Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniero Civil en Biotecnología / En la actualidad, se realizan grandes esfuerzos en aplicar nuevos métodos de producción de compuestos novedosos de alto valor agregado. Un ejemplo de esto es el ácido hialurónico, que tiene importantes y nuevos usos, especialmente en el área de la salud, y su demanda se encuentra en alza. El presente trabajo de tesis tiene como objetivo generar una nueva cepa recombinante de Escherichia coli que sea capaz de producir ácido hialurónico a partir de fuentes de carbono novedosos, como es el caso de los carbohidratos de algas pardas. Esto se debe a que estas algas presentan varias ventajas, como su gran abundancia y relativa facilidad de obtención de los azúcares presentes. Este trabajo se enfoca en el uso de los carbohidratos alginato y manitol, principales azúcares presentes en estas macroalgas. Como punto de partida se utilizó la cepa recombinante BAL 1611. Esta cepa tiene incorporados los genes necesarios para el transporte y degradación del alginato, además de estar optimizado para la producción anaeróbica de etanol. A esta cepa se le realizó modificaciones para disminuir la producción de etanol y se le incorporó los genes necesarios para producir ácido hialurónico. En la primera etapa del trabajo se obtuvo una cepa con resistencia al antibiótico cloranfenicol y con la producción de etanol disminuida. Luego, la cepa se transformó con un plasmidio que contiene los genes necesarios para la síntesis de ácido hialurónico. La síntesis de las proteínas codificadas en el vector recombinante se indujo con L-arabinosa para iniciar la producción. Además, en este proyecto se diseñó un método para cuantificar la concentración de ácido hialurónico utilizando la enzima hialuronidasa. Se logró obtener un microorganismo recombinante que produce ácido hialurónico a partir de alginato y manitol con una concentración de 20 [g/l] de azúcares totales, con una proporción de 2:1 en peso. El rendimiento obtenido fue de 3,67 [mg AH/l/gDW]. Finalmente, se introdujo modificaciones a un modelo matemático del metabolismo de E. coli, para introducir las reacciones correspondientes a la degradación de alginato y de la síntesis de ácido hialurónico. Se realizó un análisis de balance de flujo a partir de los datos generados de un cultivo con un medio definido, aplicando variaciones en las condiciones in silico. A partir de este análisis se concluyó que es necesario controlar la cantidad de oxígeno presente en el cultivo. Por otro lado, la presencia de los genes de Z. mobilis no presenta impacto en la producción de biomasa ni de ácido hialurónico. Además, debido al alto costo energético de producir ácido hialurónico y el desbalance de óxido-reducción que produce la metabolización de alginato hace que los rendimientos de AH sean bajos. Esto da pie a implementar nuevas estrategias para optimizar la producción de AH a partir de este carbohidrato.

Hyaluronic acid (HA) is an essential molecule in the development of many tissues in the organism, as well as in their regeneration. Although, its physicochemical properties greatly limit its use as a cell support material in clinical applications unless its chemical structure is modified or is accompanied by other molecules. In this thesis a tridimensional scaffold has been made consisting of hyaluronic acid and a second material, an acrylic polymer (poly[ethyl acrylate] or PEA) able to be polymerized by free-radical polymerization inside HA after lyophilisation. The resultant interpenetrating polymer network (IPN) has been analyzed in order to measure its properties and compare them to similar scaffolds made from the two separate polymers, with the aim to compare the effects produced by the synthesis technique in the physical and chemical properties of HA. The viability of these materials in cell applications has been tested through in vitro assays using L929 fibroblasts. Additionally, several modifications have been made to the initial synthesis technique in order to obtain different proportions from the two components - HA and PEA - in the materials. The properties of these IPNs have been measured to reveal the effects produced by every step along their synthesis. The biomaterials produced though the techniques described here may offer interesting systems for cell culture and/or cell transplants in future clinical applications that wish to incorporate hyaluronic acid in the shape of a stable tridimensional scaffold. / El ácido hialurónico (HA) es una molécula imprescindible en la formación de muchos tejidos del organismo, así como en la regeneración de los mismos. No obstante, sus propiedades físico-químicas limitan enormemente su uso como material para el soporte de células en aplicaciones clínicas si no se modifica su estructura química o se acompaña de otras moléculas. En esta tesis se ha sintetizado un constructo tridimensional de ácido hialurónico acompañado por un segundo material, un polímero acrílico (el poliacrilato de etilo, o PEA) capaz de polimerizar por vía radical en el interior del HA tras liofilizarlo. La red interpenetrada polimérica (IPN) resultante ha sido analizada para medir sus propiedades y compararlas con constructos semejantes realizados a partir de ambos polímeros por separado, con el objetivo de comprobar los efectos de la técnica de síntesis en las propiedades físico-químicas del HA. La viabilidad de estos materiales en aplicaciones con células ha sido comprobada mediante la realización de ensayos in vitro con fibroblastos L929. De forma adicional, se han llevado a cabo varias modificaciones de la técnica inicial de síntesis para obtener