Orientador: Mauricio Barbanti Duarte José / Coorientador: Lawrence Charles Smith / Banca: Fabiana Fernandes Bressan / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: José Antonio Visintin / Banca: Eveline dos Santos Zanetti / Resumo: Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida ("induced pluripotent stem cells" - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Deer have been enduring pressures on their natural habitat, which causes segregation between populations and reduced genetic diversity. Although cryopreservation and storage of gamete and embryos can be used as a strategy for the preservation of wild populations, few studies have been successful due to difficulties to recover these materials. Recent studies in mice and humans have shown that induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from somatic cells can be differentiated into germ cells, oocytes, and spermatozoa. Thus, we hypothesize that viable gametes could also be obtained from somatic cells in deer. To date, iPSC cells have not been derived in cervids and therefore our main goal is to establish protocols to obtain stable iPSC lines from deer somatic cells. The process of reprogramming somatic cells into iPSC cells is facilitated by the use of adult stem cells that still have the multipotent capacity. As little is known about multipotent stem cells in deer, the first objective of this study was to obtain biopsies from various tissues with multipotent differentiation capacity. Among these tissues are the stem cells from adipose tissue, antler, and skin. Once primary cultures were established, cells from each tissue were evaluated for doubling time and then induced in vitro to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes lineages in order to assess their plasticity. Moreover, the expression of molecular markers was characterized by immunocytochemistry (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) and RT-PCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). The second objective of this study was to derive iPSC lineages from multipotent stem cells in deer. The derivation of iPSC lines was tested by transfection with four transcription factors (c-Myc, Klf4, Oct4, and Sox2) using nucleofection, lipofection or lentiviral re... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de células somáticas demonstrou que células adultas de mamíferos podem ser reprogramadas a um estágio de pluripotência através da inserção de fatores de transcrição embrionários. Esta descoberta tem levantado questões fundamentais sobre os mecanismos, que através destes fatores de transcrição, influenciam epigeneticamente as células e seus potenciais de diferenciação após a reprogramação e um normal desenvolvimento. Componentes lipídicos e lipoprotéicos afetam vários aspectos no comportamento celular durante sua manutenção e diferenciação, podendo afetar diretamente fatores essenciais em processos de reprogramação celular, manutenção da pluripotência e perfil epigenético das células. Nesse sentido, esta tese propôs o estudo da composição lipídica com diferentes abordagens entre células iPS, células-tronco embrionárias (H1) e células fibroblastos (BJ). Foram produzidas três linhagens de células pluripotentes induzidas no modelo humano que foram caracterizadas quanto 1a sua pluripotência e utilizadas, juntamente às linhagens H1 e BJ como modelos para o estudo da composição lipídica proposto. Foram identificadas e estudadas um total de 44 espécies lipídicas das classes PC, PE, PI, SM e PS, e discutidas frente a reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Foi identificado um padrão de composição fosfolipídica distinta entre células pluripotentes e não pluripotentes, e especulamos que a presença dessas espécies parecem ter um envolvimento fundamental para a manutenção da pluripotência. Este padrão, mostrou pela análise de componente principal, que durante o processo de reprogramação, alterações na composição lipídica ocorrem de forma com que a pluripotência surge durante a reprogramação, evidenciando alterações lipídicas particulares do estádio da pluripotência, sugerindo uma ligação entre estas alterações na composição lipídica com as alterações metabólicas da própria reprogramação celular. O estudo da quantificação de fosfolipídios entre linhagens celulares pluripotentes e não pluripotentes evidenciaram que existe uma diferença fosfolipídica entre estas linhagens, observamos que as linhagens iPS e H1, do ponto de vista das classes observadas e os fosfolipídios quantificados, são similares entre si e diferentes de células não pluripotentes. É evidente que estas moléculas lipídicas, individualmente, não são capazes de modular processos como a reprogramação celular, entretanto, é de extrema importância o entendimento das mesmas dentro da reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Nossos dados sugerem que a composição lipídica de células pluripotentes tem importante papel para o desenvolvimento e evolução do processo de reprogramação celular e o entendimento da manutenção da pluripotência / The generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from adult somatic cells has shown that mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the insertion of embryonic transcription factors. This finding has raised questions about the fundamental