Leptospirose é uma zoonose mundial que acomete várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causada por espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Possui um quadro de manifestação clínico muito variado, podendo apresentar desde sintomas comuns a outras doenças como febre, calafrios, cefaleia, dores musculares, enjoo, vômitos, diarreia e uma forma mais severa da infecção denominada síndrome de Weill. Seguindo a estratégia de genômica funcional, foram selecionados genes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 e LIC12287, tendo como critério a predição de localização das proteínas na membrana. Os fragmentos referentes aos genes LIC11122 e LIC12287 foram clonados no vetor pGEM-T Easy e subclonados no vetor de expressão pAE. As proteínas avaliadas interagem com laminina e plasminogênio, de forma dose-dependentes e saturáveis, sugerindo atuam nos processos de patogênese da bactéria. A presença de um fator sigma na superfície celular desempenhando um papel secundário, sugere que a rLIC11122 pode ser uma proteína moonlight. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that affects several species of mammals, including humans, caused by species of pathogenic bacteria of the genus Leptospira. It has a very varied clinical manifestation board and may have symptoms from common tropical diseases such as fever, chills, headache, muscle aches, nausea, vomiting, diarrhea and a severe syndrome of infection known as Weill syndrome. Following the functional genomics strategy, genes were selected from Leptospira interrogans serovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 and LIC12287, with the criterion of the prediction location of proteins in the membrane. The fragments related to genes LIC11122 and LIC12287 were cloned into pGEM-T Easy vector and subcloned into the expression vector pAE. The evaluated proteins interact with laminin and plasminogen, dose-dependent and saturable manner, suggesting participation in bacterial pathogenesis processes. The presence of a sigma factor on the cell surface plays a secondary role, suggests that performs a moonlight rLIC11122 protein.

Les plantes sont des hôtes prometteurs pour la production de protéines recombinantes d’intérêt médical et de nombreuses études ont été réalisées au cours des années pour optimiser le taux d’expression des transgènes ou la maturation des protéines en systèmes végétaux. En comparaison, les connaissances demeurent limitées au sujet de l’influence des facteurs environnementaux et des pratiques culturales sur l’expression et le rendement en protéines recombinantes dans les plantes. Les pratiques culturales courantes en serriculture, si elles permettent en général une production importante de biomasse et des rendements élevés en produits horticoles, ne sont pas nécessairement bien adaptés à la production de protéines recombinantes dans un contexte de moléculture. Dans cette étude, nous avons étudié les effets d’un enrichissement en CO2 atmosphérique, d’une forte irradiance sur le couvert végétal, d’une fertigation riche en ammonium et d’une densité de plantation élevée sur la croissance, le développement et le rendement en protéine recombinante chez l’hôte d’expression Nicotiana benthamiana utilisé pour la production du principe actif d’un vaccin contre la grippe, l’hémagglutinine H1 du virus de l’influenza. En bref, nos données ont montré les effets positifs (1) d’un enrichissement en CO2, d’une forte luminosité, d’un éclairage intercalaire dans la canopée végétale ou d’une solution nutritive riche en ammonium sur la production de biomasse et le contenu en protéines dans la plante; et (2) d’un éclairage intercalaire et d’une forte densité culturale sur le rendement en protéine H1 par unité de surface en culture. En revanche, le rendement en H1 n’a pas été altéré, ou l’a été négativement, sous de fortes concentrations en CO2 atmosphérique, sous une forte luminosité au-dessus du couvert végétal ou par une solution nutritive riche en ammonium. En somme, nos données indiquent que les conditions de culture optimales pour la production de produits horticoles en conditions confinées peuvent ne pas être appropriées dans un contexte de moléculture où l’objectif ultime est le rendement en protéine recombinante, non pas la production de biomasse foliaire, la teneur en nutriments ou le rendement en fruits ou en fleurs. / Plants are promising hosts for the production of medically-useful recombinant protein sand numerous studies have been done over the years to optimize transgene expression rates and protein maturation processes in plant systems. By comparison, little is still known about the influence of basic environmental factors and cultural practices on the expression and yield of heterologous proteins in plants. Current cultural practices in greenhouse settings, that generally allow for an increased biomass or food/flower product yield, are not necessarily well suited to recombinant protein production in a molecular farming context. In this study, we investigated the effects of CO2 enrichment, supplemental lighting, ammonium fertigation and plant culture density on growth, development and recombinant protein yield of the protein expression host Nicotiana benthamiana used to express the flu vaccine antigen influenza virus hemagglutinin H1. In brief, our data showed (1) atmospheric CO2 enrichment, high-light irradiance, supplemental LED inter-lighting in the plant canopy and high-ammonium fertigation to enhanced leaf biomass production and endogenous protein content on a plant basis, and (2) LED inter-lighting or elevated plant density to increase recombinant protein yield on a whole-crop area basis. On the other hand, H1 content was not influenced or negatively affected by CO2 enrichment, high-light irradiance or high-ammonium supply on a leaf fresh weight basis. Overall, our findings indicate that the optimal cultural practices for the production of horticultural food products or ornementals in controlled environment settings may not be optimal in molecular farming settings, where the ultimate goal is recombinant protein yield and quality, not leaf biomass, nutrient content, fruit yield or flower quality.