distintas proporciones de ambos componentes - HA y PEA - en los materiales. Las propiedades de esta serie de IPNs han sido medidas y comparadas con su método de síntesis y composición final con tal de dilucidar el efecto que produce cada paso de la síntesis en las mismas. Los biomateriales producidos mediante las técnicas aquí descritas pueden ofrecer sistemas interesantes para el cultivo y/o trasplante de células en futuras aplicaciones clínicas que deseen incorporar el ácido hialurónico en forma de constructo tridimensional estable. / L'àcid hialurònic (HA) és una molècula imprescindible en la formació de molts teixits de l'organisme, així com en la regeneració dels mateixos. D'altra banda, les seves propietats físico-químiques limiten enormement el seu ús com a material per al suport de cèl¿lules en aplicacions clíniques si no se'n modifica l'estructura química o se l'acompanya d'altres molècules. En aquesta tesi s'ha sintetitzat un constructe tridimensional d'àcid hialurònic acompanyat d'un segon material, un polímer acrílic (el poliacrilat d'etil, o PEA) capaç de polimeritzar per via radical a l'interior del HA després de liofilitzar-lo. La xarxa interpenetrada polimèrica (IPN) resultant ha sigut analitzada per mesurar les seves propietats i comparar-les amb constructes semblants realitzats a partir d'ambdós polímers per separat, amb l'objectiu de comprovar els efectes de la tècnica de síntesi en les propietats físiques y químiques del HA. La viabilitat d'aquests materials en aplicacions amb cèl¿lules ha sigut comprovada mitjançant la realització d'assajos in vitro amb fibroblasts L929. Addicionalment, s'han dut a terme vàries modificacions en la tècnica inicial de síntesi per tal d'obtenir diferents proporcions d'ambdós components - HA i PEA - als materials. Les propietats d'aquesta sèrie de IPNs han sigut mesurades per tal de revelar l'efecte que produeix cada pas de la síntesi sobre les mateixes. Els biomaterials produïts mitjançant les tècniques aquí exposades poden oferir sistemes interessants pel cultiu y/o trasplantament de cèl¿lules en futures aplicacions clíniques que desitgin incorporar l'àcid hialurònic en forma de constructe tridimensional estable. / Rodríguez Pérez, E. (2017). Diseño de nuevos biomateriales basados en redes poliméricas interpenetradas de ácido hialurónico y polímeros acrílicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90632 / TESIS

Hyaluronic acid, HA, and poly (ethyl acrylate), PEA, are two polymers widely used in biomedical applications, especially in tissue engineering, because of their excellent biocompatible and bioactive properties. HA is a highly hydrophilic biopolymer and the PEA, on the other hand, is hydrophobic. In addition, each one of them has certain shortcomings that limit the potential of its application, so that being able to combine them in a viable way in one biomaterial is of great interest and in turn is a very promising and attractive challenge for the development of new biomaterials. In this thesis, several HA-PEA combined systems are developed, making the two phases compatible in non-crosslinked state, using formic acid, FA, as a common solvent for the two polymers. The effect of formic acid on the materials is previously evaluated, ruling out chemical modification, degradation or generation of cytotoxicity. The combined systems have been developed with different geometries and architectures, in the form of two-dimensional films or blends, spun membranes and three-dimensional porous scaffolds, using solvent casting, electrospinning and freeze-extraction techniques. The physicochemical properties reveal a certain mutual reinforcement produced by both phases, and the biological characterization highlights the potential of the system as biomaterial. Additionally, other systems are made by copolymerizing PEA with ethyl 2-carboxy acrylate, CEA, in either cross-linked or non-crosslinked state. As they are new products, we proceed to their complete physico-chemical and biological characterization, confirming their aptitude as biomaterials. Also studied is the the possibility of combining these copolymers with hyaluronic acid to obtain materials with better properties than those already achieved in the HA-PEA systems. / El ácido hialurónico, HA, y el poli(acrilato de etilo), PEA, son dos polímeros ampliamente utilizados en aplicaciones biomédicas, especialmente en la ingeniería tisular, debido a sus excelentes propiedades biocompatibles y bioactivas. El HA es un biopolímero altamente hidrofílico y el PEA, por lo contrario, es hidrofóbico. Además, cada uno por separado tiene ciertas deficiencias que limitan la potencial de su aplicación, por lo que el poder combinarlos de forma viable en un biomaterial resulta de gran interés y a su vez es un reto muy prometedor y atractivo para el desarrollo de nuevos biomateriales. En esta tesis se desarrollan varios sistemas combinados HA-PEA consiguiendo compatibilizar las dos fases en estado no entrecruzado, empleando el ácido fórmico, FA, como un solvente común para los dos polímeros. Se evalúa previamente el efecto que tiene el ácido fórmico sobre los materiales, descartando modificación química, degradación o generación de citotoxicidad. Los sistemas combinados han sido desarrollados con diferentes geometrías y arquitecturas, en forma de films bidimensionales o mezclas (blends), membranas hiladas y scaffolds porosos tridimensionales, utilizando las técnicas de evaporación de solvente (solvent casting), electrospinning y freeze-extraction. Las propiedades físico-químicas revelan un cierto refuerzo mutuo producido por ambas fases, y la caracterización