Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T11:58:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 269692.pdf: 913786 bytes, checksum: 13e90e5a3ec769acc38839c40bde474c (MD5) / O vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) é o agente infeccioso que trouxe maiores prejuízos à carcinicultura brasileira e mundial. Métodos de detecção do vírus são importantes na medida em que possibilitam a identificação da infecção dos camarões, permitindo que os criadores tomem medidas de contenção da disseminação viral, amenizando assim as perdas econômicas. As proteínas estruturais do WSSV, principalmente a VP28, são amplamente empregadas na obtenção de anticorpos poli e monoclonais, que por sua vez são utilizados no desenvolvimento de testes de detecção do WSSV. A síntese protéica em sistemas recombinantes é amplamente empregada para obtenção de proteínas recombinantes. Neste estudo, a região gênica mais hidrofílica da proteína do envelope viral VP28 foi amplificada, clonada, seqüenciada e expressa. A expressão por meio da cepa de E. coli BL21(DE3) plysS resultou em uma proteína recombinante de aproximadamente 21 KDa, denominada VP28r. A proteína recombinante possui uma cauda de histidinas na região N-terminal e permaneceu no interior da bactéria na forma de agregados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão. Os corpos de inclusão foram solubilizados com uréia 8M e a proteína foi purificada através de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados em condições desnaturantes. A metodologia para expressão e purificação da VP28r desenvolvida no presente estudo demonstrou um bom rendimento protéico final possibilitando o futuro emprego desta proteína na produção de anticorpos que potencialmente podem ser empregados no desenvolvimento de testes de detecção do WSSV.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A região C-terminal da proteína 1 de superfície de merozoítas de Plasmodium (MSP119) vem sendo estudada como um dos principais alvos para desenvolvimento de uma vacina contra malária. Estudos têm demonstrado a imunogenicidade desta região em vacinações experimentais utilizando proteínas recombinantes na presença de adjuvantes fortes. No presente estudo, consideramos a possibilidade da utilização de proteínas recombinantes baseadas na sequência da MSP119 para imunização de camundongos por uma via de mucosa. Também geramos novas proteínas recombinantes de fusão da MSP119 com a flagelina (proteína do flagelo de Salmonella enterica Typhimurium), com o intuito de aumentar a imunogenicidade deste antígeno. Avaliamos inicialmente a capacidade de atuação das moléculas toxina colérica (CT), toxina termo-lábil de E. coli (LT) e do oligodeoxinucleotídeo CpG ODN 1826 como adjuvantes em imunizações de camundongos pela via de mucosa intranasal, utilizando como antígenos as proteínas recombinantes baseadas na MSP119 de P. vivax His6PvMSP119 ou His6PvMSP119-PADRE (contendo o epítopo “helper” universal PADRE). Quando administradas na presença dos adjuvantes CT ou LT, ambas foram altamente imunogênicas pela via intranasal, induzindo altos títulos de anticorpos, maiores do que quando utilizamos o CpG ODN 1826 como adjuvante. A adição do CpG ODN 1826 em imunizações na presença de CT foi capaz de aumentar a resposta específica de IgG2c. Nossos resultados demonstraram que CT e LT são adjuvantes potentes de mucosa em imunizações com antígenos recombinantes de malária, e que o CpG ODN 1826 pode ser utilizado como ferramenta de modulação da resposta imune nestas imunizações. Subsequentemente, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da PvMSP119-PADRE fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PvMSP119-PADRE). Demonstramos que essa proteína de fusão retém as propriedades antigênicas da PvMSP119 e a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos utilizando somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células específicas produtoras de IFN-g medidas no baço dos animais imunes. A adição de CpG ODN 1826 nas imunizações foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c. Além disso, os soros dos camundongos imunizados foram capazes de reconhecer os parasitas por imunofluorescência