Les cassures double-brin (CDBs) de l’ADN sont généralement néfastes pour la cellule, toutefois il existe une exception importante à cette règle. Chez la levure et les autres eucaryotes, Spo11 (ou Rec12 chez S. pombe) est décrit comme étant capable de créer des CDBs, bris de l’ADN nécessaire à l’initiation de la recombinaison méiotique. Des analyses génétiques et bioinformatiques ont démontré que les homologues de Spo11 lient l'ADN double-brin sous la forme d’un dimère. Leur activité topoisomérase permet d’ailleurs de cliver l’ADN pour générer des intermédiaires ADN-protéine transitoires et covalents. Cependant, cette observation a été mise en doute par les biochimistes, mais aussi par le fait qu'il est extrêmement difficile de purifier les protéines Spo11 dans des conditions natives. Pour mieux comprendre comment Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) génère des CDBs, nous avons établi un protocole de purification par triple affinité et effectué des essais in vitro permettant de montrer le rôle de Spo11 dans la formation de CDBs. Nous avons également purifié Rec12 - Y98F (mutant catalytique) et Rec12 - G202E (mutant de liaison à l'ADN). La protéine Rec12 s’avère être capable de catalyser la formation de CDBs de l'ADN superenroulé alors que les mutants Rec12-Y98F et Rec12-G202E sont inactivés. En accord avec l'accumulation de Spo11 aux CDBs durant la méiose, nous observons que Rec12 possède plusieurs sites de liaison à l’ADN préférant l'ADN 5'-protubérant à l'ADN 3’-protubérant. Nous avons également analysé biochimiquement le mécanisme par lequel Rec12 est enlevé des CDBs par la nucléase Rad32 (Mre11). Certains des résultats présentés ont été confirmés à l'aide Spo11 humain et de S. cerevisiae. Le rôle des activités endo- et exonuclease du complexe MRE11 - RAD50 - NBS1 (MRN) dans la régulation de la voie de réparation des CDBs par l’utilisation d’inhibiteurs (endo ou exo) spécifiques à la structure de MRE11 sera discuté. En somme, nos résultats démontrent que Rec12 est responsable de la formation de CDBs et que cette activité est régulée par plusieurs domaines de liaison à l'ADN. Cette étude représente une première analyse de la fonction biochimique de Spo11 chez la levure et l’humain dans des conditions natives. / Double-strand breaks are generally harmful to the cell, although there is an important exception to this rule. In yeast and other eukaryotes, Spo11 (or S. pombe Rec12) is known to create double-strand DNA breaks (DSBs), which are important to initiate meiotic recombination. Genetic and bioinformatic analyses proposed that Spo11 homologues bind double-strand DNA as a dimer and cleave the DNA by a topoisomerase-like reaction to generate transient, covalent protein-DNA intermediates. However, this view has been challenged by biochemists, but also by the fact that it is extremely difficult to purify proteins Spo11 under native conditions. To understand how Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) generates double-strand breaks, we established a protocol for triple affinity purification. We performed in vitro assays, reminiscent of the function of Spo11 in DSB formation. The resulting purified Rec12 was pure as judged by Sypro staining. We also purified Rec12-Y98F (catalytic mutant) and Rec12-G202E (DNA binding mutant). Purified Rec12 catalysed double-strand break formation on supercoiled DNA whereas Rec12-Y98F and Rec12–G202E were inactivated. Rec12 showed activity on supercoiled DNA but not in short double-stranded DNA oligonucleotides. We mapped the possible DNA binding motifs on Rec12. Using purified mutants, we biochemically confirmed that Rec12 contains multiple DNA binding sites. Rec12 binds 5’-tailed DNA but not 3’-tailed DNA, which is reminiscent of the accumulation of Spo11 on meiotic DNA double-strand breaks. We also analyzed biochemically how Rec12 is removed from DSBs by the Rad32 (Mre11) nuclease to produce single-strand overhang that can undergo DNA recombination. Some of the results presented were also confirmed using human and S. cerevisiae Spo11. We also discuss how endo- and exonuclease activities of MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex regulates double-strand break repair pathway choice. By using structure-based designed MRE11 endo- or exonuclease inhibitors we represented here specific nuclease roles in DSB repair. Altogether, our results indicate that Rec12 is responsible for the formation of double-strand breaks, an activity that is regulated by multiple DNA binding sites. This study represents a first glimpse of the biochemical function of yeast or human Spo11 under native conditions.