biológica destaca el potencial del sistema como biomaterial. Adicionalmente, se elaboran otros sistemas copolimerizando PEA con 2-carboxi acrilato de etilo, CEA, en estado tanto entrecruzado como no entrecruzado. Como se trata de productos novedosos, se procede a su caracterización completa físico-química y biológica, confirmando su aptitud como biomateriales. Asimismo, se estudia la posibilidad de producción a base de ellos de sistemas combinados con el ácido hialurónico que poseerían las propiedades mejores que las ya conseguidas en los sistemas HA-PEA. / L'àcid hialurònic, HA, i el poliacrilat d'etil, PEA, són dos polímers amplament utilitzats en aplicacions biomèdiques, especialment en l'enginyeria tissular, per les seues excel·lents propietats biocompatibles i bioactives. L'HA és un biopolímer altament hidrofílic i el PEA, pel contrari, és hidrofòbic. A més, cada un per separat té certes deficiències que limiten el potencial de la seva aplicació, de manera que poder combinar-los de manera viable en un biomaterial resulta de gran interés i és un repte molt prometedor i atractiu per al desenvolupament de nous biomaterials. En aquesta tesi es desenvolupen diversos sistemes combinats HA-PEA aconseguint compatibilitzar les dues fases en estat no entrecreuat, emprant l'àcid fòrmic, FA, com un solvent comú per als dos polímers. S'avalua prèviament l'efecte que té l'àcid fòrmic sobre els materials, descartant modificació química, degradació o generació de citotoxicitat. Els sistemes combinats han estat desenvolupats amb diferents geometries i arquitectures, en forma de films bidimensionals o barreges (blends), membranes filades i scaffolds porosos tridimensionals, utilitzant les tècniques d'evaporació de solvent (solvent casting), electrospinning i freeze-extraction. Les propietats fisicoquímiques revelen un cert reforç mutu produït per les dues fases, i la caracterització biològica destaca el potencial del sistema com a biomaterial. Addicionalment, s'han elaborat altres sistemes copolimeritzant PEA amb 2-carboxi acrilat d'etil, CEA, en estat tant entrecreuat com no entrecreuat. Com es tracta de productes nous, es procedeix a la seua caracterització completa fisicoquímica i biològica, confirmant la seva aptitud com a biomaterials. Així mateix, s'estudia la possibilitat de producció amb d'ells de sistemes combinats amb l'àcid hialurònic, que posseirien millors propietats que les ja aconseguides en els sistemes HA-PEA. / Ivashchenko, S. (2017). Sistemas combinados de ácido hialurónico y polímeros acrílicos como biomateriales para ingeniería tisular [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90649 / TESIS

[ES] El mieloma múltiple es una neoplasia hematológica caracterizada por una expansión descontrolada de células plasmáticas monoclonales (mPCs) en medula ósea que producen, en la mayoría de los casos, un componente monoclonal secretado en el suero y/o en orina. En la actualidad, se sigue considerando una enfermedad incurable con la constante aparición de recaídas en los pacientes. Una de las causas que condicionan esta situación, radica en la generación de resistencia frente a fármacos por parte de las mPCs. Este mecanismo de resistencia a fármacos (DR) se ha visto que no solo depende de factores intracelulares, sino que la propia interacción de las mPCs con el microambiente medular juega un papel fundamental para su supervivencia, crecimiento y desarrollo de DR. Entre los componentes del microambiente tumoral, destaca la adhesión de las mPCs a componentes de la matriz extracelular (ECM) que se ha visto relacionada con la generación de DR. Por este motivo el desarrollo de esta tesis doctoral consistió en la elaboración y validación de una plataforma de cultivo 3D basado en la síntesis de un microgel. Este sistema estará constituido por microesferas funcionalizadas con componentes de la ECM como son la fibronectina (FN), colágeno tipo I (COL), heparina (Hep), heparan sulfato (HS) y ácido hialurónico (HA), generando un entorno 3D biomimético con la capacidad de poder analizar la respuesta celular desencadenada por la interacción de las mPCs con los componentes de la ECM, así como la DR generada por la adhesión de las mPCs a estas biomoléculas. El primer estudio consistió en la realización y puesta a punto de varios protocolos para la síntesis de distintos microgeles; un primer sistema se produjo mediante la polimerización por vía radical en bloque de co-polímeros de poliacrilato de etilo (EA) y polimetacrilato de etilo (EMA) o bien por EA, EMA y ácido acrílico (AAc). Mediante una emulsión del tipo aceite en agua se consiguió producir con estos copolímeros, microesferas de un tamaño próximo al de las mPCs. Un segundo sistema se basó en microesferas de alginato. Estas microesferas se obtuvieron en un dispositivo de microfluidica produciéndose la gelificación externa de las micro-gotas con la incorporación de iones de calcio consiguiendo microesferas de un tamaño medio de 177 µm. Debido a la gran variedad de microesferas sintetizadas con diferentes grupos químicos en sus superficies, se consiguió establecer protocolos de funcionalización similares a los establecidos en la literatura, teniendo en cuenta la estabilidad de la biomolécula a lo largo del tiempo del cultivo celular. Este enfoque, permitió la funcionalización con una gran variedad de biomoléculas disponiendo así de microgeles funcionalizados con FN, COL, Hep, HS y HA. Una vez desarrollados los microgeles, en un segundo estudio se procedió a evaluar la respuesta celular en un entorno 3D basado en microgel, valorando la interacción con los componentes de la ECM. Entre los resultados observados se