Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr5S, transcrits par l'ARN polymérase III, sont présents à environs 1000 copies regroupées en blocs situés au niveau de l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. Le chromosome 5 porte un locus d'ADNr 5S sur chacun de ses bras. Seuls les loci du chromosome 4 et du bras gauche du chromosome 5 contiennent des gènes d'arn 5S transcrits. La population d'ARNr 5S est hétérogène chez Arabidopsis et se caractérise par la présence d'un ARNr 5S dit "majoritaire", représentant plus de 90% des transcrits 5S de la cellule, et d'ARN 5S "minoritaires" différant du transcrit 5S majoritaire par une ou deux substitutions nucléotidiques. Dans le cadre de l'étude de la régulation génétique de l'expression des gènes d'ARN 5S, nous avons identifié cloné et caractérisé TFIIIA d'Arabidopsis, qui est le facteur de transcription spécifique des gènes d'ARNr 5S. Lors de cette étude, nous avons également identifié un produit d'épissage alternatif du gène TFIIIA, codant une protéine plus courte que TFIIIA dans sa partie N-terminale dénomée TFIIIAbis. L'analyse de lignées RNAi ciblant TFIIIAbis et des expériences de transcription in vitro, ont suggéré que l'TFIIIAbis aurait un effet positif sur le taux global des ARNr 5S, probablement en stabilisant ces ARN. Nous avons aussi mené une étude de la régulation épigénétique de l'expression des gènes d'ARNr 5S. Ainsi, nous avons démontré l'implication de la méthylation de l'ADN dans la répression de la transcription des gènes d'ARNr 5S minoritaires. L'expression de ces gènes est aussi contrôlée par la voie de répression transcriptionnelle indépendante de la méthylation ADN dont MOM1 fait partie. Nous avons identifié un nouveau type de transcrits provenant de gènes d'ARNr 5S, appelés ARNr 5S-210. De la même façon que les ARNr 5S minoritaires, l'expression des ARNr 5S-210 est contrôlée par la méthylation de l'ADN et par la voie de répression contenant MOM1. Enfin, nous montrons que toutes les séquences répétées hétérochromatiques, à l'exception des éléments transposables, sont soumises à ces deux voies de répression

Dans les océans, les microbes sont à la base de la chaîne alimentaire et sont essentiels aux cycles biogéochimiques marins. Le domaine de l'écologie marine moléculaire a révélé que les microbes eucaryotes présentent une grande diversité à tous les rangs taxonomiques. Des recherches étudiant le gène ARNr 18S à partir de l'ADN ont fourni des informations phylogénétiques sur les communautés microbiennes eucaryotes dans l'océan Arctique. Ce projet constitue la première étude portant sur la diversité de ces communautés à partir des transcrits d'ARNr. Ces transcrits ont révélé l'identité taxonomique des communautés microbiennes eucaryotes actives dans cette région sensible aux changements climatiques. En plus, ceci est la première étude, en haute mer, de la nitrate réductase assimilatrice (NR), un gène eucaryote fonctionnel clé. La comparaison entre l'ADN et l' ARN fourni de l'information sur l'histoire des masses d'eau et permet de lier la taxonomie et l'activité dans un environnement naturel.

La transcription des gènes de l'ARN ribosomique (ARNr) est essentielle à la synthèse des ribosomes qui sont eux-mêmes requis pour la production des protéines et donc de l'ensemble des fonctions cellulaires. Malgré ce rôle fondamental, les mécanismes de la synthèse des ARN ribosomiques sont peu élucidés. Mes travaux ont d'abord porté sur la caractérisation du facteur de liaison en amont UBF (Upstream Binding Factor) dans la régulation de l'activité de l'ARN polymerase I (RPI). UBF lie l'ADN des gènes ribosomiques (ADNr) et forme une structure appelée l'Enhancesome. La phosphorylation par ERK des boîtes HMG1 d'UBF provoque un changement de conformation de l'Enhancesome. La signalisation ERK augmente rapidement la transcription ribosomique, mais ne change pas le nombre de polymerases engagées sur les gènes. La phosphorylation d'UBF par ERK le rend plus permissif au passage de RPI, ce qui en fait un modulateur de l'élongation transcriptionnel dépendant de la signalisation par des facteurs de la croissance. Dans un autre ordre d'idées, la méthylation de l'ADN est associée au silencing épigénétique. Nous avons montré que la perte totale de méthylation CpG suscite une réactivation partielle des gènes ribosomiques silencieux et provoque des défauts prononcés de transcription et de maturation des ARNr. J'ai ensuite démontré que la chromatine est plus accessible qu'à la normale, ce qui permet à l'ARN polymerase II (RPIJ) de se lier et transcrire de façon aberrante sur le locus ribosomique. Je me suis de plus intéressé à TTF-I (Transcription Termination Factor-I), un facteur de transcription régulé par le suppresseur de tumeur ARF et que nous avons observé faire la navette entre le noyau et les gènes ribosomiques. En plus de son interaction avec les gènes ribosomiques, TTF-I est retrouvé aux promoteurs de gènes codants des protéines, bien que sa fonction sur ces gènes reste à déterminer. En outre, j'ai développé un essai d'immunoprecipitation séquentielle de la chromatine des gènes ribosomique afin de disposer d'un outil puissant pour comprendre les différences qui distinguent les gènes actifs et inactifs. Les résultats préliminaires indiquent une absence d'histone et une association d'UBF marquée sur les régions activement transcrites de l'ADNr.

