira estratégia envolveu a montagem de um cassete heterólogo expressando um fragmento imunogênico de 120 aminoácidos de ASP-2 entre as proteínas E e NS1 (YF17D/ENS1/Tc). Nós investigamos se o sítio de expressão poderia influenciar a imunogenicidade do antígeno heterólogo. Assim, foram gerados vírus que se replicaram em cultura de células similar ao YF 17DD e permaneceram estáveis geneticamente após algumas passagens seriadas em célula Vero. A expressão dos antígenos heterólogos pelos vírus recombinantes revelou distintos padrões de detecção em diferentes regiões da célula. Outros estudos de caracterizaçãomostraram que os vírus YF17D/E200/Tc e YF17D/NS2B3/Tc são mais atenuados do que YF 17DD, quando inoculados via intracerebral em camundongos, sendo YF17D/E200/Tc o mais atenuado. Estudos de imunogenicidade revelaram que todos os vírus foram capazes de induzir anticorpos neutralizantes para Febre Amarela e o vírus YF17D/ENS1/Tc induziu anticorpos que reagem especificamente com amastigotas. Além disso, os vírus recombinantes induziram em camundongos imunizados uma resposta celular T produtora de interferon-gama(IFN-γ) antígeno-específica, além de uma resposta balanceada T CD4 + e T CD8 + para Febre Amarela. A vacinação de uma linhagem murina altamente suscetível à infecção por T. cruzicom um regime de dose-reforço homólogo que utilizou uma formulação de vírus YF 17D recombinantes induziu células T CD8 + TEWETGQI específicas após uma única dose, a qual poderia explicar o maior grau de proteção após desafio com T. cruzi. Assim, concluímos que a plataforma de YF 17D é útil para expressar antígenos de protozoários (T. cruzi) em regiões funcionais distintas do genoma com um impacto mínimo na viabilidade viral. Além disso, o uso de novas formulações contendo diferentes vírus YF 17D recombinantes parece ser uma estratégia promissora, a qual será explorada para outros patógenos. / The attenuated Yellow Fever (YF) 17D vaccine virus is one of the safest and most effective viral vaccines administered to humans, inwhich it elicits a polyvalent immune response. These characteristics make this vaccine virus a technological platform to the development of new vaccines. Herein, through the infectious clone technology, we used the YF 17D backbone to express a CD8 + T cell epitope, TEWETGQI and an immunogenic fragment, both originated from the Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease) Amastigote Surface Protein 2 (ASP-2). This study aimed to provide further evidence for the potential of this virus to express foreign epitopes. The TEWETGQI epitope was cloned and expressed in two different genomic insertion sites:the fg loop of the viral Envelope protein (E) (YF17D/E200/Tc) and the protease cleavage site between the NS2B and NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). A third strategy involved the construction of a heterologous cassette expressing an immunogenic ASP-2 fragment between E and NS1 (YF17D/ENS1/Tc). We investigated whether the site of expression had any influence on foreign antigen immunogenicity. In this sense, we generated virus that replicated similarly to vaccine virus YF 17DD in cell culture and remained genetically stable after some serial passages in Vero cells. The expression of the heterologous antigens by the recombinant viruses revealed distinct patterns of detection regarding different regions of the cell. Other characterization studies showed that YF17D/E200/Tc and YF17D/NS2B3/Tc were more attenuated than YF 17DD, when inoculated intracerebrally in mice, YF17D/E200/Tc being the most attenuated. Immunogenicity studies revealed that all viruses elicited neutralizing antibodies to YF virus and YF17D/ENS1/Tc virus induced antibodies that react specifically to amastigotes. Moreover, recombinant viruses generated an antigen specificgamma interferon (IFN-γ) mediated T-cell response in immunized mice as well as a balanced YF T CD4 + and T CD8 + response. Vaccination of a mouse lineage highly susceptible to infection by T. cruziwith a homologous prime-boost regimen of a YF 17D recombinant formulation elicited TEWETGQI specific CD8 + T cells after only one dose which could explain the higher degree of protection after T. cruzichallenge. We conclude that the YF 17D platform is useful to express Protozoan (T. cruzi) antigens at different functional regions of its genome with minimal reduction in vector viability. Besides, the use of new viral formulations composed of different YF 17D recombinant viruses seem to be a promising strategythat will be explored to other pathogens.