pudo determinar como el tamaño de las microesferas afecta al crecimiento celular incluso en ausencia de cualquier funcionalización. Con los microgeles constituidos por microesferas de un tamaño próximo al de las mPCs se obtuvo un mayor crecimiento celular que con los microgeles formados por partículas de mayor tamaño, y en ambos el crecimiento fue superior al del cultivo en suspensión. Se plantea la hipótesis de que la presencia de las microesferas favorece en gran medida que se produzca un mayor contacto célula-célula que se ve incrementado cuanto mayor es la superficie específica del microgel. Entre los componentes de la ECM estudiados, mientras que el COL no genera ninguna respuesta celular diferente al control (microgel no funcionalizado), el HA favorece la proliferación celular. La adhesión de las mPCs a la FN condiciona el bloqueo de las células en la fase G0-G1 del ciclo celular. Esta adhesión está mediada / [CA] El mieloma múltiple és una neoplàsia hematològica caracteritzada per una expansió descontrolada de cèl·lules plasmàtiques monoclonals (mPCs) en medul·la òssia que produeixen, en la majoria dels casos, un component monoclonal secretat en el sèrum i/o en orina. En l'actualitat, es continua considerant una malaltia incurable, amb la constant aparició de recaigudes en els pacients. Una de les causes que condicionen aquesta situació, radica en la generació de resistència enfront de fàrmacs per part de les mPCs. Aquest mecanisme de resistència a fàrmacs (DR) s'ha vist que no sols depèn de factors intracel·lulars, sinó que la mateixa interacció de les mPCs amb el microambient medul·lar juga un paper fonamental per a la seua supervivència, creixement i desenvolupament de DR. Entre els components del microambient tumoral, destaca l'adhesió de les mPCs a components de la matriu extracel·lular (ECM) que s'ha vist relacionada amb la generació de DR. Per aquest motiu, el desenvolupament d'aquesta tesi doctoral va consistir en l'elaboració i validació d'una plataforma de cultiu 3D basada en la síntesi d'un microgel. Aquest sistema estarà constituït per microesferes funcionalitzades amb components de l'ECM com són la fibronectina (FN), col·lagen tipus I (COL), heparina (Hep), heparan sulfat (HS) i àcid hialurònic (HA), generant un entorn 3D biomimètic amb la capacitat de poder analitzar la resposta cel·lular desencadenada per la interacció de les mPCs amb els components de la ECM, així com la DR generada per l'adhesió de les mPCs a aquestes biomolècules. El primer estudi va consistir en la realització i posada a punt de diversos protocols per a la síntesi de diferents microgels; un primer sistema es va produir mitjançant la polimerització per via radical en bloc de copolímers de poliacrilat d'etil (EA) i polimetacrilat d'etil (EMA), o bé per EA, EMA i àcid acrílic (AAc). Mitjançant una emulsió del tipus oli en aigua es va aconseguir produir amb aquests copolímers, microesferes d'una grandària pròxima al de les mPCs. Un segon sistema es va basar en microesferes d'alginat. Aquestes microesferes es van obtenir en un dispositiu de microfluidica produint-se la gelificació externa de les microgotes amb la incorporació d'ions de calci aconseguint microesferes d'una grandària mitjana de 177 ¿m. A causa de la gran varietat de microesferes sintetitzades amb diferents grups químics en les seues superfícies, es va aconseguir establir protocols de funcionalització similars als establerts en la literatura, tenint en compte l'estabilitat de la biomolècula al llarg del temps del cultiu cel·lular. Aquest enfocament va permetre la funcionalització amb una gran varietat de biomolècules disposant així de microgels funcionalitzats amb FN, COL, Hep, HS y HA. Una vegada desenvolupats els microgels, en un segon estudi es va procedir a avaluar la resposta cel·lular en un entorn 3D basat en microgel, valorant la interacció amb els components de l'ECM. Entre els resultats observats es va poder determinar com la grandària de les microesferes afecta el creixement cel·lular fins i tot en absència de qualsevol funcionalització. Amb els microgels constituïts per microesferes d'una grandària pròxima al de les mPCs es va obtenir un major creixement cel·lular que amb els microgels formats per partícules de major grandària, i en tots dos el creixement va ser superior al del cultiu en suspensió. Es planteja la hipòtesi que la presència de les microesferes afavoreix en gran manera que es produïsca un major contacte cèl·lula-cèl·lula que es veu incrementat com més gran és la superfície específica del microgel. Entre els components de l'ECM estudiats, mentre que el COL no genera cap resposta cel·lular diferent del control (microgel no funcionalitzat), l'HA afavoreix la proliferació cel·lular. L'adhesió de les mPCs a la FN condiciona el bloqueig de les cèl·lules en la fase G0-G1 del cic / [EN] Multiple myeloma is a haematological neoplasm characterized by an uncontrolled expansion of monoclonal plasma cells (mPCs) in bone marrow that produce, in most cases, a monoclonal component secreted in serum and/or urine. At present, it is still considered an incurable disease with the constant appearance of relapses in patients. One of the causes that condition this situation lies in the generation of drug resistance by the mPCs. This mechanism of drug resistance (DR) has been seen to depend not only on intracellular factors, but the very interaction of mPCs with the medullary microenvironment plays a fundamental role in their survival, growth and development of DR. Among the components of the tumor microenvironment, the adhesion of the mPCs to components of the extracellular matrix (ECM) stands out, which