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 523.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) 2011sousa-rcv.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo Vírus da Hepatite A (HAV) ainda acomete milhões de pessoas em todo o mundo, causando uma doença que pode variar desde um quadro assintomático até casos mais severos. Apesar da existência de vacinas comerciais, produzidas a partir do vírus inativado ou atenuado, elas ainda não estão disponíveis para grande parte da população mundial, em virtude do seu alto custo. Uma alternativa atraente consiste na pesquisa e desenvolvimento de vacinas de DNA, que potencialmente apresentam algumas vantagens em relação a vacinas convencionais como a maior estabilidade, maior segurança e possibilidade de serem produzidas com um menor custo final. Neste trabalho foi realizada a construção, otimização e avaliação da expressão de protótipos vacinais recombinantes, visando o desenvolvimento de uma vacina de DNA contra o HAV. O segmento traduzível do genoma do HAV é composto por: região P1, formada pelas proteínas estruturais VP1, VP2, VP3 e VP4; região P2, da qual fazem parte a proteína 2A (que funciona como primeiro sinal para a montagem do capsídeo) e as proteínas 2B e 2C (as quais participam do processo de replicação do RNA viral); região P3, onde encontram-se a protease 3C (responsável pelo processamento de todas as proteínas estruturais e não-estruturais) e a RNA polimerase 3D. A sequência vacinal foi gerada a partir dos genes das proteínas estruturais, e da protease 3C viral, sendo denominada de poliproteína truncada (HAV-PTRUNC). Esta sequência foi otimizada e também fusionada a região N-terminal da Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (LAMP), com o objetivo de promover a secreção dos antígenos virais, gerando a construção N-LAMP_HAV-PTRUNC. Para a detecção da expressão de HAVPTRUNC e N-LAMP_HAV-PTRUNC, as proteínas individuais VP1, VP3 e 3C foram produzidas em bactérias e utilizadas para imunizar coelhos, para a obtenção de anticorpos policlonais específicos contra as mesmas. Os anticorpos obtidos foram capazes de reconhecer não só as respectivas proteínas recombinantes, como também as proteínas nativas do vírus e N-LAMP_HAV-PTRUNC. De acordo com os resultados obtidos, pretendemos dar continuidade aos nossos estudos através de ensaios clínicos, no intuito de produzir a primeira vacina de DNA contra HAV regulamentada para uso em humanos

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo / Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-22T11:44:35Z No. of bitstreams: 1 cristiane-marques-de-souza.pdf: 1147113 bytes, checksum: 60995fd9938a018115dd7df1eec2d052 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-22T11:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cristiane-marques-de-souza.pdf: 1147113 bytes, checksum: 60995fd9938a018115dd7df1eec2d052 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasié uma doença severa que ocorre em seres humanos sendo prevalenteem vários países, inclusive no Brasil. Trata-se da forma com maior potencial de letalidade. Os cães são importantes reservatórios do parasito, portanto o diagnóstico canino é essencialpara os programas de vigilância da LV. Neste trabalho é relatado a expressão, o isolamento e a purificação de dois antígenos recombinantes protéicos de Leishmania chagasi, Lc9 e Lc13, produzidos em Escherichia coli visando um imuno-ensaio para o diagnóstico desta enfermidade. Inicialmente, os plasmídeos de E.coli contendo os gens inseridos e relacionados a ambas as proteínas foram analisados por eletroforese de agarose. A proteína Lc9, por conter um marcador de seis histidinas, foi purificada por cromatografia de metal imobilizado (Ni) seguido porcromatografia de exclusão e peneiração molecular em Superdex 200. A Lc13 foi purificada, somente, por cromatografia de perfusão de troca aniônica em Poros HQ. As preparações protéicas purificadas tiveram suas homogeneidades verificadas por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), focalização isoelétrica e western blot. Um pI estimado de 6,43 e de 6,42 foi observado paraLc9 e Lc13, respectivamente. A determinação de peso molecular (PM) feita por SDS-PAGE-10% indicou valores de 44000 (Lc9) e 88000 (Lc13), enquanto por cromatografia de exclusão e filtração molecular em Superdex 200, os valores estimados foram de 550.000 (Lc9) e 282.000 (Lc13). Estes valores estimados de PM sugerem que ambas macromoléculas apresentam-se em seu estado nativo na forma multimérica, sendo ambas constituídas por cadeias polipeptídicasidênticas. As diferentes detecções