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_argondizzo_ioc_dout_2013.pdf: 5655459 bytes, checksum: cd149a98d06f5e286a7d42e766c75ad0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Streptococcus pneumoniae é um patógeno colonizador da nasofaringe de humanos sendo responsável pela maioria das pneumonias adquiridas na comunidade, além de causar diversas doenças não-invasivas e invasivas. As vacinas disponíveis atualmente são sorotipo específicas, além disso as conjugadas apresentam limitado espectro de ação e alto custo de produção, ao passo que as polissacarídicas apresentam baixa imunogenicidade em crianças menores de dois anos de idade e adultos maiores de 65 anos, grupos os quais se encontram em alto risco de adquirirem doenças pneumocócicas. Assim, a utilização de proteínas recombinantes, associadas à virulência, é uma alternativa para a composição de vacinas. Neste trabalho, empregando a vacinologia reversa, selecionamos 20 genes que codificam proteínas com predição para localização na superfície celular. Dentre os candidatos selecionados amplificamos, clonamos e expressamos 19 genes e purificamos 10 proteínas recombinantes na forma solúvel. A expressão e localização das proteínas na superfície dos pneumococos foram confirmadas por meio de citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Além disso, observamos que 4 das 10 proteínas de pneumococos foram capazes de interagir com proteínas de matriz extracelular, embora os anticorpos policlonais gerados contra as proteínas recombinantes não tenham sido capazes de inibir a adesão da bactéria às células eucarióticas A549. A antigenicidade das proteínas recombinantes de pneumococo foi avaliada frente a soros de pacientes com meningite pneumocócica e observamos que duas proteínas foram reconhecidas por mais de 50% dos soros avaliados A presença e o grau de identidade dos genes selecionados em amostras de pneumococos de origem clínica foram avaliados por PCR e sequenciamento. Verificamos que a maioria dos genes está presente nas 51 amostras utilizadas neste estudo e demonstraram um alto grau de conservação nucleotídico e proteico entre as amostras de pneumococos, bem como em S. pseudopneumoniae, S. mitis e S. oralis, espécies que são altamente relacionadas geneticamente com os pneumococos. Assim, propomos que as proteínas 02232 (CbpE), 00080 (proteína ligadora de ATP/ABC transportadora), 00333 (componente permeásico/proteína ABC transportadora) e 01065 (histidina quinase) podem ser consideradas importantes alvos vacinais por serem expressas e expostas à superfície bacteriana e terem demonstrado interação com proteínas de matriz extracelular, podendo indicar algum papel destas proteínas no processo de adesão da bactéria às células do hospedeiro. Por outro lado não descartamos a possível importância das proteínas 02072 (PiuA) e 02009 (proteína hipotética) no processo de infecção de pneumococo, em virtude de essas proteínas terem sido reconhecidas por mais de 41% dos soros de pacientes / Streptococcus pneumoniae is a colonizer of the human nasopharynx, which acc ounts for most of the community-acquired pneumonia cases and can cause non-invasive and invasive diseases. C urrently available vaccines are serotype–specific; conjugate vaccines show a limited spectrum of action and high producti on costs, while the polysaccharide vaccine have low immunogenicity in children under t wo years of age and adults over 65, groups which are at high risk of acquiring pneumoco ccal disease . To overcome these problems, the use of recombinant proteins, associat ed with virulence, is an alternative to compose vaccines. In this work, 20 proteins with po sitive prediction for extracellular localization were selected by reverse vaccinology. A total of 19 genes were amplified, cloned and expressed. Ten proteins were purified in a solu ble form. The expression of the selected proteins on the pneumococci cell surface was confir med by flow cytometry and immunofluorescence. Data showed that 4 proteins were able to interact with