has been related to the generation of DR. For this reason, the development of this doctoral thesis consisted in the elaboration and validation of a 3D culture platform based on the synthesis of a microgel. This system will be made up of micropsheres functionalized with the components of the ECM such as fibronectin (FN), collagen type I (COL), heparin (Hep), heparan sulphate (HS) and hyaluronic acid (HA), generating a 3D biomimetic environment with the ability to analyse the cellular response triggered by the interaction of mPCs with the ECM components, as well as the DR generated by the adhesion of the mPCs to these biomolecules. The first study consisted in the realization and development of several protocols for the synthesis of different microgels. A first system was produced by the radical block polymerization of polyethylene acrylate (EA) and polymethacrylate (EMA) co-polymers or by EA, EMA and acrylic acid (AAc). By means of an oil-in-water emulsion technique, it was possible to produce, with these copolymers, microspheres of a size close to that of the mPCs. A second system was based on alginate microspheres. These microspheres were obtained in a microfluidic device producing the external gelification of the micro-drops with the incorporation of calcium ions, obtaining microspheres with an average size of 177 µm. Due to the great variety of microspheres synthesized with different chemical groups on their surfaces, it was possible to establish functionalization protocols similar to those established in the literature, taking into account the stability of the biomolecule along with the time of cell culture. This approach allowed for functionalization with a great variety of biomolecules, having in this way functionalized microgels with FN, COL, Hep, HS and HA. Once the microgels were developed, a second study was carried out to evaluate the cell response in a 3D microgel-based environment, assessing the interaction with the components of the ECM. Among the results observed, it was possible to determine how the size of the microspheres affects cell growth even in the absence of any functionalization. With the microgels constituted by microspheres close to the size of the mPCs, a greater cellular growth was obtained than with the microgels formed by larger particles, and in both the growth was higher than in suspended culture. It is hypothesized that the presence of microspheres greatly favours a greater cell-cell contact, which is increased the larger the specific surface area of the microgel. Among the components of the ECM studied, while the COL does not generate any cellular response different from the control (non-functionalized microgel), HA favours cell proliferation. The adhesion of mPCs to FN conditions the blocking of cells in the G0-G1 phase of the cell cycle. This adhesion is mediated by the integrin ¿4ß1. / La presente tesis doctoral no se podría haber realizado sin la financiación del proyecto PROMETEO/2016/063, trabajo que también estuvo parcialmente financiado con fondos FEDER (CIBERONC (CB16/12/00284)). La iniciativa CIBER-BBN está financiada por el proyecto VI National R&D&I Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program. Las acciones CIBER están financiadas por el Instituto de Salud Carlos III con ayuda del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. / Marin Paya, JC. (2021). 3D Culture o Multiple Myeloma Cell Line Using Microgel Environments [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167427 / TESIS

[EN] Since a considerable number of factors limit or prevent the autonomous regeneration of injured or degenerated tracts in the nervous system, its effective restoration is a rare phenomenon. Therefore, conventional medicine has only succeeded in therapies aimed at treating the symptoms and effects of the damage. In order to revert them and to restore the functionality of a neuronal network, tissue engineering is currently researching about the synergic use of cells, bioactive molecules and three-dimensional biocompatible supports. More precisely, the regeneration of nervous system damaged structures is being studied through strategies like the so-called neural conduits. In this thesis, a channeled porous scaffold based on hyaluronic acid, a hydrophilic natural polymer, has been designed, developed and characterized, both physicochemically and biologically. By chemically crosslinking this polymer through divinyl sulfone and next lyophilizing it, a degradable and millimeter-size conduit has been obtained, soft but stable in physiological medium. The conduit wall has a singular three-layer distribution, able to avoid glial cells migration through it, but entirely permeable to nutrients and proteins. Furthermore, if Schwann cells are cultured for 10 days within the conduit's lumen, they create a cell tube-like structure with several hundreds of microns in diameter, thin but dense, similar to those of nerve fascicles. The ability of the conduits, the Schwann cells macrosheath and a bundle of 30 um poly-L-lactic acid fibers to guide the growth of neurons in dorsal root ganglia explants has been evaluated as well. Only the biohybrid system, composed by the conduit, the stretched fibers within and the cells macrosheath, is a beneficial enough context to permit neurons grow at a similar rate to other promising strategies in tissue engineering of the nervous system. / [ES] La regeneración de tractos dañados o degenerados del sistema nervioso de manera autónoma es un fenómeno infrecuente, ya que están implicados una considerable cantidad de factores que la limitan u obstaculizan. Por ello, la medicina convencional