Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:19:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Manasses_vFinal_posBanca.pdf: 1881133 bytes, checksum: af2bbe291155bec9db92c52ab52f2f43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:19:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Manasses_vFinal_posBanca.pdf: 1881133 bytes, checksum: af2bbe291155bec9db92c52ab52f2f43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq; FINEP; CAPES / O presente trabalho, pioneiro em abordar especificamente o tema aquaporinas em transcriptomas de cana-de-açúcar, permitiu detectar representantes das quatro subfamílias de aquaporinas descritas em vegetais superiores (PIP, TIP, SIP e NIP), apresentando 43 isoformas distintas, oriundas de quatro bibliotecas SuperSAGE de raízes de genótipos tolerantes e sensíveis à seca. As subfamílias de aquaporinas com maiores níveis de transcritos em cana-de-açúcar foram PIP e TIP. Já as subfamílias SIP e NIP, além de menos abundantes, foram também menos responsivas ao estresse de supressão de rega (24 h). Ao menos 10 potenciais alvos distintos de isoformas de aquaporinas e suas respectivas unitags foram considerados promissores para estudos futuros, com potencial para desenvolvimento de marcadores moleculares para uso no melhoramento genético. Desses, quatro mostraram respostas exclusivas e diferencialmente significativas e divergentes entre os bulks de genótipos tolerantes e sensíveis quando comparado nas condições de estresse e controle. Tomando por base a expressão dessas isoformas nos genótipos tolerantes, a maioria foi reprimida sob estresse (SoPIP2-4, SoPIP2-6, OsPIP2-4), com exceção da SsPIP1-1 (induzida). Foi também proposto um protocolo para validar a expressão das unitags via RTqPCR, bem como pares de primers (5) funcionais como genes de referência, além de dois outros propostos para aquaporinas, tendo-se validado os dados de SuperSAGE para os alvos SsPIP1-1 e SoPIP1-3/PIP1-4, com genótipos pertencentes aos bulks tolerante ou sensível ao estresse.

Wastewater surveillance for SARS-CoV-2 has been demonstrated to be a valuable tool in monitoring community-level virus circulation and assessing new outbreaks. It may become a useful tool in the early detection and response to future pandemics, enabling public health authorities to implement timely interventions and mitigate the spread of infectious diseases with the fecal excretion of their agents. It also offers a chance for cost-effective surveillance. Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) is the most commonly used method for viral RNA detection in wastewater due to its sensitivity, reliability, and widespread availability. However, recent studies have indicated that reverse transcription droplet digital PCR (RTddPCR) has the potential to offer improved sensitivity and accuracy for quantifying SARS-CoV-2 RNA in wastewater samples. In this study, we compared the performance of RTqPCR and RTddPCR approaches for SARS-CoV-2 detection and quantification on wastewater samples collected during the third epidemic wave in Saxony, Germany, characterized by low-incidence infection periods. The determined limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were within the same order of magnitude, and no significant differences were observed between the PCR approaches with respect to the number of positive or quantifiable samples. Our results indicate that both RTqPCR and RTddPCR are highly sensitive methods for detecting SARS-CoV-2. Consequently, the actual gain in sensitivity associated with ddPCR lags behind theoretical expectations. Hence, the choice between the two PCR methods in further environmental surveillance programs is rather a matter of available resources and throughput requirements.

Submitted by TALITA BARBAN BILHASSI null (talitabarban@yahoo.com.br) on 2016-04-26T17:24:25Z No. of bitstreams: 1 TESE TALITA BARBAN BILHASSI.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T18:47:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bilhassi_tb_dr_jabo.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T18:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bilhassi_tb_dr_jabo.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Entre as principais causas de perdas produtivas em bovinos criados nos trópicos está a infestação pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus e, consequentemente, dos hemoparasitas transmitidos por ele. A resistência dos zebuínos e de animais cruzados com raças taurinas à infestação por esse ácaro é amplamente conhecida. Entretanto, no que se refere à suscetibilidade às babesioses bovinas, existem evidências de que o grupo genético também pode interferir na resistência, seguindo o mesmo padrão observado para o carrapato vetor, com os taurinos apresentando maior sensibilidade. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar a parasitemia por Babesia bovis e Babesia bigemina em 50 novilhas da raça Canchim ( Charolês + Zebu) naturalmente infestadas pelo R. (B.) microplus nas quatro estações do ano durante 24 meses, além de caracterizar o perfil de citocinas que podem estar associados ao fenótipo de resistência e suscetibilidade aos hemoparasitas do gênero Babesia spp. Foram realizadas contagens de fêmeas adultas de carrapatos com tamanho igual ou superior a 4,5 mm de diâmetro, presentes no lado esquerdo de cada bovino. As amostras de DNA extraídas foram submetidas à amplificação por meio da Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR), utilizando iniciadores que flanqueiam fragmentos dos genes mitocondriais do citocromo b (mt-cyt B), específicos para B. bovis e B. bigemina. O RNA extraído do sangue, foi usado para sintetizar o DNA complementar (cDNA) para análise de expressão dos genes do IFN- , TNF- , IL-10 e IL-12B por meio da quantificação relativa (RTqPCR). Foram observadas diferenças significativas (P<0,05) entre os meses das avaliações para a contagem de carrapatos. Entretanto, não houve efeito significativo (P>0,05) nas colheitas realizadas entre novembro de 2013 a janeiro de 2014 e entre os meses janeiro e fevereiro de 2015. A frequência da parasitemia no rebanho foi de 98%. Dentre as amostras de DNA que puderam ser quantificadas pela qPCR, 98% e 95,4% foram positivas para B. bovis e B. bigemina, respectivamente. Com relação ao número de cópias (NC) dos fragmentos dos genes mt-cyt B específicos para B. bovis e B. bigemina foram observados efeitos significativos (P<0,05) para ambas as espécies e interação das mesmas com as colheitas realizadas nas diferentes estações do ano. A análise do nível de expressão de mRNA do IFN- , TNF- e IL-12B revelou que houve um efeito siginificativo (P<0,05) da interação entre animais dos extremos de resistência/suscetibilidade e estações do ano, exceto para IL-10. Conclui-se que, a qPCR apresenta alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico das babesioses bovinas em amostras de sangue e que a oscilação na carga parasitária nas diferentes estações do ano pode estar associada com o perfil de expressão de citocinas apresentada. / Among the main causes of production losses in cattle is in the tropics infestation by Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and consequently the hemoparasites transmitted by it. The resistance of zebu and crossbred with European breeds to infestation by this mite is widely known. However, as regards susceptibility to bovine babesiosis, there is evidence that genetic group can also interfere in resistance following the same pattern observed in the tick vector, with the taurine presenting greater sensitivity. This study aimed to evaluate parasitaemia by Babesia bovis and Babesia bigemina in 50 heifers Canchim (⅝ Charolais + ⅜ Zebu) naturally infested by R. (B.) microplus in four seasons for 24 months, and characterize the profile of cytokines that may be associated with phenotype resistance and susceptibility by gender hemoparasites Babesia spp. Adult female ticks counts with size equal to or greater than 4.5 mm in diameter, present in the left side of each calf were performed. The extracted DNA samples were subjected to amplification by Reaction Polymerase Chain Quantitative Real Time (qPCR), using primers flanking fragments of mitochondrial gene cytochrome B (mt-cyt B) specific for B. bovis and B. bigemina. The RNA extracted from the blood was used to synthesize complementary DNA (cDNA) for expression analysis of genes IFN-γ, TNF-α, IL-10 and IL-12B by relative quantification (RT-qPCR). Significant differences were observed (P <0.05) between the months of reviews for the tick count. However, there was no significant effect (P>0.05) in samples taken between november 2013 and january 2014 and between the months january and february 2015. The frequency of parasitaemia in the herd was 98%. Among the samples of DNA that could be quantified by qPCR, 98% and 95.4% were positive for B. bovis and B. bigemina, respectively. Regarding the number of copies (NC) of fragments of genes mt-cyt B, specific to B. bovis and B. bigemina significant effects were observed (P<0.05) for both species and interaction between those harvests in different seasons. Analysis of the mRNA expression level of IFN-γ, TNF-α and IL-12B showed that there was a significant effect (P<0.05) interaction between the animal extreme resistance/susceptibility and seasons, except for IL-10. It is concluded that the qPCR has high sensitivity and specificity for the diagnosis of bovine babesiosis in blood samples and that the fluctuation in the parasitic load in the different seasons of the year may be associated with the profile of cytokine expression presented by herd animals Canchim during the experimental period. / FAPESP: 2013/16246-9

Au cours des dix dernières années, il a été observé une augmentation des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2…) avec des conséquences dramatiques en santé humaine. Un intérêt scientifique a émergé pour mieux comprendre comment les bactéries lactiques (BLs) régulent la l’équilibre énergétique de leur hôte. PPAR- (peroxisome proliferator activated receptor ), un récepteur nucléaire, et FIAF (fasting – induced adipose factor) une adipokine apparaissent comme deux régulateurs centraux dans l’homéostasie énergétique. Dans cette étude, nous avons examiné les mécanismes de régulation de Fiaf par les BLs. Nous avons identifié une souche L.rhamnosus CNCMI–4317 induisant l’expression de Fiaf dans la cellule épithéliale intestinale. Nous avons déterminé que cet effet était probablement du à une protéine de surface agissant de façon indépendante de PPAR-. Nous avons confirmé cet effet dans un model in vivo. De plus, nous avons réalisé une transcription du génome complet des cellules HT-29 en contact avec la bactérie confirmant une régulation de Fiaf et suggérant une régulation supplémentaire dans le métabolisme des lipides.Nous avons caractérisé un model HT-29 PPAR- rapporteur à la luciférase. Nous avons appliqué une approche de métagénomique fonctionnelle développée au sein de l’équipe pour cribler des banques génomiques de bactéries lactiques (BLs). Nous n’avons pas réussi à identifier des clones d’intérêt parmi les banques testées. Nous avons également développé une méthode de criblage des BLs sur le modèle HT-29 PPAR-mais après avoir caractériser l'effet bactérien, nous n’avons pas pu confirmer celui-ci par une approche classique de RT-qPCR. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’effet observé était un effet direct sur le signal luciférase.Ce travail contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation du métabolisme de l’hôte par les bactéries. / Over the last decades, an increase of metabolic diseases (obesity, type-2 diabetes…) has been observed with dramatic consequences on human health. Scientific interest has extended for a better understanding of lactic acid bacteria (LAB) regulation of host energy balance. PPAR- (peroxisome proliferator activated receptor ), a nuclear receptor, and FIAF (fasting – induced adipose factor), a secreted adipokine, appear as two major regulators of energy homeostasis.In this study we examined the mechanisms of Fiaf regulation by LAB. We identified a lactobacillus rhamnosus (L.rhamnosus) CNCMI-4317 strain up-regulating Fiaf expression in intestinal epithelial cells (HT-29). We determined that the effect was probably due to a surface exposed protein acting in a PPAR- independent manner. We confirmed this regulation in an in vivo model. Furthermore, we performed a whole genome transcription (of HT-29 in contact with bacteria) confirming the Fiaf regulation and suggesting an additional lipids metabolism regulation. We characterized a HT-29 PPAR- luciferase reporter model. We applied functional metagenomic approach developed inside the team to screen bacteria genomic libraries. We failed to identify clones of interest among tested libraries. We also performed a screening of LABs on PPAR- luciferase reporter model but after characterization of bacterial effect we failed to confirm it using another approach based on RT-qPCR and speculated that it was a direct effect on luciferase activity. This work contributed to a better knowledge of host metabolism regulation by bacteria.

O câncer de mama é a neoplasia responsável pelo maior número de mortes em mulheres no Brasil, portanto, é importante encontrar novos marcadores específicos e de diagnóstico precoce, utilizando procedimentos simples e rápidos. A via de sinalização Wnt regula importantes funções celulares como proliferação, sobrevida e adesão. Esta via está associada com os processos de iniciação e progressão em muitos tipos tumorais, como câncer de cólon familiar, melanoma e pulmão; sendo que mutações em &beta;-Catenina (CTNNb1) explicam só 30% dos casos de sinalização aberrante encontrada no câncer de mama, indicando que existem outros componentes e/ou reguladores da via que possam estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variantes genéticas e epigenéticas nos genes do complexo de degradação de &beta;-Catenina num grupo de pacientes com câncer de mama e num grupo controle; e determinar os perfis de transcrição dos componentes da via de sinalização Wnt e da molécula de expressão exclusiva do epitélio mamário, a Mamaglobina Humana (MGA), assim como associar estes resultados com as características clínicas, histológicas e patológicas do tumor. Para atingir este objetivo foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 mulheres com câncer de mama e 102 mulheres sadias como grupo controle. A avaliação das variantes rs465899 do gene APC, rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2, rs5030625 do gene CDH1 e rs334558 do gene GSK3, foi realizada por meio de PCR-RFLPs e sequenciamento, a análise dos perfis de metilação dos promotores pela MS-PCR. A RT-qPCR foi usada para determinar os níveis de expressão dos componentes da via e a MGA. As variantes rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2 mostraram uma forte associação com o risco de desenvolver o câncer de mama. Um aumento significativo foi observado no nível de expressão de AXIN2 no grupo de mulheres com câncer de mama. Análises adicionais mostraram perfis de expressão diferencial dos genes APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 e CSNK1A1 associado ao status dos receptores hormonais e histogênese tumoral. MGA foi identificado exclusivamente em 38% dos pacientes com câncer de mama e foi associada com a progressão da doença. Este é o primeiro estudo que relaciona uma variante do gene AXIN2 com o câncer de mama na população brasileira. As variantes avaliadas do gene AXIN2 são marcadores promissores de susceptibilidade ao câncer de mama na população estudada, sendo importante, a avaliação desta variante genética na população e determinar o seu real efeito no processo de iniciação e/ou progressão do câncer de mama. / Background: Wnt/&beta;-catenin signaling pathway is an important regulator of cellular functions such as proliferation, survival and cell adhesion. This pathway is associated with tumor initiation and progression; -catenin (CTNNB1) mutations explains only 30% of aberrant signaling found in breast cancer, indicating