extracellular matrix proteins. However, polyclonal antibodies aga inst the recombinant proteins were not able to inhibit the pneumococci adhesion to A549 eu karyotic cells. The protein antigenicity was evaluated by immunoblotting using antisera from patients with pneumococci meningitis and two proteins were recognized in more than 50% o f the serum samples. In order to evaluate the identity degree of the selected genes, PCR assays were carried out. Most of the genes were present in all clinical isolates and sho wed a high degree of nucleotide and amino acid conservation between pneumococci samples, as w ell as in S. pseudopneumoniae , S. mitis and S. oralis species. Thus, we propose that proteins 02232 (Cbp E), 00080 (ABC transporter, ATP-binding protein), 00333 (ABC-type antimicrobial peptide transport system, permease component) and 01065 (sensor histidine kinase, puta tive) can be considered important vaccine targets since they were expressed and exposed to th e bacterial surface and demonstrate interaction with extracellular matrix proteins, whi ch may indicate a role of these proteins in the process of adhesion of the bacteria to host cel ls. However, proteins 02072 (PiuA) and 02009 (hypothetical protein) should also be conside red for they were recognized by over 41% of sera from patients and could be important in the pneumococcal infection.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniero Civil en Biotecnología / En la actualidad, se realizan grandes esfuerzos en aplicar nuevos métodos de producción de compuestos novedosos de alto valor agregado. Un ejemplo de esto es el ácido hialurónico, que tiene importantes y nuevos usos, especialmente en el área de la salud, y su demanda se encuentra en alza. El presente trabajo de tesis tiene como objetivo generar una nueva cepa recombinante de Escherichia coli que sea capaz de producir ácido hialurónico a partir de fuentes de carbono novedosos, como es el caso de los carbohidratos de algas pardas. Esto se debe a que estas algas presentan varias ventajas, como su gran abundancia y relativa facilidad de obtención de los azúcares presentes. Este trabajo se enfoca en el uso de los carbohidratos alginato y manitol, principales azúcares presentes en estas macroalgas. Como punto de partida se utilizó la cepa recombinante BAL 1611. Esta cepa tiene incorporados los genes necesarios para el transporte y degradación del alginato, además de estar optimizado para la producción anaeróbica de etanol. A esta cepa se le realizó modificaciones para disminuir la producción de etanol y se le incorporó los genes necesarios para producir ácido hialurónico. En la primera etapa del trabajo se obtuvo una cepa con resistencia al antibiótico cloranfenicol y con la producción de etanol disminuida. Luego, la cepa se transformó con un plasmidio que contiene los genes necesarios para la síntesis de ácido hialurónico. La síntesis de las proteínas codificadas en el vector recombinante se indujo con L-arabinosa para iniciar la producción. Además, en este proyecto se diseñó un método para cuantificar la concentración de ácido hialurónico utilizando la enzima hialuronidasa. Se logró obtener un microorganismo recombinante que produce ácido hialurónico a partir de alginato y manitol con una concentración de 20 [g/l] de azúcares totales, con una proporción de 2:1 en peso. El rendimiento obtenido fue de 3,67 [mg AH/l/gDW]. Finalmente, se introdujo modificaciones a un modelo matemático del metabolismo de E. coli, para introducir las reacciones correspondientes a la degradación de alginato y de la síntesis de ácido hialurónico. Se realizó un análisis de balance de flujo a partir de los datos generados de un cultivo con un medio definido, aplicando variaciones en las condiciones in silico. A partir de este análisis se concluyó que es necesario controlar la cantidad de oxígeno presente en el cultivo. Por otro lado, la presencia de los genes de Z. mobilis no presenta impacto en la producción de biomasa ni de ácido hialurónico. Además, debido al alto costo energético de producir ácido hialurónico y el desbalance de óxido-reducción que produce la metabolización de alginato hace que los rendimientos de AH sean bajos. Esto da pie a implementar nuevas estrategias para optimizar la producción de AH a partir de este carbohidrato.