tan solo ha logrado limitados éxitos a este respecto, tratando únicamente los síntomas y los efectos del daño. Para intentar revertirlo y lograr la reconexión funcional de neuronas, en la actualidad la ingeniería tisular está investigando acerca de la aplicación sinérgica de células, moléculas bioactivas y soportes tridimensionales biocompatibles. Concretamente, para regenerar estructuras del sistema nervioso se trabaja en la estrategia conocida como conductos neurales. En esta tesis se ha diseñado, desarrollado y caracterizado tanto fisicoquímica como biológicamente un andamiaje acanalado poroso basado en ácido hialurónico, un polímero hidrófilo natural. Mediante el entrecruzamiento químico de este mediante divinil sulfona y su posterior liofilización, se ha logrado obtener un conducto milimétrico degradable, blando pero estable en medio fisiológico que, además, posee una pared con una singular distribución en tres capas capaz de evitar la migración de células de glía a su través, pero totalmente permeable a nutrientes y proteínas. Asimismo, las células de Schwann cultivadas en el interior del conducto proliferan confinadamente hasta formar al cabo de 10 días una estructura celular tubular de varios cientos de micras de diámetro, delgada pero densa, similar a las estructuras fasciculares de los nervios. Se ha evaluado, además, la capacidad tanto de los conductos acanalados como de la macrovaina de células de Schwann y de un haz de fibras de ácido poli-L-láctico de unos 30 um de diámetro para guiar el crecimiento de neuronas de explantes de ganglios de la raíz dorsal in vitro. Tan solo el sistema biohíbrido formado por el conjunto del conducto, las fibras estiradas en su interior y la vaina de células es capaz de aportar un contexto amigable tal para permitir a las neuronas crecer a tasas del mismo orden que en otras estrategias prometedoras en ingeniería tisular del sistema nervioso. / [CAT] La regeneració autònoma de tractes del sistema nerviós danyats o degenerats és un fenomen infreqüent, en tant que hi son implicats una considerable quantitat de factors que la limiten o obstaculitzen. Per aquesta causa, la medicina convencional tan sols ha assolit èxits limitats a aquest respecte, tractant únicament els símptomes i els efectes del dany. Per tractar de revertir-ho i aconseguir la reconnexió funcional de neurones, en l'actualitat l'enginyeria tissular està investigant sobre l'aplicació sinèrgica de cèl·lules, molècules bioactives i suports tridimensionals biocompatibles. Més concretament, per a regenerar estructures del sistema nerviós es treballa amb l'estratègia coneguda com conductes neurals. A aquesta tesi s'ha dissenyat, desenvolupat i caracteritzat, tant fisicoquímica com biològicament, una bastida acanalada porosa basada en àcid hialurònic, un polímer hidròfil natural. Mitjançant el seu entrecreuament químic amb divinil sulfona i la seua posterior liofilització, s'ha aconseguit obtenir un conducte mil·limètric degradable, tou però estable en medi fisiològic que, a més a més, posseeix una paret amb una singular distribució en tres capes capaç d'evitar la migració de cèl·lules glials al seu través, però totalment permeable a nutrients i proteïnes. Tanmateix, les cèl·lules de Schwann cultivades en l'interior del conducte proliferen confinades fins que formen, als 10 dies, una estructura cel·lular tubular de centenars de micres de diàmetre, prima però densa, semblant a les estructures fasciculars dels nervis. S'ha avaluat, a més, la capacitat dels conductes acanalats, de la baina de cèl·lules de Schwann i d'un feix de fibres d'àcid poli-L-làctic d'uns 30 um de diàmetre, per guiar el creixement in vitro de neurones d'explants de ganglis de l'arrel dorsal. Només el sistema biohíbrid format pel conjunt del conducte, les fibres estirades en el seu interior i la baina de cèl·lules aporta un context amigable tal que permet a les neurones créixer a taxes del mateix ordre que altres estratègies prometedores en enginyeria tissular del sistema nerviós. / Vilariño Feltrer, G. (2015). Conductos de ácido hialurónico para el crecimiento axonal guiado [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58778 / TESIS

Tesis por compendio / [ES] Actualmente las lesiones del sistema nervioso periférico que conllevan una pérdida de continuidad de los haces axonales suelen implicar secuelas de tipo permanente. Es cierto que en el sistema nervioso periférico existe una cierta regeneración natural de los tractos axonales dañados, pero solamente cuando el espacio entre ambos extremos de la lesión es pequeño, como máximo de 5 mm. Si el espacio es mayor que esta distancia la regeneración no sucede de forma natural y se crea un neuroma traumático. Por tanto, estas lesiones largas requieren de una intervención quirúrgica para puentear la lesión, normalmente con un nervio autógrafo del propio paciente o un nervio alógrafo de un cadáver. No obstante, su uso presenta diversos inconvenientes, como la morbilidad del sitio donante donde puede ocurrir un neuroma, la necesidad de realizar una segunda cirugía, la diferencia de tamaño entre nervio receptor y donante o la necesidad de inmunosupresión en el caso de los nervios alógrafos. Por ello, la ingeniería de tejidos trabaja en el desarrollo de los conductos de guiado nervioso que incorporan estrategias para guiar topográficamente la regeneración, así como células y moléculas bioactivas. La presente tesis doctoral presenta un nuevo conducto de guiado nervioso con una aproximación multimodular para su aplicación en la regeneración de lesiones nerviosas largas (a partir de 15 mm) que hace uso de conductos tubulares huecos modulares