protéicas depois do SDS-PAGE de Lc9 e Lc13 purificadas mostraram que a principal banda imuno-revelada corresponde a principal banda revelada como coomassie brilliant blueR-350 por igual metodologia. Concluindo-se então que ambas correspondem ao principal antígeno presente em cada uma das duas preparações protéicas (Lc9 e Lc13) purificadas. Para o desenvolvimento de um ELISA indireto, relacionado ao diagnóstico da leismaniose visceral canina, os antígenos, Lc9 e Lc13 e o conjugado IgG – peroxidase tiveram as faixas de concentrações selecionadas para uso no referido ensaio sorológico. Segundo a mesma metodologia, o antígeno Lc9 apresentou melhores resultados que o antígeno Lc13 (Lc9: sensibilidade 100%; especificidade 95% e Lc13: sensibilidade 96%; especificidade 92%). Os resultados obtidos propõem o uso das proteínas recombinantes Lc9 e Lc13, principalmente a primeira, num imuno-ensaio baseado em ELISA para o aperfeiçoamento do diagnóstico da leishmaniose. / The visceral leishmaniasis (VL) caused by Leishmania chagasiis a relevant human disease prevalent in many countries, including Brazil. This form has the greatest potential for lethality. Dogs are important reservoir of the parasite, thus diagnosis of canine infections is essential for VL surveillance programs. This work is related to the expression, isolation and purification of two recombinant protein antigens of Leishmania chagasi, Lc9 and Lc13, produced in Escherichia coliaiming a diagnostic illness immune assay. Initially, the E. coliplasmids containing the inserted genes related to both proteins were analyzed in agarose gel electrophoresis. The protein Lc9 containing a hexapeptide histidine tag was purified by immobilized metal (Ni) affinity chromatography followed by sieving exclusion chromatography in Superdex 200. The Lc13 was only purified by anion exchange perfusion column chromatography onto Poros HQ. The purified protein preparations had their homogeneities ascertained by denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), isoelectric focusing and western blot. Estimated pI of 6.43 and 6.42 were observed for Lc9and Lc13, respectively. Molecular weights (MW) determined by SDS-PAGE-10% showed values of 44000 (Lc9) and 88000 (Lc13), while values of 550000 (Lc9) and 282000 (Lc13), were obtained by Superdex- 200 gel filtration. These estimated MW values suggested that both macromolecules in native state are multimeric proteins being formed by identical polypeptide chains. Different protein detections after SDS-PAGE of purified Lc9 and Lc13 showed that the majorimmune-revealed band correspond to the major coomassie brilliant blue R-350 revealed bands. So it concluded that both correspond to the main antigen present in each purified protein preparation (Lc9 and Lc13). For the development of an indirect ELISA for canine visceral leismaniosis diagnosis the antigens Lc9 and Lc13 as well IgG-peroxidase conjugate suitable concentrations were selected for the use in the related serologic assay. According to mentioned serologicalassay the antigen Lc9 gave better results than the antigen Lc13 (Lc9: sensitivity 100%; specificity 95% and Lc13: sensitivity 96%; specificity 92%). These results suggest the use of Lc9 and Lc13 antigens, preferably the former, in immune assays based on ELISA for the improvementof the leismaniasis diagnostic.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies / A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inmunocastración surge como una herramienta valiosa para el control de la fertilidad y la actividad reproductiva en animales de producción, silvestres y de compañía. El objetivo de la presente memoria de título fue evaluar el patrón de inmunidad adquirida en animales inmunizados con una vacuna peptídica contra la hormona GnRH-I (proteína recombinante GnRXG/Q) inoculada por vía parenteral, analizando las inmunoglobulinas y citoquinas producidas. Se utilizaron tres estrategias adyuvantes distintas. Un grupo de ratones hembras de la cepa Balb/c fue vacunado con la proteína recombinante y quitosano de alto peso molecular como adyuvante (HMW), en un segundo grupo se utilizó la proteína recombinante y quitosano de bajo peso molecular como adyuvante (LMW) para la vacunación y en el tercer grupo la inmunización con la proteína recombinante y adyuvante incompleto de Freund (IFA). El grupo control fue inoculado solo con quitosano. Las inmunizaciones fueron realizadas en los días 0 y 30. Se realizaron extracciones de sangre cada 15 días, obteniendo el suero de los animales inmunizados para la determinación de los niveles de inmunoglobulinas mediante una prueba