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:53Z : No. of bitstreams: 1 000830010.pdf: 1013512 bytes, checksum: 359beba3503aae8c6b179751e680b25e (MD5) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é a forma clínica mais severa da doença e pode ser fatal se não tratada. Um diagnóstico específico e acurado é requerido para a identificação de cães infectados a fim de promover um melhor controle epidemiológico e tratamento adequado. O desenvolvimento de um teste diagnóstico mais específico é importante, especialmente no Brasil onde os animais infectados são eutanaziados. Diversos pesquisadores discordam quanto à especificidade dos testes atualmente utilizados. Este trabalho reporta o isolamento, expressão e teste de dois genes específicos de Leishmania infantun (syn = chagasi), como potencial epítopo para desenvolvimento de um novo método diagnóstico e vacina. Os genes denominados Lc 24 e Lc 36 foram amplificados com primers específicos, clonados e expressos em E. coli. As proteínas recombinantes rLc 24 e rLc 36 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de GST. Diferentes concentrações das proteínas foram testadas por Dot Blot usando um pool de soros de cães infectados com leishmaniose visceral e um pool de soro de cães não infectados. Concentrações das proteínas a 0,1 e 0,01μg/mL foram detectadas no ensaio, mostrando que as proteínas rLc 24 e rLc 36 são imunorreativas e apresentam potencial para serem usadas em novos testes diagnósticos e desenvolvimento de vacina. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is the most severe clinical form of the disease and can be fatal if untreated. A specific and accurate diagnosis is required for the identification of infected dogs to provide better epidemiological control and earlier treatment. The more accurate diagnosis test is important especially in Brazil where infected animals are euthanized. Discordance among investigators regarding the accuracy of the tests currently employed for this purpose. This works reports the isolation, expression and test of two specific genes of Leishmania infantun (syn = chagasi), as a potential epitope for the development of a new diagnosis method and vaccine. The partial sequence of the genes rLc 24 and rLc36 was amplified with specific primers, cloned, and expressed in E. coli. The rLc 24 and rLc36 recombinant proteins was purified by GST affinity chromatography. Different concentrations of proteins were tested by Dot blot using a serum pool from infected dogs with leishmaniasis and a serum pool from dogs not infected. The protein concentrations of 0,1 and 0,01μg/mL were detected in the dot blot tests, showing that the protein rLc36 is immunoreaction and has potential to used in new diagnosis tests and development of vaccine.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3826.pdf: 1893652 bytes, checksum: cca227d41858b50ad19ca341e725b6d3 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / The expression system of recombinant proteins in insect cells/baculovirus (BEVS) was described and introduced in 1983 and since then has become a powerful tool for the production of recombinant proteins of biotechnological interest. This work studied the kinetics of Bac-to-BacR Baculovirus Expression System (Invitrogen ) used for the production of recombinant proteins, evaluating growth patterns and consumption of nutrients from Sf-9 insect cells infected with this commercial bacmid and determining the effect of viral inoculum. For this, Sf-9 cells grew at 29oC in T flasks containing 5 mL of SF-900 II medium or Schott bottles with working volume of 15 mL and orbital shaking at 90 rpm. UFLAG-286 cells were also tested at 29°C in TC-100 medium supplemented with 10% bovine fetal serum. The baculovirus used were the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) as a wild baculovirus infection model, the bacmid extracted from DH10Bac bacteria and transposed with the transfer vector empty (pFastBac 1), called Bac sprec and the bacmid recombinant AcNPV with the GUS coding sequence of the gene β- glucuronidase, used as a standard for transposition experiments and transfection. Cells were infected at different times (TOI), on the initial phase, the exponential phase or stationary phase of cell growth, and with different multiplicities of infection (MOI) (0.01, 0.1, 1 and 10). It was observed that the MOI does not influence the viral replication, because even with the low MOI the cell growth was completely inhibited. TOI had already affected the production of total cell proteins, and infection in the early exponential phase was that obtained the highest number of total proteins. The supplementation of the cultivation with Bac sprec with serine and glutamine did not lead to increased viral production. The supernatant of cultures infected with Bac sprec was able to inhibit cell death where there was induction of apoptosis by terbutyl, indicating contain some protein with anti-apoptotic activity. This effect was not observed on wild baculovirus. / O sistema de expressao de proteinas recombinantes em celulas de inseto/baculovirus (BEVS) foi descrito e introduzido em 1983, e desde entao tornou-se uma ferramenta poderosa para a producao de proteinas recombinantes de interesse biotecnologico. O objetivo deste trabalho foi estudar os parametros cineticos do sistema Bac-to-BacR Baculovirus Expression (Invitrogen ) utilizado para a producao de proteinas recombinantes, avaliando os padroes de crescimento e consumo de nutrientes de celulas de inseto Sf-9 infectadas com este bacmideo comercial e determinando o efeito do inoculo viral. Para isso celulas Sf-9 foram cultivadas a 29oC em frascos T contendo 5 mL de meio SF-900 II, ou em frascos Schott com volume de trabalho de 15 mL e agitacao orbital a 90 rpm. Celulas UFLAG-286 tambem foram testadas a 29oC em meio TC-100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os baculovirus utilizados foram o Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), como