de ácido hialurónico (HA) que contienen en su interior una estructura tubular de microfibras de ácido poliláctico (PLA). La estructura fibrilar aporta un guiado topográfico necesario para guiar el crecimiento axonal durante la regeneración a la vez que mantiene unidos los diferentes módulos de HA. Por su parte, los conductos de HA son un hidrogel que evita adherencias con el tejido circundante. A su vez, proporcionan un soporte sobre el que pueden crecer células presembradas. En concreto se ha optado por presembrar células de Schwann, las cuales son unas células gliales de soporte críticas para la regeneración del sistema nervioso periférico. Se ha observado que dichas células son capaces recubrir por completo las paredes internas de los conductos de HA formando una estructura tipo vaina, así como de recubrir las microfibras de PLA creciendo en dirección longitudinal. Los experimentos in vivo en modelo de nervio ciático de conejo han mostrado que la aproximación multimodular mejora significativamente la regeneración nerviosa gracias a proporcionar una mejor neovascularización. A su vez, gracias a las células de Schwann presembradas se ha logrado una mejora adicional de la regeneración nerviosa gracias a su efecto favorecedor del crecimiento axonal. Además, se han estudiado diferentes mejoras aplicables al conducto de guiado nervioso con el objetivo de mejorar los resultados obtenidos in vivo. Gracias a la incorporación de fibroína de seda a los conductos de HA se ha logrado mejorar sus propiedades mecánicas y biológicas. Asimismo, también se ha desarrollado un sustrato electroconductor de microfibras de PLA recubiertas con el polímero electroconductor Polipirrol gracias al cual se ha observado in vitro que es capaz de mejorar el crecimiento axonal al aplicar una estimulación eléctrica. Además, mediante un sistema de modificación génica de las células de Schwann por electrotransfección se ha logrado aumentar su secreción del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), gracias a lo cual se ha observado que se incrementa la velocidad de crecimiento axonal in vitro. / [CA] Actualment les lesions del sistema nerviós perifèric que comporten una pèrdua de continuïtat dels feixos axonals solen implicar seqüeles de tipus permanent. És cert que al sistema nerviós perifèric hi ha una certa regeneració natural dels tractes axonals danyats, però només quan l'espai entre ambdós extrems de la lesió és petit, com a màxim de 5 mm. Si l'espai és més gran que aquesta distància la regeneració no succeeix de manera natural i es crea un neuroma traumàtic. Per tant, aquestes lesions llargues requereixen una intervenció quirúrgica per pontejar la lesió, normalment amb un nervi autògraf del pacient o un nervi al·lògraf d'un cadàver. No obstant això, el seu ús presenta diversos inconvenients, com la morbilitat del lloc donant on pot ocórrer un neuroma, la necessitat de fer una segona cirurgia, la diferència de mida entre nervi receptor i donant o la necessitat d'immunosupressió en el cas dels nervis al·lògrafs . Per això, l'enginyeria de teixits treballa en el desenvolupament dels conductes de guiatge nerviós que incorporen estratègies per guiar topogràficament la regeneració, així com cèl·lules i molècules bioactives. Aquesta tesi doctoral presenta un nou conducte de guiatge nerviós amb una aproximació multimodular per a la seva aplicació en la regeneració de lesions nervioses llargues (a partir de 15 mm) que fa ús de conductes tubulars buits modulars d'àcid hialurònic (HA) que contenen al seu interior una estructura tubular de microfibres d'àcid polilàctic (PLA). L'estructura fibril·lar aporta un guiatge topogràfic necessari per guiar el creixement axonal durant la regeneració alhora que manté units els diferents mòduls d'HA. Per part seva, els conductes d'HA són un hidrogel que evita adherències amb el teixit circumdant. Alhora, proporcionen un suport sobre el qual poden créixer cèl·lules presembrades. En concret s'ha optat per presembrar cèl·lules de Schwann, les quals són unes cèl·lules glials de suport crítiques per a la regeneració del sistema nerviós perifèric. S'ha observat que aquestes cèl·lules són capaces de recobrir completament les parets internes dels conductes d'HA formant una estructura tipus beina, així com de recobrir les microfibres de PLA creixent en direcció longitudinal. Els experiments in vivo en model de nervi ciàtic de conill han mostrat que l'aproximació multimodular millora significativament la regeneració nerviosa gràcies a proporcionar una millor neovascularització. Alhora, gràcies a les cèl·lules de Schwann presembrades s'ha aconseguit una millora addicional de la regeneració nerviosa gràcies al seu efecte afavoridor del creixement axonal. A més, s'han estudiat diferents millores aplicables al conducte de guiatge nerviós per tal de millorar els resultats obtinguts in vivo. Gràcies a la incorporació de fibroïna de seda als conductes d'HA s'ha aconseguit millorar les seues propietats mecàniques i biològiques. També s'ha desenvolupat un substrat electroconductor de microfibres de PLA recobertes amb el polímer electroconductor Polipirrol gràcies al qual s'ha observat in vitro que és capaç de millorar el creixement axonal quan s'aplica una estimulació elèctrica. A més, mitjançant un sistema de modificació gènica de les cèl·lules de Schwann per electrotransfecció s'ha aconseguit augmentar la secreció del factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF), gràcies a la qual cosa s'ha observat que s'incrementa la velocitat de creixement axonal in vitro. / [EN] Currently, lesions of the peripheral nervous system that lead to a loss of