de ELISA indirecto. Al día 90 del estudio se realizó el sacrificio de los animales, con el objetivo de obtener sus linfocitos, los cuales fueron llevados a un cultivo celular primario que permitió la posterior determinación del patrón de citoquinas producidas por cada grupo experimental mediante una prueba de ELISA tipo “sándwich”. Al momento de la eutanasia se realizó también una ovariohisterectomía para el posterior estudio histológico del parénquima ovárico. Los resultados obtenidos revelaron que al utilizar quitosano HMW se induce una respuesta inmune de tipo TH2, debido a que se observaron mayores niveles de IgG isotipo 1 y un patrón de citoquinas con mayores niveles de IL-10 e IL-4. En cambio, al usar quitosano LMW como adyuvante, la respuesta inmune obtenida fue de tipo TH1, con un mayor nivel de IgG isotipo 2a y un patrón de citoquinas con mayores niveles de IFN-γ e IL-2. EL adyuvante incompleto de Freund (IFA) produjo una respuesta de tipo TH1, pero con niveles de IgG isotipo 2a contra la hormona GnRH-I menores que los obtenidos al usar quitosano LMW. Los cambios histológicos en el parénquima ovárico sugieren que la vacunación con la proteína recombinante GnRXG/Q genera una inhibición en la actividad ovárica, efecto que fue más marcado al usar quitosano LMW como estrategia adyuvante

Plasmodium malariae é responsável por uma baixa porcentagem de casos clínicos de malária, mas tem uma distribuição global ampla e fragmentada. Humanos podem abrigar o parasita por anos sem produzir sintomas significantes, o que dificulta o diagnóstico e consequente controle da doença. Por esta razão, a incorporação de antígenos de P. malariae nas estratégias em curso para produção de uma vacina é altamente recomendada. Embora a proteína de superfície do merozoíto1 (MSP1) de P. vivax e P. falciparum sejam amplamente estudadas como candidatos a vacinas, potencializando a resposta imune em camundongos e macacos, a MSP1 de P. malariae tem sido negligenciada. Portanto, este estudo visou caracterizar a imunogenicidade de proteínas recombinantes da MSP1 de P. malariae em camundongos BALB/c. Cinco regiões da PmMSP1 (N-terminal, F1; repetições em tandem, F2; central, F3 e C-terminal, F4 e PmMSP119) foram clonadas em vetor pGEX-3Y e expressas em Escherichia coli em fusão com GST. As proteínas recombinantes foram produzidas por fermentação e purificadas, fornecendo um alto rendimento de antígenos solúveis. Essas proteínas recombinantes e GST sozinha (grupo controle) foram usadas para imunizar, pela via intraperitoneal, seis grupos de camundongos BALB/c em 3 doses com intervalos de 14 dias. A especificidade e as subclasses dos anticorpos foram avaliadas por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), utilizando as proteínas recombinantes como antígenos. A resposta imune celular foi analisada pelo ensaio de linfoproliferação e os níveis de citocinas Th1/Th2 nos sobrenadantes de culturas de esplenócitos foram detectados por citometria. Nossos resultados demonstraram que as regiões F1, F2, F3, F4 e PmMSP119 são imunogênicas em camundongos com a capacidade de produzir respostas imunes humorais e celulares, como mostrado pelos altos títulos de anticorpos (1/809,000) e pela proliferação de linfócitos. As respostas imunes induzidas alcançaram níveis máximos após três doses imunizantes permanecendo altas por 70 dias. Os anticorpos induzidos após imunização com as regiões F1, F2, F3 e F4 mostraram afinidades similares aos antígenos alvo, mas anticorpos induzidos após imunização com PmMSP119 mostraram uma afinidade mais alta com o antígeno alvo. Análise das subclasses de IgG mostrou que todas as proteínas recombinantes induziram padrões similares de anticorpos onde IgG1, IgG2a e IgG2b foram mais predominantes, caracterizando uma resposta mista de Th1/Th2. Além disso, a imunização dos camundongos com as proteínas recombinantes e estimulação com os mesmos antígenos promoveu produção de IL-4. Os níveis das citocinas Th1/Th2 não mostraram diferenças significativas quando comparados entre os grupos. A proliferação dos linfócitos estimulados com F2, F3 e PmMSP119, foi maior que aquela dos estimulados com F1, F4 e GST. Ainda, todos os soros dos animais imunizados com as cinco proteínas recombinantes de PmMSP1, que foram positivos por ELISA, mostraram reatividade com esquizontes de P. brasilianum nos ensaios de imunofluorescência (IFA). As proteínas recombinantes de PmMSP1 reagiram com anticorpos IgG nas amostras de soro de indivíduos expostos a P. malariae com alta especificidade comparado a amostras de soro de indivíduos com doenças não relacionadas. Entretanto, as regiões F1 e