mechanisms through which these transcription factors epigenetically influence cells, their potential of differentiation after reprogramming and normal development. Lipid and lipoprotein components affect numerous aspects of cell behavior during its maintenance and differentiation, which can directly affect main factors in cell reprogramming processes, maintenance of pluripotency and epigenetic profile of the cells. Thus, this thesis proposed to study, with different approaches, the lipid composition of iPS cells, embryonic stem cells (H1) and fibroblast cells (BJ). Three induced pluripotent cell lines were produced in the human model. They were characterized regarding their pluripotency and used along with H1 and BJ cell lines, as models for the proposed lipid composition study. A total of 44 species of lipid from the classes PC, PE, PI, PS and SM have been identified, studied and discussed regarding cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. A different phospholipid composition pattern was observed between pluripotent and non-pluripotent cells, and it is speculated that the presence of these species appears to have a major involvement on the maintenance of pluripotency. This array showed, by the principal component analysis, that during the reprogramming process changes in the lipid composition occur, so that pluripotency takes place during reprogramming, highlighting lipid changes particular of the pluripotency state, suggesting a connection between these changes in lipid composition and the metabolic changes of cell reprogramming. The study of the quantitation of phospholipids from pluripotent and non-pluripotent cell lines indicated a phospholipid difference between these cell lines when considering the observed classes and quantified phospholipid. It was eminent that iPS lines and H1 are similar and differ from non-pluripotent cells. It is clear that these lipid molecules are not individually capable of modulating processes such as cell reprogramming, however, it is extremely important to understand them within cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. Our data suggests that the lipid composition of pluripotent cells has important role in the development and evolution of cellular reprogramming process and the understanding the maintenance of pluripotency

Submitted by Midyan Daroz Guastali null (midyandaroz@yahoo.com.br) on 2017-01-03T01:56:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Midyan Daroz Guastali.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) Previous issue date: 2016-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência de obtenção de células de pluripotência induzida (iPS) em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de mecanismo viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de infecção e qual o tipo de célula é mais eficiente para reprogramação celular. Ambos os tipos celulares foram infectados com vetores virais e transposons contendo os genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, KLF-4; as células transformadas foram avaliadas quanto a morfologia, imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e também quanto as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim as células reprogramadas foram induzidas a se diferenciarem em tecidos dos 3 folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à infecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos (7 dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi lenta, com a 1ª passagem realizada 30 dias após a infecção em comparação com as colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Não foi verificada reprogramação efetiva as infecções com transposons em nenhum dos dois tipos celulares. Conclui-se que o método de infecção por vetor viral em células do cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e que em ambos os tipos celulares, o mecanismo de transposons não resultou em células reprogramadas. / Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and non-viral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry and flow cytometry with the typical pluripotent stem cells markers and also for the changes caused in the gene expression profile of the cells by the PCR real time method; finally reprogrammed cells were induced to reprogram to differentiate into three germ layers tissues. The results showed that fibroblasts and cord cells subjected to viral infection presented pluripotent cell characteristics such as morphology, positive staining for antibodies and specific gene expression, immunocytochemistry of the formed embryoid bodies also showed labeling for ectoderm, mesoderm and endoderm. Despite the time to start colonies formation is very similar (7 days for fibroblasts and 6 days for cord cells), the expansion of reprogrammed fibroblasts colonies was slow, with the 1st performed 30 days post-infection in comparison with umbilical cord colonies, in which the 1st pass on cord colonies after 15 days. No effective reprogramming of transposon infections was observed in either cell type. It is concluded that the method of viral vector infection in umbilical cord cells is more efficient than in fibroblasts and that in both cell types, the mechanism of transposons did not result in reprogrammed cells. / FAPESP: 2012/18735-4