continuity of the axonal bundles usually involve permanent sequelae. It is true that in the peripheral nervous system there is some natural regeneration of damaged axonal tracts, but only when the space between the two ends of the lesion is small, at most 5 mm. If the gap is greater than this distance, regeneration does not occur naturally, and a traumatic neuroma is created. Therefore, these long injuries require surgical intervention to bridge the injury, usually with an autograph nerve from the patient or an allograph nerve from a cadaver. However, its use has various drawbacks, such as the morbidity of the donor site where a neuroma can occur, the need to perform a second surgery, the difference in size between the recipient and donor nerves, or the need for immunosuppression in the case of allograft nerves. For this reason, tissue engineering works on the development of nerve guidance conduits that incorporate strategies to topographically guide the regeneration, as well as cells and bioactive molecules. This doctoral thesis presents a new nerve guidance conduit with a multimodular approach for its application in the regeneration of long nerve lesions (from 15 mm) that makes use of modular hollow tubular conduits of hyaluronic acid (HA) that contain in their inside a tubular structure of microfibers of polylactic acid (PLA). The fibrillar structure provides the necessary topographic guidance to guide axonal growth during regeneration while keeping the different HA modules together. For their part, the HA conduits are a hydrogel that prevents adhesions with the surrounding tissue. In turn, they provide a support on which preseeded cells can grow. Specifically, it has been decided to pre-seed Schwann cells, which are glial support cells that are critical for the regeneration of the peripheral nervous system. It has been observed that these cells are capable of completely covering the inner walls of the HA conduits, forming a sheath-like structure, as well as covering the PLA microfibers by growing in a longitudinal direction. In vivo experiments in a rabbit sciatic nerve model have shown that the multimodular approach significantly improves nerve regeneration by providing better neovascularization. In turn, thanks to the pre-seeded Schwann cells, an additional improvement in nerve regeneration has been achieved thanks to its promoting effect on axonal growth. In addition, different improvements applicable to the nerve guidance conduit have been studied with the aim of improving the results obtained in vivo. Thanks to the incorporation of silk fibroin into HA conduits, their mechanical and biological properties have been improved. Likewise, an electroconductive substrate of PLA microfibers coated with the electroconductive polymer Polypyrrole has also been developed, thanks to which it has been observed in vitro that it is capable of improving axonal growth by applying electrical stimulation. In addition, by means of a gene modification system of Schwann cells by electrotransfection, it has been possible to increase their secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), thanks to which it has been observed that the speed of axonal growth is increased in vitro. / Agradezco la ayuda de los diferentes proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España que han hecho posible la financiación de esta tesis doctoral: MAT2015-66666-C3-1-R, DPI2015-72863-EXP, AEI RTI2018-095872-B-C21-C22/ERDF y FPU16/01833 del Ministerio de Universidades del Gobierno de España, sin la cual no hubiera podido realizar esta tesis doctoral. / Gisbert Roca, F. (2022). Strategies for Guidance and Electrical and Biological Stimulation in a Neural Regeneration Device [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/189937 / Compendio

En un intento de optimizar el sistema de fecundación in vitro en la especie porcina se estudió la influencia de distintas condiciones de maduración y de cocultivo de los gametos. Se evaluó la reducción del tiempo de coincubación de los gametos a 10 min observándose un claro efecto del ratio espermatozoides:ovocito. El estudio de las necesidades de los espermatozoides en términos de aditivos del medio de fecundación y tiempo de coincubación reveló variaciones entre verracos. La utilización de un tiempo de coincubación tan corto como 2 min fue suficiente para obtener unas tasas de penetración y monospermia similares a las alcanzadas por los sistemas de FIV tradicionales. El sistema de FIV en pajuela con 10 min de coincubación aumentó la penetración monoespérmica y mejoró la calidad de los blastocistos. La adición de 5 nM de 9- cis ácido retinoico al medio de maduración aumentó significativamente la formación de blastocistos. / The present study was conducted in an attempt to optimize porcine in vitro fertilization system. For this purpose, the influence of maturation and gamete coculture conditions were studied. The coincubation time may be reduced to 10 min to increase the efficiency of fertilization depending on the sperm:oocytes ratio. The needs of boar spermatozoa for IVF, in terms of additives to IVF medium and coincubation times vary among boars. The use of coincubation time as brief as 2 min is long enough to obtain good fertilization rates similar to those achieved from current long term exposure times in IVF. A straw IVF system in combination with a 10 min coincubation increased monospermic penetration and the quality of blastocysts compared with the microdrop-IVF system. The addition of 5 nM of 9- cis retinoic acid in the IVM medium increased blastocyst formation rate, suggesting that RA may play an important role during IVM.