La biogenèse des ribosomes, aussi appelée la synthèse ribosomale, est un processus cellulaire important se déroulant dans le nucléole et implique la transcription par les trois ARN polymérases nucléaires. L’étape initiale et limitante de ce processus est la transcription des ARNs ribosomaux catalytiques, 28S, 18S and 5.8S, sous la forme d’un long précurseur d’ARN ribosomal (pre-ARNr/47S) par l’ARN polymérase I (RPI). RPI possède un ensemble de facteurs de transcription généraux responsables de son activation. Ces facteurs sont la protéine architecturale UBF, le facteur SL1 qui contient TBP, le facteur d’initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l’ARN ribosomale est finement régulée et correspond à 30-50% de l’ensemble de la transcription de la cellule. De plus, ce processus est lié à la croissance cellulaire, la transformation, la prolifération et à l’activité des facteurs suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. UBF et RRN3 sont notamment activés par plusieurs voies de signalisation de croissance cellulaire. Dans les cellules de mammifère, il existe ~200 copies d’ADNr par génome haploïde. Les fragments répétés d’ADN ribosomal sont arrangés en répétition en tandem sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. De façon intéressante, dans les cellules somatiques, seulement la moitié des copies d’ADNr sont actives, alors que les autres sont maintenues dans une forme inactive par les modifications épigénétiques et la formation d’hétérochromatine. La raison pour laquelle le génome contient autant de copies et la régulation de leur activité ne sont pas bien comprises. Cette thèse présente l’analyse de l’importance in vivo d’UBF et de RRN3 pour la régulation de la transcription de l’ARNr et pour le maintien de la structure chromatinienne de l’ADNr. Nous avons précédemment analysé la perte de fonction de UBF dans les fibroblastes embryonnaires de souris en utilisant le système de perte de fonction conditionnelle dépendante du tamoxifène. Puisque l’un de nos objectifs était de comparer la fonction de RRN3 dans un modèle similaire, nous avons réanalysé la perte de fonction de RRN3 chez la souris et généré des lignées cellulaires comme préalablement réalisées avec la perte de fonction d’UBF. Nous avons déterminé que RRN3 est essentiel à la préimplantation et le développement est arrêté à E3.5, ce qui contredit les résultats obtenus par un autre groupe qui avait obtenu un arrêt du développement beaucoup plus tardif, à E9.5. Une lignée de fibroblastes embryonnaires de souris inductible au tamoxifène a été créée pour RRN3 de façon similaire à ce qui avait été fait pour UBF. La perte de fonction d’UBF ou de RRN3 inhibe la transcription par RPI. Par contre, nous démontrons que UBF est responsable du recrutement à l’ADNr des autres facteurs associés à RPI et du maintient de l’état ouvert de la chromatine. En comparaison, RRN3 est requis simplement pour le recrutement de RPI. Dans cette étude, nous avons également identifié une région frontalière en amont de l’ADNr formée de H2A.Z, TTF1, CTCF et des modifications d’histones activatrices. Nous avons également découvert que la perte d’UBF entraine une mort cellulaire synchronisée par apoptose, indépendamment de p53 et ce spécifiquement dans les lignées cellulaires transformées. Ce résultat suggère qu’il pourrait être possible de cibler UBF dans le traitement contre le cancer puisque la perte de UBF dans les lignées cellulaires primaires cause un arrêt de prolifération sans entrainer l’apoptose. Finalement, nous avons observé que le niveau d’activité de l’ADNr dans les cellules pluripotentes est différent que dans les cellules différenciées. Des lignées de cellules souches embryonnaires (ESCs) ont été générées à partir des souris conditionnelles pour UBF et RRN3 et nos résultats préliminaires suggèrent que la totalité des gènes de l’ADNr est active dans les cellules pluripotentes. Ce modèle est idéal pour étudier la régulation de l’ADNr ainsi que le rôle de UBF et RRN3 dans cette régulation après l’induction de la différentiation. En résumé, ces résultats permettront de clarifier le rôle in vivo de UBF et RRN3 dans la transcription de l’ARN ribosomal et dans le maintien de l’intégrité de l’ADNr. / Ribosome biogenesis, or the synthesis of ribosomes, is an important cell process occurring in the nucleolus that utilizes transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step is the transcription of the catalytic ribosomal RNAs 28S, 18S and 5.8S in the form of a precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its activation. These are the architectural factor UBF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 30-50% of total gene transcription. As such, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumour suppressors and oncogenes. Notably, UBF and RRN3 are activated by many of the same growth signaling pathways. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies are active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. The reason for having so many copies and their regulation in vivo by silencing is not yet understood, though it has been connected with genome stability. This thesis presents the analysis of the in vivo requirements for UBF and RRN3 in rRNA transcription and rDNA chromatin structure. We had previously analyzed the loss of UBF in mouse embryonic fibroblasts using tamoxifen-dependent conditional knockout. As we wanted to compare the loss of RRN3 in a similar model, we re-analyzed the RRN3 knockout mice and created cell lines as was performed for the UBF knockout. Importantly, we find that RRN3 is essential for preimplantation and its loss arrests development at E3.5, contrary to previous work that showed a late E9.5 developmental arrest. Using mouse embryonic fibroblast (MEF) cell lines conditional for UBF or RRN3, we found that the loss of either factor prevented RPI transcription. However, we found that UBF was essential for the recruitment of the other RPI transcription factors and the formation of the preinitiation complex, as well as to maintain an open rDNA chromatin structure, while RRN3 was required only for RPI recruitment. These studies allowed us to identify an upstream boundary element on the rDNA formed of H2A.Z, TTF1, CTCF and activating histone marks, which is independent of RPI activity. We also found that UBF loss, but not RRN3 loss, led to a synchronous and massive p53-independent apoptosis, specifically in oncogenically transformed cells. This strongly suggests that drug targeting UBF could be a viable cancer treatment. Finally, we have observed that the rDNA activity status in pluripotent cells differs from that of differentiated cells. Embryonic stem cells (ESCs) were also generated from the mice conditional for UBF and RRN3. Preliminary results indicate that, unlike somatic cells, all the rRNA genes in these and other pluripotent cell lines are potentially active. This makes ESCs and their differentiation an ideal model in which to study the establishment of rDNA silencing and the role of UBF and/or RRN3 in this process. Together these data define the in vivo roles of UBF and RRN3 in ribosomal RNA transcription and suggest mechanisms by which they maintain rDNA integrity and may drive cell differentiation.

Les travaux de ce mémoire portent sur la dynamique d'assemblage, de dissociation et de recyclage des protéines impliquées dans la biogenèse de la grande sous-unité ribosomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ils permettent une meilleure compréhension de deux points de contrôle de cette voie métabolique, l'un dans le noyau, l'autre dans le cytoplasme. <br />Nous avons montré que la protéine nucléaire Nsa2, extrêmement conservée chez les Eucaryotes, est requise pour la maturation correcte de l'intermédiaire d'ARN ribosomique 27SB. Nsa2 est un facteur instable et régulé en fonction de l'activité de la biogenèse des ribosomes ; à ce titre, il pourrait centraliser différents signaux de contrôle de la voie métabolique. Par ailleurs, la technique de SILAC nous a permis de définir des groupes de facteurs pré-ribosomiques précoces ou tardifs par rapport au point d'action de Nsa2.<br />Dans le cytoplasme, nous avons mis en évidence un réseau de protéines marquant la transition entre la fin de la biogenèse de la grande sous-unité et l'initiation de la traduction. La protéine cytoplasmique Rei1 et la karyophérine Kap121 sont requises pour le recyclage du dimère de facteurs navettes Arx1-Alb1, du cytoplasme vers le noyau. Ce recyclage conditionne la dissociation entre le facteur d'anti-association Tif6 et la grande sous-unité ribosomique, qui peut dès lors se lier à la petite sous-unité ribosomique et participer à la traduction.