modelo de infeccao de baculovirus selvagem, o bacmideo extraido da bacteria DH10BacTM e transposto com o vetor de transferencia vazio (pFastBac 1), chamado de Bac sprec e o bacmideo recombinante AcMNPV-GUS com a sequencia codificante do gene β glucuronidase, utilizado como um padrao para experimentos de transposicao e transfeccao. As celulas foram infectadas em diferentes momentos (TOI), seja na fase inicial, na fase exponencial ou fase estacionaria do crescimento celular e com diferentes multiplicidades de infeccao (MOI) (0,01; 0,1; 1 e 10). Observou-se que o MOI nao influencia a replicacao viral, pois mesmo com baixo MOI o crescimento celular foi inibido. Ja o TOI teve influencia na producao de proteinas totais da celula, sendo que a infeccao no inicio da fase exponencial foi que obteve maior numero de proteinas totais. A suplementacao do cultivo de Bac sprec com serina e glutamina nao levou a uma maior producao viral. O sobrenadante de cultivos infectados com o Bac sprec foi capaz de inibir a morte celular onde houve inducao de apoptose por terbutil, indicando conter alguma proteina com atividade antiapoptotica. Este efeito nao foi observado com o baculovirus selvagem.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-01-05T12:06:12Z No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T12:39:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T12:39:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T12:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseLCS.pdf: 1420745 bytes, checksum: 4dd4fbff68d9aa7235de8b5f959ba86d (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Viral hepatitis is a major public health problem worldwide and in Brazil. They are notifiable diseases and according to estimates, billions of people have had contact with the hepatitis and millions are chronic carriers. Infection with hepatitis C virus (VHC) is a major problem worldwide public health due to the high rate of progression to chronicity, the evolutionary potential for cirrhosis and hepatocellular carcinoma, major complications leading to death. In general it can be said that in the last decade there have been major advances in the diagnosis of hepatitis C. In this period there was progressive improvement in sensitivity and specificity of the tests used to detect antibodies against the VHC virus. However, it is necessary that more accurate tests are developed. Thus, considering that the concern for the detection of hepatitis C increases every day, especially in blood banks; the diagnostic methods of this infection are of great clinical relevance and may be used as markers chronicity and indicative of therapeutic efficacy. Therefore, this work proposed to evaluate the connection and recognition of anti-VHC antibody positive and positive genotyped samples in patients with hepatitis C through the standardization of procedures and solutions used in qualitative ELISA. There was the process of awareness of microplates with recombinant chimeric protein, made the analysis of sensitivity, specificity, reproducibility and validity of the method. We obtained from ELISA assays with standardized recombinant proteins a protocol able to have a good performance of the main components of the reaction, and antigens conjugated with good resolution. This study presented ELISA results valid 95.69%, 100% reproducibility, 94.5% sensitivity and specificity 99.3%, higher than the ELISA performed with multiepitopo protein MEHCV who presented with sensitivity (92.86%) and specificity (82.89%). The standard ELISA can be used as a qualitative serological technique aimed at detection of anti-VHC antibodies, as demonstrated with great reactivity in patients infected with VHC. / As hepatites virais são um grave problema de saúde pública no mundo e no Brasil. São doenças de notificação compulsória e segundo estimativas, bilhões de pessoas já tiveram contato com vírus das hepatites e milhões são portadores crônicos. A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) constitui um grave problema de saúde pública mundial devido à elevada taxa de progressão para cronicidade, ao potencial evolutivo para cirrose e carcinoma hepatocelular, principais complicações conducentes à morte. Em geral, pode-se dizer que na última década houve grandes avanços no diagnóstico da hepatite C. Nesse período houve progressiva melhora na sensibilidade e especificidade dos testes utilizados para detecção de anticorpos contra o vírus HCV. Contudo, é necessário que sejam desenvolvidos testes de maior acurácia. Assim, considerando que a preocupação com a detecção da hepatite C aumenta a cada dia, principalmente em bancos de sangue; os métodos diagnósticos desta infecção são de grande relevância clínica e podem ser utilizados como marcadores de cronicidade e indicativos da eficácia terapêutica. Portanto, esse trabalho propôs avaliar a ligação e reconhecimento dos anticorpos anti-HCV de amostras positivas e positivas genotipadas de pacientes portadores de Hepatite C, através da padronização dos procedimentos e soluções utilizadas no ELISA qualitativo. Realizou-se o processo de sensibilização das microplacas com proteína recombinante quimérica, fez-se a análise da sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e validade do método. Obtivemos a partir dos ensaios de padronização do ELISA com proteínas recombinantes um protocolo capaz de ter um bom rendimento dos principais componentes da reação, antígenos e conjugado, com boa resolução. O presente estudo apresentou-se resultados do ELISA com validade 95,69% , reprodutibilidade 100%, sensibilidade 94,5% e especificidade 99,3%, superior ao ELISA realizado com a proteína multiepitopo MEHCV que apresentaram com sensibilidade (92,86%) e especificidade (82,89%). O ELISA padronizado pode ser utilizado como uma técnica sorológica qualitativa, visando a detecção de anticorpos anti-HCV, pois mostrou-se com ótima reatividade nos soros pacientes infectados com HCV.