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de células somáticas demonstrou que células adultas de mamíferos podem ser reprogramadas a um estágio de pluripotência através da inserção de fatores de transcrição embrionários. Esta descoberta tem levantado questões fundamentais sobre os mecanismos, que através destes fatores de transcrição, influenciam epigeneticamente as células e seus potenciais de diferenciação após a reprogramação e um normal desenvolvimento. Componentes lipídicos e lipoprotéicos afetam vários aspectos no comportamento celular durante sua manutenção e diferenciação, podendo afetar diretamente fatores essenciais em processos de reprogramação celular, manutenção da pluripotência e perfil epigenético das células. Nesse sentido, esta tese propôs o estudo da composição lipídica com diferentes abordagens entre células iPS, células-tronco embrionárias (H1) e células fibroblastos (BJ). Foram produzidas três linhagens de células pluripotentes induzidas no modelo humano que foram caracterizadas quanto 1a sua pluripotência e utilizadas, juntamente às linhagens H1 e BJ como modelos para o estudo da composição lipídica proposto. Foram identificadas e estudadas um total de 44 espécies lipídicas das classes PC, PE, PI, SM e PS, e discutidas frente a reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Foi identificado um padrão de composição fosfolipídica distinta entre células pluripotentes e não pluripotentes, e especulamos que a presença dessas espécies parecem ter um envolvimento fundamental para a manutenção da pluripotência. Este padrão, mostrou pela análise de componente principal, que durante o processo de reprogramação, alterações na composição lipídica ocorrem de forma com que a pluripotência surge durante a reprogramação, evidenciando alterações lipídicas particulares do estádio da pluripotência, sugerindo uma ligação entre estas alterações na composição lipídica com as alterações metabólicas da própria reprogramação celular. O estudo da quantificação de fosfolipídios entre linhagens celulares pluripotentes e não pluripotentes evidenciaram que existe uma diferença fosfolipídica entre estas linhagens, observamos que as linhagens iPS e H1, do ponto de vista das classes observadas e os fosfolipídios quantificados, são similares entre si e diferentes de células não pluripotentes. É evidente que estas moléculas lipídicas, individualmente, não são capazes de modular processos como a reprogramação celular, entretanto, é de extrema importância o entendimento das mesmas dentro da reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Nossos dados sugerem que a composição lipídica de células pluripotentes tem importante papel para o desenvolvimento e evolução do processo de reprogramação celular e o entendimento da manutenção da pluripotência / The generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from adult somatic cells has shown that mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the insertion of embryonic transcription factors. This finding has raised questions about the fundamental mechanisms through which these transcription factors epigenetically influence cells, their potential of differentiation after reprogramming and normal development. Lipid and lipoprotein components affect numerous aspects of cell behavior during its maintenance and differentiation, which can directly affect main factors in cell reprogramming processes, maintenance of pluripotency and epigenetic profile of the cells. Thus, this thesis proposed to study, with different approaches, the lipid composition of iPS cells, embryonic stem cells (H1) and fibroblast cells (BJ). Three induced pluripotent cell lines were produced in the human model. They were characterized regarding their pluripotency and used along with H1 and BJ cell lines, as models for the proposed lipid composition study. A total of 44 species of lipid from the classes PC, PE, PI, PS and SM have been identified, studied and discussed regarding cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. A different phospholipid composition pattern was observed between pluripotent and non-pluripotent cells, and it is speculated that the presence of these species appears to have a major involvement on the maintenance of pluripotency. This array showed, by the principal component analysis, that during the reprogramming process changes in the lipid composition occur, so that pluripotency takes place during reprogramming, highlighting lipid changes particular of the pluripotency state, suggesting a connection between these changes in lipid composition and the metabolic changes of cell reprogramming. The study of the quantitation of phospholipids from pluripotent and non-pluripotent cell lines indicated a phospholipid difference between these cell lines when considering the observed classes and quantified phospholipid. It was eminent that iPS lines and H1 are similar and differ from non-pluripotent cells. It is clear that these lipid molecules are not individually capable of modulating processes such as cell reprogramming, however, it is extremely important to understand them within cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. Our data suggests that the lipid composition of pluripotent cells has important role in the development and evolution of cellular reprogramming process and the understanding the maintenance of pluripotency