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les communautés du coralligène dominées par des gorgonaires ont été sévèrement affectées par des évènements de mortalités massives liés au réchauffement de la Méditerranée. Pour évaluer la contribution des bactéries associées à l’holobionte Paramuricea clavata à son fonctionnement et sa santé, il est apparu primordial de caractériser le compartiment microbien naturel de ce gorgonaire tempéré.Dans ce contexte, l’objectif général de cette thèse était de décrire les interactions existant entre la gorgone rouge P. clavata et ses bactéries associées en Méditerranée nord-occidentale. Les analyses entreprises par des techniques culture-indépendantes basées sur l’analyse des ADN ribosomiques 16S bactériens ont inclus (i) la caractérisation de la variation spatio-temporelle des communautés bactériennes, (ii) la localisation des bactéries dans les tissus de l’hôte, (iii) l’évaluation de la stabilité des associations gorgones-bactéries en conditions de stress et (iv) la détermination de la spécificité d’hôte des bactéries dominantes entre différentes espèces de gorgonaires sympatriques (Eunicella singularis, Eunicella cavolini et Corallium rubrum). Les résultats obtenus ont établi que P. clavata et son microbiote forment un holobionte au sein duquel hôte et bactéries vivent en étroite association, stable dans le temps et l’espace ou en conditions de stress. Les communautés bactériennes associées sont principalement endosymbiotiques et dominées par un ribotype bactérien appartenant à un genre nouveau de la famille des Hahellaceae qui semble présenter une forte spécificité d’hôte. Ces résultats suggèrent un rôle particulier de ce genre bactérien chez les holobiontes gorgonaires. / Coralligenous communities dominated by gorgonian species have been severely affected by diseases and mass mortality events linked to the current warming trends reported for the Mediterranean Sea. The characterization of the natural microbial compartment of this temperate gorgonian species becomes a crucial step in the evaluation of the bacterial contribution to health and functioning of the Paramuricea clavata holobiont.Under these circumstances, the global aim of this PhD work was to describe the interactions existing between the red gorgonian P. clavata and its associated bacteria in the Northwestern Mediterranean basin. The culture-independent analyses based on the bacterial 16S ribosomal DNA included (i) the characterization of spatiotemporal variation of the bacterial communities, (ii) the localization of the bacteria within host tissues, (iii) the evaluation of the stability of gorgonian-bacterial associations under stress conditions and (iv) the determination of the host-specificity of dominant bacteria in different sympatric gorgonian species (Eunicella singularis, Eunicella cavolini and Corallium rubrum).The results of this study highlighted that P. clavata and its microbiota form a holobiont in which host and bacteria live in close association. This association is spatiotemporally stable and maintained under stress conditions. Associated bacterial communities are mostly endosymbiotic and dominated by a bacterial ribotype belonging to a new genus within the Hahellaceae family that seems to be host-specific. These results suggest a particular role of this bacterial genus in the gorgonian holobionts.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La tribu d'Oleeae (Oleaceae) est un modèle biologique très intéressant pour étudier la diversification et les patterns d'évolution moléculaire chez les plantes. Les reconstitutions de l'histoire évolutive et phylogénétique des relations entre ses espèces ont été au cœur de cette thèse. Ce travail a conduit à des progrès significatifs dans la résolution des relations phylogénétiques au sein de la tribu à différents niveaux taxonomiques. Nous avons démontré que l'utilisation d'une approche de "Genome Skimming" est très appropriée pour générer plastomes complets (ptDNA) et de l'ADN ribosomal nucléaire (nrDNA), même sur un échantillon d'herbier. Nous avons montré l'utilité du ptDNA pour reconstruire la première ossature phylogénétique robuste pour la tribu, et fourni de nouvelles connaissances sur l'histoire biogéographique et sur l'évolution de certains traits. Nous avons aussi montré que l'évolution de la composition en bases du nrDNA peut être influencée par des facteurs climatiques. / The Oleeae tribe (Oleaceae) is a very interesting biological model to investigate plant diversification and molecular evolution patterns. However, a comprehensive phylogeny is missing to accurately describe the evolutionary and biogeographic history of this tribe. Reconstructions the Oleeae evolutionary history and the phylogenetic relationships between its species were the core of this thesis. This work has led to significant progress in resolving the phylogenetic relationships within the tribe at different taxonomic levels. We demonstrated that the use of a shotgun approach is a highly suitable method to generate complete plastomes (ptDNA) and nuclear ribosomal DNA (nrDNA), even on herbarium sample. We showed the usefulness of ptDNA to reconstruct highly resolved phylogeny of Oleeae and provided new insights into the biogeographic history and the evolution of some traits. We also showed that the evolution of nrDNA base-composition seems to be influenced by environmental factors.