F2 e PmMSP119 foram reconhecidas por soros de pacientes com P. malariae com os títulos mais altos e não apresentaram reconhecimento em soros de pacientes com P. falciparum e P. vivax. Esses dados reforçam a utilidade destas proteínas como marcadores diagnósticos de P. malariae em estudos epidemiológicos ou no diagnóstico diferencial da malária causada por esta espécie. No entanto, a região F4 foi reconhecida igualmente em soros homólogos ou heterólogos e, portanto, poderia ser útil para testes pointof- care para o diagnóstico de malária. A imunização com as diferentes proteínas recombinantes de PmMSP1 promove uma resposta imune humoral significante, com altos e específicos níveis de IgG, além de uma distribuição de subclasses balanceada, fornecendo evidências de potenciais candidatos a uma vacina contra P. malariae. / Plasmodium malariae is responsible for a low percentage of clinical malaria cases and has a patchy distribution in the world. Humans can host the parasite for years without presenting significant symptoms, which turns its diagnosis and control a difficult task. For this reason, the incorporation of P. malariae antigens in vaccination strategies is highly recommended. Although the merozoite surface protein 1 (MSP1) of P. vivax and P. falciparum are widely studied as vaccine candidates, potentiating the immune response in mice and monkeys, P. malariae MSP1 has been neglected. Herein we invested in the characterization of the immunogenicity of recombinant proteins of P. malariae MSP1 in BALB/c mice. Five regions of PmMSP1 (N-terminus, F1; tandem repeat, F2; central region, F3 and C-terminus, F4 and PmMSP119) were cloned into vector pGEX-3Y and expressed in Escherichia coli in fusion with GST. Recombinant proteins were produced by fermentation and purified, providing a high yield of soluble antigens. These recombinant proteins and GST alone (control group) were used to immunize, via the intra-peritoneal route, six groups of BALB/c mice in three doses at 14-day intervals. The specificity and subtyping of the antibodies were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), using the recombinant proteins as antigens. Cellular immune responses were analyzed by lymphoproliferation assays and the Th1/Th2 cytokine levels in the supernatant of splenocyte cultures were detected by cytometry. Our results demonstrated that F1, F2, F3, F4 regions and PmMSP119 are immunogenic in mice with the capacity to elicit humoral and cellular immune responses, as denoted by high antibody titers (1/809,000) and the proliferation of lymphocytes. The induced immune responses reached maximum levels after three doses remaining high for 70 days. Antibodies induced after immunization with F1, F2, F3 and F4 regions showed similar affinities to the target antigens, but antibodies induced after immunization with PmMSP119 showed a higher affinity to the target antigen. Analysis of IgG subclasses showed that all the recombinant proteins induced similar antibody subclass patterns where IgG1, IgG2a and IgG2b were most predominant, characterizing a Th1/Th2 mixed response. Furthermore, immunization of mice with the recombinant proteins upon stimulation with the same antigen secreted IL-4. The levels of Th1/Th2 cytokines did not show significant differences when compared among groups. The proliferation of the stimulated lymphocytes, with F2, F3 and PmMSP119, was greater than those stimulated with F1, F4 or GST. Additionally, all sera from mice immunized with the five PmMSP1 recombinant proteins, which were positive by ELISA, showed reactivity with P. brasilianum schizonts by immunofluorescence assays (IFA). The PmMSP1 recombinant proteins reacted with IgG antibodies in serum samples from individuals exposed to P. malariae infections with a high specificity compared to serum samples from individuals with unrelated diseases. However, the F1 and F2 regions and PmMSP119 showed the highest titers in addition to no recognition by sera from P. falciparum and P. vivax infections. These data strengthen the usefulness of these proteins as diagnostic markers of P. malariae in epidemiological studies or in the differential diagnosis of malaria caused by this species. Nevertheless, the F4 region was recognized equally in homologous or heterologous sera, and thus, could be useful for point-of-care tests for malaria diagnosis. Immunization with the different PmMSP1 recombinant proteins promotes a significant humoral immune response, with high and specific IgG levels, in addition, a balanced subclass distribution, suggesting them as potential candidates for a vaccine against P. malariae.