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem mu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and nonviral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro / Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Epigenetic programming is the main mechanism regulating cell function and gene expression, through the activation or repression of transcriptional activity. In addition, epigenetics is closely related to reproductive events such as cell reprogramming and embryo development. In the first study, the effects of the germinal vesicle (GV) oocyte extract alone, or in combination with the deacetylase inhibitor Scriptaid, on porcine somatic cell reprogramming were evaluated. The formation of stem cell-like colonies were observed approximately two weeks after treatment with oocyte extract or oocyte extract plus Scriptaid. The colony number, at the time of appearance and after 48 hours, was similar between treatments. Partial activation of pluripotent, chromatin modifying and DNA methylating genes such as Ezh2 and Dnmt1, was observed three days after the oocyte extract treatment. However, the mRNA expression levels of the previous genes were similar to the control 15 days after treatment. This data suggest that GV oocyte extract is able to induce limited reprogramming in porcine fibroblasts, seen here by the partial activation of these genes. In the second study, brahmarelated gene-1 (BRG1), a cofactor and activator of chromatin modifications, and lysine demethylase 1A (Kdm1A), a repressor of gene expression, were characterized during porcine embryo development. Kdm1A is involved in the demethylation of both mono- and dimethylations, H3K4me and H3K4me2, respectively, on lysine 4 of histone 3. Firstly, we observed that proteins for both factors (BRG1 and Kdm1A) were absent in the nuclei of metaphase II oocytes, however, the proportion of nuclear localization increased on day 3-4 of embryo development. This time point coincides with the embryonic genome activation (EGA) in swine. Furthermore, using a well-established model of embryo developmental competence, based on time of first cleavage, it was verified that these factors were regulated during embryo development and are correlated with mRNA expression of other demethylases and H3K4me and H3K4me2 levels during EGA. It was also observed that BRG1 and Kdm1A levels are correlated with embryo cell numbers during EGA. These data suggest that BRG1 and Kdm1A participate in the regulation of H3K4 methylation during embryonic genome activation, and consequently, embryo development in swine. / A epigenética tem se destacado como a principal moduladora das funções celulares e reguladora da expressão gênica, seja pela ativação ou repressão da atividade transcricional. Além disso, a epigenética está relacionada diretamente a processos reprodutivos como a reprogramação celular e o desenvolvimento embrionário. Em um primeiro estudo, foi avaliado o efeito do extrato de oócitos em vesícula germinativa (VG), isoladamente, ou em associação com o inibidor de deacetilase, Scriptaid, sobre o potencial de reprogramação celular em células somáticas suínas. Foi observada a formação de colônias semelhantes à células-tronco pluripotentes aproximadamente duas semanas após o tratamento com o extrato de oócitos ou extrato de oócitos associado ao Scriptaid. O número de colônias, no dia de aparecimento e 48 horas após esse período, foi semelhante entre as células tratadas somente com o extrato de oócitos ou em associação com Scriptaid. Foi observada ainda a ativação parcial de genes de pluripotência celular e de genes reguladores de modificações de cromatina e de metilação de DNA, como o Ezh2 e o Dnmt1, três dias após o tratamento com extrato de oócitos. No entanto, 15 dias após o tratamento, esses níveis retornaram aos níveis do controle. Esses dados sugerem que o extrato de oócitos em estádio de VG é capaz de induzir uma reprogramação parcial nos fibroblastos suínos, caracterizada pela indução parcial de pluripotência e modulação de modificadores epigenéticos. Em um segundo estudo, foram caracterizados o co-fator ativador e remodelador de cromatina (BRG1), e a lisina demetilase 1 A (KDM1A), durante o desenvolvimento embrionário de suínos. A KDM1A atua na desmetilação da mono e dimetilação da lisina 4 da histona 3 (H3K4m3 e H3K4me2, respectivamente). Primeiramente, foi verificado que as proteínas desses fatores não estão presentes no núcleo de oócitos no estádio de metáfase II, porém estão presentes no núcleo da maioria dos embriões durante os dias 3-4 do desenvolvimento embrionário, o que coincide com o momento da ativação do genoma embrionário (EGA), na espécie suína. Além disso, utilizando um modelo de alta e baixa competência para o desenvolvimento, foi verificado que a expressão de RNAm desses fatores são regulados durante o desenvolvimento embrionário e estão correlacionados com a expressão de RNAm de outras enzimas demetilases de lisinas e com níveis de metilação da H3K4me e H3K4me2 durante a EGA. Observou-se ainda que os níveis proteicos dos fatores BRG1 e KDM1A parecem ter relação com o numero de células por embrião durante a EGA. Esses dados sugerem que esses fatores podem apresentar um envolvimento na regulação da H3K4 durante a ativação do genoma e consequente no desenvolvimento embrionário.