indireta (IFA). Estes resultados demonstraram uma nova classe de antígenos candidatos à vacina contra malária, com atividade adjuvante intrínseca e capaz de estimular respostas imunológicas humoral e celular específicas, quando administrada sozinha ou na presença de outros adjuvantes. Por fim, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da MSP119 de P. falciparum (PfMSP119) fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PfMSP119). Demonstramos que esta proteína de fusão retém a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos com somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células produtoras de IFN-g específicas contra a PfMSP119. A adição de adjuvantes como CpG ODN 1826 ou Quil-A (saponina de Quillaja saponaria) nas imunizações com a proteína recombinante de fusão foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c, bem como de potencializar a resposta celular medida pela produção de IFN-g contra a PfMSP119. Os soros de coelhos imunizados com a His6FliC-PfMSP119 sem a adição de nenhum adjuvante apresentaram altos títulos de anticorpos específicos contra a PfMSP119, que foram capazes de inibir o crescimento do parasita in vitro. Esses resultados sugerem a estratégia de fusão de antígenos de plasmódios como uma alternativa viável de desenvolvimento de uma vacina barata e eficaz contra a malária. / The C-terminal region of Plasmodium merozoite surface protein 1 (MSP119) is being studied as one of the main targets for the development of a vaccine against malaria. Several studies have shown high imunogenicity of this region in experimental immunizations when injected in the presence of strong adjuvant formulations. In the present study we evaluate the possibility of using recombinant proteins based on the sequence of MSP119 to immunize mice by a mucosal route. Also, we generate new recombinant proteins consisting in the genetic fusion of the MSP119 to the flagellin FliC (flagellar protein of Salmonella enterica Typhimurium), to increase the immunogenicity of the antigen. Initially, we evaluated the capacity of the molecules cholera toxin (CT), heat-labile E. coli enterotixin (LT) or CpG ODN 1826, to act as adjuvants in mucosal intranasal immunization of mice with the recombinant proteins His6PvMSP119 or His6PvMSP119-PADRE (containing the universal T helper epitope PADRE). When administered in the presence of CT or LT, both recombinant proteins were highly immunogenic by the intranasal route. CpG ODN 1826 was less efficient as adjuvant by this route. The addition of CpG ODN 1826 in CT adjuvanted immunizations increased the specific IgG2c titers. These results showed that CT and LT are potent mucosal adjuvants in immunizations with recombinant malaria antigens and that CpG ODN 1826 can, in this case, be used as a tool to modulate the pattern of the immune response. Subsequently, we expressed a recombinant protein consisting of the sequence of PvMSP119-PADRE genetically fused to FliC (His6FliC-PvMSP119- PADRE). We showed that this fusion protein preserved the antigenic properties of PvMSP119 and the ability of flagellin to activate TLR5. The immunization of mice using this recombinant fusion protein induced high titers of specific antibodies and the presence of antigen-specific IFN-g producing cells in the spleen. The addition of CpG ODN 1826 in the vaccine formulations modulated the immune response by augmenting the specific titers of IgG2c. In addition, sera from immunized mice recognized the parasite in indirect immunofluorescence assay (IFA). Our results provided a new class of malaria vaccine formulation with intrinsic adjuvant property capable of stimulating specific humoral and cellular immune responses when administered alone or in the presence of other adjuvants. Finally, we expressed a recombinant protein containing the sequence of Plamodium falciparum MSP119 (PfMSP119) fused to FliC (His6FliC-PfMSP119). This fusion protein retained the capacity of flagellin to activate TLR5. Immunization of mice with the His6FliC-PfMSP119 alone induced high titers of specific antibodies and IFN-g producing cells. The addition of adjuvants such as CpG ODN 1826 or Quil-A (saponin of Quillaja saponaria) increased the levels of IgG2c and the cellular immune response, measured by the IFN-g secretion by immune spleen cells in culture. In addition, sera from immunized rabbits recognized the parasites in IFA and inhibited parasite growth in vitro. These results provide evidences that the fusion of malaria antigens to flagellin is an inexpensive and viable alternative for the development of a malaria vaccine. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Ingeniero Civil Químico / El presente trabajo tiene como objetivo principal, idear e implementar un algoritmo para guiar el diseño de proteínas recombinantes. Para lo anterior se recopiló y conformó una base de datos de uso de codones y abundancia de ARNt para un variado grupo de organismos, que incluyó eucariontes y procariontes. El algoritmo opera sobre una secuencia de ADN codificante, de manera que: identifica, analiza cuantitativa y cualitativamente, sugiere mutaciones de acuerdo a las bases de datos designadas automática o manualmente, analiza el plegamiento del ARNm, posibilita la disminución de la estabilidad de estructuras secundarias y permite la visualización gráfica del plegamiento. El algoritmo de mutación trabaja bajo el criterio que el sesgo en el uso de codones refleja la selección para la optimización del proceso de traducción guiado por la abundancia de ARNt. El algoritmo está diseñado para maximizar la expresión recombinante de la proteína codificada sin cambiar su secuencia de aminoácidos. Las mutaciones sugeridas son específicas para cada gen y para cada organismo hospedero en donde dicho gen se desea expresar. La principal tarea y mayor desafío del presente trabajo fue trascender los mecanismos de evolución y los inconvenientes asociados a la producción de proteínas recombinantes. Esto se realizó mediante la información y evaluación de resultados experimentales de diversas investigaciones focalizadas a la genética molecular. De este modo, se logró complementar estudios desarrollados en: el uso de codones, abundancia de ARNt, baja eficiencia de traducción en los primeros ~30-50 codones del ARNm, apareamiento de codones sinónimos en el ARNm, uso de codones mayoritarios y formación de estructuras secundarias en el ARNm. Estas características de presencia transversal en la biología celular, se utilizaron como base en el diseño e implementación de la presente herramienta bioinformática, para el análisis de secuencias codificantes de ADN y mutación sinónima en el proceso de optimización de la expresión de proteínas recombinantes.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Durante las últimas décadas, una rama de la investigación biotecnológica se ha enfocado en desarrollar y optimizar procesos de producción de proteínas recombinantes orientadas a aplicaciones terapéuticas. En particular, los péptidos terapéuticos ofrecen actualmente un nuevo potencial comercial para la industria farmacéutica y biotecnológica al generar estrategias efectivas en el tratamiento de diversas patologías como cáncer y alteraciones metabólicas entre otras. Estudios previos han demostrado la capacidad supresora de tumores de péptidos con blanco intracelular como p53p-Ant y PNC-27. Estos corresponden a regiones derivadas de la proteína p53, factor de regulación transcripcional que inhibe la progresión del ciclo celular e induce reparación celular o apoptosis, en caso de estrés genotóxico. Ambos péptidos contienen en su secuencia, un péptido de penetración celular, el cual les entrega la capacidad de atravesar la membrana plasmática. Así, bajo distintos mecanismos, con p53p-Ant y PNC-27 se ha reportado apoptosis o bien necrosis de manera selectiva en ciertos tipos de células tumorales. El presente trabajo tuvo por objetivo expresar en E. coli los péptidos p53p-Ant y PNC-27, y purificarlos mediante el sistema IMPACT. Éste es un mecanismo de expresión y purificación mediado por inteínas que permite purificar a través de una columna de afinidad, proteínas recombinantes con su secuencia nativa sin el uso de proteasas y minimizando pasos cromatográficos. Se logró producir ambos péptidos en forma soluble. La expresión soluble del péptido PNC-27 se consiguió a partir de los dos vectores de expresión