Orientador : Paulo Inácio da Costa / Coorientador: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Andrea Soares da Costa Fuentes / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Silmara Marques Allegretti / Banca: Marco Tulio Alves da Silva / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é a forma clínica mais severa da doença e pode ser fatal se não tratada. Um diagnóstico específico e acurado é requerido para a identificação de cães infectados a fim de promover um melhor controle epidemiológico e tratamento adequado. O desenvolvimento de um teste diagnóstico mais específico é importante, especialmente no Brasil onde os animais infectados são eutanaziados. Diversos pesquisadores discordam quanto à especificidade dos testes atualmente utilizados. Este trabalho reporta o isolamento, expressão e teste de dois genes específicos de Leishmania infantun (syn = chagasi), como potencial epítopo para desenvolvimento de um novo método diagnóstico e vacina. Os genes denominados Lc 24 e Lc 36 foram amplificados com primers específicos, clonados e expressos em E. coli. As proteínas recombinantes rLc 24 e rLc 36 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de GST. Diferentes concentrações das proteínas foram testadas por Dot Blot usando um pool de soros de cães infectados com leishmaniose visceral e um pool de soro de cães não infectados. Concentrações das proteínas a 0,1 e 0,01μg/mL foram detectadas no ensaio, mostrando que as proteínas rLc 24 e rLc 36 são imunorreativas e apresentam potencial para serem usadas em novos testes diagnósticos e desenvolvimento de vacina. / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is the most severe clinical form of the disease and can be fatal if untreated. A specific and accurate diagnosis is required for the identification of infected dogs to provide better epidemiological control and earlier treatment. The more accurate diagnosis test is important especially in Brazil where infected animals are euthanized. Discordance among investigators regarding the accuracy of the tests currently employed for this purpose. This works reports the isolation, expression and test of two specific genes of Leishmania infantun (syn = chagasi), as a potential epitope for the development of a new diagnosis method and vaccine. The partial sequence of the genes rLc 24 and rLc36 was amplified with specific primers, cloned, and expressed in E. coli. The rLc 24 and rLc36 recombinant proteins was purified by GST affinity chromatography. Different concentrations of proteins were tested by Dot blot using a serum pool from infected dogs with leishmaniasis and a serum pool from dogs not infected. The protein concentrations of 0,1 and 0,01μg/mL were detected in the dot blot tests, showing that the protein rLc36 is immunoreaction and has potential to used in new diagnosis tests and development of vaccine. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5106_1.pdf: 3183906 bytes, checksum: 2e940415f50a8b240c639a58645d7142 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A levedura Kluyveromyces marxianus Hansen tem sido apontada como sistema biológico para estudos genéticos e biotecnológicos baseado nas suas vantagens fisiológicas e bioquímicas. Contudo, a ausência de plasmídios naturais e o pouco conhecimento sobre sua genética e comportamento têm sido os principais entraves para estudos mais aplicados. Sua capacidade de utilizar lactose como fonte de carbono possibilita o uso do soro de queijo, atualmente um importante poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para outros processos industriais. Buscou-se, portanto, construir vetores plasmidiais eficientes e compatíveis com a levedura K. marxianus para avaliar a capacidade de linhagens recombinantes utilizarem o soro de queijo como meio de crescimento de baixo custo no processo de expressão de genes de interesse industrial, tais como enzimas extracelulares ou peptídeos antimicrobianos. Este trabalho permitiu verificar que: um método simples e rápido de transformação mediado por acetato de lítio permitiu um aumento da eficiência de transformação de células de K. marxianus em 2,5 vezes em relação ao método convencional; o crescimento de células de leveduras recombinantes transformadas com pDblet ou seus derivados não foi afetado pela alta concentração de lactose no soro de queijo, apresentando perfil de crescimento similar ao de células parentais. Esses dados sugerem a possibilidade do uso de linhagens recombinantes de Kluyveromyces marxianus portadoras de plasmídios baseados no pDblet para processos biotecnológicos a partir do soro de queijo advindo das indústrias de laticínios