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro / Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estabelecida e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTINA, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTINA e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional. / In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially like NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTINA, BETA TUBULIN III and VIMENTINA and gene expression of NESTINA and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma patologia neuromuscular causada pela mutação ou deleção do gene da distrofina, localizado no cromossomo X, levando a degeneração muscular ao longo da vida do paciente. A doença também tem sido associada a déficit cognitivo e falta de habilidade comportamental. Pesquisas com células neurais de pacientes com DMD poderiam ajudar a elucidar os sintomas neurológicos associados. Neste trabalho, através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas da polpa de dente decíduo esfoliado (SHED) de pacientes com DMD modelamos a DMD produzindo células neurais vivas in vitro. A expressão da distrofina foi verificada durante e após a diferenciação neuronal e nos ensaios de imunofluorescência, mostrando que essa proteína está presente em células do SNC. Na análise gênica através do qPCR, a Dp71 e a Dp140, isoformas da distrofina, apresentavam uma expressão menor do que os controles. Além disso, as análises das sinapses baseada na colocalização de marcadores pré e pós-sinápticos (Sinapsina1 e Homer 1) revelaram que os neurônios dos pacientes com DMD tinham menor quantidade de sinapses que os controles, reforçando o papel da distrofina no SNC. Logo, a expressão de genes relacionados a plasticidade sináptica revelou 10 genes alterados nos neurônios dos pacientes DMD, sugerindo que a mutação no gene da distrofina possivelmente altera a plasticidade sináptica e pode estar envolvida na habilidade cognitiva destes pacientes. Desta forma, com base nos nossos achados, a modelagem neuronal de DMD é factível e pode auxiliar a elucidar os mecanismos da fisiopatologia da doença / The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disorder caused by a mutation or deletion of the dystrophin gene located on the X chromosome, leading to muscle degeneration throughout the patient\'s life. The disease has also been associated with cognitive impairment and lack of behavioral skill. Research on neural cells from patients with DMD could help to elucidate the neurological symptoms associated. In this work, through induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from dental pulp exfoliated (SHED) of patients with DMD model the DMD producing living neural cells in vitro. The dystrophin expression was observed during and after neuronal differentiation and immunofluorescence assays, showing that this protein is present in CNS cells. In gene analysis by qPCR, the Dp71 and Dp140, isoforms of dystrophin, had a lower expression than controls. Furthermore, based on analysis of synapses colocalization pre and postsynaptic markers (Synapsin1 and Homer 1) showed that neurons of DMD patients had lower number of synapses controls, supporting a role for dystrophin in the CNS. Finally, the expression of synaptic plasticity related genes wasfound in 10 genes altered in neurons of DMD patients, suggesting that the mutation of the dystrophin gene possibly alters synaptic plasticity and may be involved in cognitive ability of these patients. Finally, based on our findings, neuronal modeling DMD is feasible and may help elucidate the mechanisms of pathophysiology of the disease