proporcionados por el sistema IMPACT (pTXB1 y pTYB11), esta expresión resultó ser fuertemente dependiente de las condiciones de cultivo ya que se requiere de una inducción a baja temperatura (12 °C). Por su parte, la expresión soluble de p53p-Ant depende tanto del sistema de expresión como de las condiciones de cultivo. El diseño de las construcciones genéticas, en particular las que incluyen el vector de expresión pTYB11, permitió una efectiva purificación de los péptidos utilizando un único paso cromatográfico. Más aún, los niveles de rendimiento (0,4 1,2 mg L-1) superan los reportados para péptidos con el mismo sistema y los niveles de pureza obtenidos permitirían desarrollar investigación avanzada con ensayos biológicos in vivo o in vitro.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mediante la tecnología del DNA recombinante, en esta memoria se pretendió aportar nuevos antecedentes en relación con la interacción hospedero-parásito, fundamentalmente acerca de los mecanismos moleculares que utilizan las larvas infectantes de Toxocara canis para evadir la respuesta inmune. Con dicho objetivo se procedió al clonamiento, secuenciación y análisis computacional de cDNAs expresados por estas larvas infectantes. Para ello se rastreó una genoteca lamda - ZAP de cDNA de T. canis, de la cual se aislaron y purificaron 72 clones. En base a estudios de PCR se seleccionaron 12 clones que posteriormente fueron secuenciados desde su extremo 5’, y analizados usando bancos de datos y programas de computación. Finalmente, con el objetivo de obtener más antecedentes sobre la función de las proteínas codificadas por estos clones, se intentó la expresión de algunos de ellos mediante vectores de alta expresión. De los 12 clones analizados, sólo uno de ellos no pudo ser estudiado debido a que poseía un inserto demasiado pequeño. Los clones B-3 y E-7, no presentaron ninguna similitud significativa con secuencias de los bancos de datos. Esto sugiere fuertemente que ambos clones codifican para moléculas aún no descritas de T. canis. Otros dos clones, A-3 y A-6, presentaron similitud con genes que codifican para una proteína ribosomal y otra de "shock térmico de Drosophila sp. Los clones B-7 y B-13 presentaron un alto grado de similitud con transcritos de T. canis abundantemente expresados denominados Tc-ant-095 y Tc-ant-30. El clon D-10, presentó similitud con una secuencia denominada K023h06.yl de T. canis, la cual es un transcrito expresado en estadios adultos del parásito. Los clones 01 y 02, presentaron similitud con secuencias llamadas lectinas tipo - C de T. canis. A su vez los clones D-13 y A14, mostraron gran similitud con mucinas de T. canis, previamente descritas por otros autores. En base diversos antecedentes experimentales, se ha sugerido que tanto las lectinas tipo - C como las mucinas, podrían estar involucradas en estrategias de evasión de la respuesta inmune en estos parásitos. Finalmente, todos los intentos de expresar proteínas recombinantes codificados por nuestros clones fueron infructuosos, futuros trabajos serán necesarios para lograr estos objetivos. / PROYECTO DID TNAC 24-02/01.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Marcos Túlio Oliveira / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é um fitopatógeno responsável por causar o Cancro Cítrico, relacionado a grandes perdas econômicas para a citricultura. Esta bactéria utiliza diversos mecanismos moleculares para infectar o hospedeiro, dentre eles, o Sistema de Secreção Tipo III (T3SS), considerado o principal fator de virulência expresso in planta pela Xac. Sabe-se que a ativação do T3SS é controlada por dois reguladores: HrpG e HrpX. Porém, os mecanismos que controlam estes reguladores e posteriormente a expressão do T3SS in planta ainda são pouco compreendidos. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa sugerem que a concentração de fosfato inorgânico (Pi) presente em meio de cultura ou em espaço apoplástico, onde a Xac causa a infecção em plantas, pode estar relacionado com a ativação do T3SS, sugerindo uma possível relação entre o Pi com os reguladores HrpG e HrpX. Em Xac, a detecção e transportorte do Pi é realizada pelo sistema de dois componentes (TCS) PhoR/PhoB, codificado pelo operon pho. Afim de averiguar a possível relação entre PhoR/PhoB com os reguladores do T3SS HrpG e HrpX, ensaios de modelagem molecular foram realizados, indicando que a proteína PhoR poderia interagir fisicamente com HrpG, fosforilando-a, e sugerindo um possível mecanismo de interação entre o TCS PhoR/PhoB e os genes reguladores do T3SS. Para testar a hipótese de interação física entre HrpG e PhoR, as proteínas recombinantes PhoR, PhoB e HrpG de Xac foram expressas em células de Escher... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker, responsible for significant economic losses in citriculture. This bacteria uses several molecular mechanisms to infect the host, such as the Type III Secretion System (T3SS), which is considered the main factor of virulence expressed in plant by Xac. Activation of T3SS is controlled by two regulators, HrpG and HrpX, however, the mechanisms that control these regulators and subsequently the expression of T3SS in planta are poorly understood. Previosuly, our research group identified that the concentration of inorganic phosphate (Pi) present in culture media or in the apoplastic space, where Xac causes infection in plants, may be related to the activation of T3SS, suggesting a possible relationship between Pi and the HrpG and HrpX regulators. In Xac, the detection and transport of Pi is performed by the two-component system (TCS) PhoR/PhoB, encoded by the operon pho. In order to investigate the possible relationship between PhoR/PhoB and the regulators of T3SS HrpG and HrpX, molecular modeling analyses were performed and indicated that the PhoR protein could physically interact with HrpG and phosphorylate it, suggesting a possible mechanism of interaction between TCS PhoR / PhoB and the T3SS regulatory genes with subsequent activation of T3SS. To test the hypothesis, recombinant forms of PhoR, PhoB and HrpG were expressed in Escherichia coli BL21 cells for the purpose of performing pull-down ass... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 75-89. Publié aussi en version électronique.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-25T20:55:47Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T20:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada por Leishmania chagasi. Os cães são considerados como principais reservatórios do parasito. Uma vacina efetiva para o cão pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Em um estudo prévio, antígenos recombinantes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi, foram selecionados a fim de serem avaliados como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. No presente trabalho, a resposta imune humoral e celular de camundongos foi avaliada após injeção de alguns desses antígenos recombinantes, em cinco diferentes protocolos de imunização. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados com as proteínas rLci4A-NH6 ou rLci2B-NH6, isoladamente ou associadas aos adjuvantes saponina, ODN 1826 ou diferentes doses de um plasmídeo codificando IL-12 murina. Além disso, animais foram sensibilizados com plasmídeo codificando Lci2B e receberam reforço com a proteína rLci2B-NH6 associada à saponina. Por último, os animais foram injetados com plasmídeos codificando novos antígenos, Lci2-NT-5R-CT ou Lci2-NT-CT, e recebram reforço com as respectivas proteínas recombinantes rLci2-NT-5R-CT-NH6 ou rLci2-NT-CT-NH6 associadas à saponina. Nesse último protocolo, os plasmídeos utilizados continham o gene para uma proteína transmembrana associada a lisossomos, LAMP, visando à produção in vivo de quimeras de dos antígenos de Leishmania com LAMP, a fim de direcionar a apresentação dos peptídeos para linfócitos T CD4+ via moléculas de MHC-II. Em um dos protocolos, os animais foram desafiados com 1 x 107 Leishmanias para avaliação da carga parasitária no baço após imunização. Os resultados encontrados mostraram que animais que receberam rLci4A-NH6, isoladamente ou com diferentes doses de plasmídeo codificando IL-12, apresentaram níveis signficantes de IgG e IgG1, ao passo que o uso do antígeno com os adjuvantes saponina ou ODN 1826 induziu a produção de IgG, IgG2a e IgG1, além de produção de IL-5 