A dengue é uma doença infecciosa com grandes taxas de morbimortalidade, causada pelo vírus da dengue (DENV). Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de 50 a 100 milhões de pessoas são infectadas anualmente em mais de 100 países tropicais e subtropicais de todos os continentes. O espectro clínico da infecção pelo DENV pode incluir formas assintomáticas ou sintomaticas que variam desde uma febre indeterminada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves denominados febre hemorrágica da dengue/síndrome do choque da dengue (FHD/SCD). Recentemente, ocorreu um dramático aumento do número de casos de FHD/SCD nas Américas, e este aumento coincidiu com a introdução do dengue sorotipo 3, genótipo III. No presente trabalho, objetivou-se a clonagem e a expressão das proteínas NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3. As proteínas NS1 e NS3 do DENV-3 foram clonadas e expressas com sucesso em sistema procarioto. A amplificação dos genes das proteínas NS1 e NS3 foi realizada por RT-PCR, o qual gerou amplicons de cerca de 1050 e 1850 pb, respectivamente. Em seguida, os genes foram clonados por inserção dos amplicons no vetor plasmidial pCR-XL. Os genes de NS1 e NS3 foram subclonados no vetor de expressão pQE-30 através de sítios de restrição para as enzimas BamHI e HindIII. A expressão proteica foi obtida em sistema procarioto utilizando a cepa BL21(DE3) de E. coli, resultando em proteínas de 45 e 70 kDa as quais foram confirmadas por análises em Western blot utilizando como anticorpo primário fluido ascítico imune de camundongos e soro de pacientes com dengue. Estas proteínas virais podem ser utilizadas para estudos relacionados à patogênese, replicação e mecanismos de escape do sistema imune do DENV, além disso, podem ser potencias antígenos em métodos de diagnóstico. / Dengue is an infectious disease with high morbidity and mortality rates caused by dengue virus (DENV). According to the World Health Organization, about 50 to 100 million people are infected annually in more than 100 tropical and subtropical countries from all continents. The clinical spectrum of DENV infection can includes asymptomatic or symptomatic forms ranging from undetermined and self-limited fever, through dengue fever (DF) to severe disease called dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). Recently, there has been a dramatic increase in the number of cases of DHF/DSS in the Americas, and this increase coincided with the introduction of dengue virus type 3 (DENV-3), genotype III. The present study aimed to clone and express NS1 and NS3 proteins of DENV-3. The NS1 and NS3 proteins of DENV-3 was successfully cloned and expressed in a prokaryotic system. Amplification of NS1 and NS3 genes was carried out by RT-PCR, which yielded amplicons of approximately 1050 and 1850 bp, respectively. Then, the genes were cloned by inserting the amplicons into the plasmid vector pCR-XL. NS1 and NS3 genes were subcloned into the expression vector pQE-30 through the restriction sites for BamHI and HindIII enzymes. The protein expression was obtained in a prokaryotic system using the strain BL21 (DE3) of E. coli, resulting in 45 and 70 kDa proteins, which were confirmed by Western blot analysis using immune mouse ascitic fluid and serum of patients with dengue as primary antibody. These viral proteins can be used to study the pathogenesis, mechanisms of replication and immune escape of DENV, moreover, can be potential antigens in diagnostic methods.