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T12:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goes_LidianaCristinade_M.pdf: 4033239 bytes, checksum: 07d68044592d217e51b3096b35496c87 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho visou investigar o efeito dos quelatos IDA-Ni(II), CM-Asp-Ni(II), TED-Ni(II) e TREN-Ni(II) na purificação de pró-insulina humana recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de solução clarificada, obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise, proveniente do processo de produção de insulina (BIOMM, MG). Dentre os adsorventes estudados, Sepharose-TREN-Ni (II) apresentou a maior capacidade de adsorção em termos de PIS, cerca de 50% da proteína alimentada. Os demais adsorventes apresentaram a seguinte ordem de capacidade de adsorção IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. Em termos de seletividade, os adsorventes com CM-Asp-Ni (II) e TEDNi (II) imobilizados apresentaram maior seletividade. Os dados de adsorção de PIS no equilíbrio a 25°C foram bem representados pelo modelo de Langmuir-Freundlich., fornecendo valores de capacidade máxima de adsorção entre 43,14 mg e 154,56 mg de PIS/g de adsorvente e valores de constante aparente de dissociação entre 10-5 a 10-7 M. O estudo termodinâmico para adsorção de PIS nos adsorventes estudados na faixa de 4 a 25°C (exceto para TED-Ni(II), faixa de temperatura de 25 a 45°C) mostrou diminuição dos valores de Kd com o aumento da temperatura, fornecendo valores de ?H° positivos para todos os casos, indicando que a adsorção de PIS nos quelatos estudados é um processo endotérmico. Os valores de ?Gº foram negativos para todos os sistemas, indicando que a adsorção é espontânea. Os valores de ?Sº encontrados foram positivos e pouco alterados com o aumento de temperatura em todos os casos, favorecendo a complexação proteína-íon metálico. / Abstract: This work sought to investigate the effect of the chelating groups IDA-Ni(II), CMAsp- Ni(II), TED-Ni(II) and TREN-Ni(II) in the purification of a recombinant human proinsulin poly-histidine tagged (PIS) starting from clarified solution, obtained from the dissolution of inclusion bodies and oxidative sulfitolysis, originating from the process of insulin production (BIOMM, MG). Among of the studied adsorbents, Sepharose-TREN-Ni (II) it presented the largest adsorption capacity in terms of PIS, about 50 % of the fed protein. The other adsorbents presented the following order in adsorption capacity IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. In selectivity terms, the adsorbents with the chelating groups CM-Asp-Ni (II) and TED-Ni (II) immobilized presented a larger selectivity. The data of adsorption of PIS in the equilibrium to 25°C were well represented by the model of Langmuir-Freundlich, supplying values of maximum adsorption capacity between 43, 14 mg and 154, 56 mg of PIS / g adsorbent and values of apparent constant of dissociation among 10-5 to 10-7 M. The thermodynamic study for adsorption of PIS in the adsorbents considering the range from 4 to 25°C (except for TED-Ni (II), temperature range from 25 to 45°C) showed decrease of the values of Kd with the increase of temperature, providing positive values of ?H° for all of the cases, indicating that the adsorption of PIS in the studied chelating groups is a endothermic process. The values of ?Gº were negative for all of the systems, indicating that the adsorption is spontaneous. The values of ?Sº founded were positive and had little alteration due to temperature increase in all of the cases, favoring the formation of complex protein-metallic ion. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química