pelo grupo que recebeu saponina. Animais que receberam rLci2B-NH6, isoladamente ou associado aos plasmídeos contendo inserto de IL-12, produziram IgG e IgG1 antígeno específicos e falharam também na produção de citocinas e proliferação celular. A utilização de saponina com esse antígeno induziu produção de IgG, IgG2a e IgG1, assim como de IFN-γ. Já o uso de ODN 1826, induziu a produção de IgG e IgG1, favoreceu a produção de IgG2a, mas falhou na indução de resposta imune celular significante. Por outro lado, animais que receberam plasmídeo codificando Lci2B e reforço com a proteína associada à saponina apresentaram uma resposta imune com predominância de anticorpos IgG2a e produção de IFN-γ por alguns animais, a qual não conferiu proteção contra infecção pelo parasito. Por fim, a utilização de quimeras de LAMP/Lci2-NT-5R-CT ou LAMP/Lci2-5R-CT induziu uma fraca resposta imune humoral, com produção de IgG, IgG1 e IgG2a por alguns animais. No entanto, a utilização da quimera LAMP/Lci2-NT-CT induziu proliferação celular e tendência a produção de IFN-γ. Em conclusão, nenhum dos cinco protocolos utilizados foi capaz de induzir uma resposta imune específica predominantemente celular do tipo Th1 ou capaz de conferir proteção contra infecção dos animais. / Visceral leishmaniasis is a disease caused by Leishmania chagasi. Dogs are the main reservoir of the parasite. A canine vaccine may contribute to the desease control in humans and dogs. In a previous study, recombinant antigens were selected from a cDNA library of Leishmania chagasi amastigotes in order to be evaluated as components of a vaccine against canine visceral leishmaniasis. In this study, five immunization protocols were assessed in mice with some of these antigens. BALB/c mice were injected with either rLci4A-NH6 or rLci2B-NH6 proteins, associated or not with the adjuvants saponin, ODN 1826 and different doses of a plasmid encoding murine IL-12 (pIL-12). Moreover, animals were primed with a plasmid encoding Lci2B (pLci2B) and boosted with rLci2B combined with saponin. Finally, all mice were primed with new antigens, Lci2-NT-5R-CT or Lci2-NT-CT, and they were boosted with the following recombinant proteins rLci2-NT-5R-CT-NH6 or rLci2-NT-CTNH6 associated with saponin. In this late experiment, the used plasmids had an insert of a lisossome associated membrane protein, LAMP, to produce in vivo chimeras composed of LAMP with the antigens and to direct the presentation of the peptides to CD4+ T cell through MHC-II molecules. The humoral immune response was assessed by antibodies production (IgG, IgG1 and IgG2a) in animal serum samples and the cellular immune response by cellular proliferation and cytokine production (IFN-γ and IL-5). The results showed that animals that were injected with rLci4A-NH6 alone or combined with pIL-12 generated IgG and IgG1 specific antibodies, while others that received saponin and ODN 1826 as adjuvants produced IgG, IgG2a and IgG1. Furthermore, IL-5 was detected in rLci4A-NH6/saponin group, but only in one of two experiments. Animals that were injected with rLci2B-NH6, alone or associated with pIL-12, presented IgG and IgG1 antibodies but no cellular immune response. The saponin used as adjuvant induced IgG, IgG2a and IgG1 antibodies, as well as IFN-γ. The use of ODN 1826 induced IgG and IgG1, and favored IgG2a production, but failed in inducing IFN-γ. On the other hand, animals that were primed with pLci2B and boosted with the protein associated with saponin produced IgG IgG1 and more intensively IgG2a, and only some animals produced IFN-γ. Nevertheless, such immune response did not protect the animals against the parasite infection. At last, LAMP/Lci2-NT-5R-CT or LAMP/Lci2-5R-CT chimeras induced a weak humoral immune response, in which IgG, IgG1 and IgG2a antibodies were detected in only a few animals. However, mice that were injected with LAMP/Lci2-NT-CT presented cellular proliferation and some animals produced IFN-γ. In conclusion, in spite of the fact that the antigens are immunogenic in a murine model, none of the used protocols elicited an intense Th1 cellular immune response or a protective one.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.