that other components and/or regulating of the Wnt/&beta;-catenin pathway may be involved. Objective: The objective of the study was to evaluate the APC rs465899, AXIN2 rs2240308 and rs151279728, CDH1 rs5030625 and GSK3 rs334558 polymorphisms, APC, AXIN2, CDH1 and GSK3 promoter methylation status and expression profile of -Catenin destruction complex genes and MGA in peripheral blood of breast cancer patients. Methods: We collected peripheral blood samples from 102 breast cancer and 102 healthy subjects. The identification of the mutation was performed using PCR-RFLPs and DNA sequencing. MSP and HRM-MS was used to measure promoter methylation and RT-qPCR to determine expression profile. Results: We found significant association of AXIN2 rs2240308 polymorphism with breast cancer. Increased risk was observed even after stratification based on clinicpathological characteristics. AXIN2 rs151279728 polymorphism was found only in 9 breast cancer patients, but none in control group subject. APC and CDH1 polymorphisms were not associated with breast cancer. GSK3 polymorphism was weak associated with breast cancer and heterozygous status was associated with breast cancer protection after group stratification. APC and CDH1 promoter methylation in breast cancer patients was found. Significant increase was observed in AXIN2, CTNNB1 and GSK3 level expression in breast cancer patients. APC was down-regulated in breast cancer patients. Further analyses, showed APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 and CSKN1A1 gene expression associated to receptor status and histological type. MGA was found only in breast cancer patients and was associated with cancer progression. Conclusion: The present study reports, for the first time, that AXIN2 genetic defect and -catenin destruction complex expression disturbance may be found in breast cancer patients, providing additional support to the role of Wnt/-catenin pathway dysfunction in breast cancer tumorigenesis. However, the functional consequence of this genetic alteration remains to be determined. In another hand MGA was determined like a good biomarker for diagnosis and prognosis outcome.

O câncer de mama é a neoplasia responsável pelo maior número de mortes em mulheres no Brasil, portanto, é importante encontrar novos marcadores específicos e de diagnóstico precoce, utilizando procedimentos simples e rápidos. A via de sinalização Wnt regula importantes funções celulares como proliferação, sobrevida e adesão. Esta via está associada com os processos de iniciação e progressão em muitos tipos tumorais, como câncer de cólon familiar, melanoma e pulmão; sendo que mutações em &beta;-Catenina (CTNNb1) explicam só 30% dos casos de sinalização aberrante encontrada no câncer de mama, indicando que existem outros componentes e/ou reguladores da via que possam estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variantes genéticas e epigenéticas nos genes do complexo de degradação de &beta;-Catenina num grupo de pacientes com câncer de mama e num grupo controle; e determinar os perfis de transcrição dos componentes da via de sinalização Wnt e da molécula de expressão exclusiva do epitélio mamário, a Mamaglobina Humana (MGA), assim como associar estes resultados com as características clínicas, histológicas e patológicas do tumor. Para atingir este objetivo foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 mulheres com câncer de mama e 102 mulheres sadias como grupo controle. A avaliação das variantes rs465899 do gene APC, rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2, rs5030625 do gene CDH1 e rs334558 do gene GSK3, foi realizada por meio de PCR-RFLPs e sequenciamento, a análise dos perfis de metilação dos promotores pela MS-PCR. A RT-qPCR foi usada para determinar os níveis de expressão dos componentes da via e a MGA. As variantes rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2 mostraram uma forte associação com o risco de desenvolver o câncer de mama. Um aumento significativo foi observado no nível de expressão de AXIN2 no grupo de mulheres com câncer de mama. Análises adicionais mostraram perfis de expressão diferencial dos genes APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 e CSNK1A1 associado ao status dos receptores hormonais e histogênese tumoral. MGA foi identificado exclusivamente em 38% dos pacientes com câncer de mama e foi associada com a progressão da doença. Este é o primeiro estudo que relaciona uma variante do gene AXIN2 com o câncer de mama na população brasileira. As variantes avaliadas do gene AXIN2 são marcadores promissores de susceptibilidade ao câncer de mama na população estudada, sendo importante, a avaliação desta variante genética na população e determinar o seu real efeito no processo de iniciação e/ou progressão do câncer de mama. / Background: Wnt/&beta;-catenin signaling pathway is an important regulator of cellular functions such as proliferation, survival and cell adhesion. This pathway is associated with tumor initiation and progression; -catenin (CTNNB1) mutations explains only 30% of aberrant signaling found in breast cancer, indicating that other components and/or regulating of the Wnt/&beta;-catenin pathway may be involved. Objective: The objective of the study was to evaluate the APC rs465899, AXIN2 rs2240308 and rs151279728, CDH1 rs5030625 and GSK3 rs334558 polymorphisms, APC, AXIN2, CDH1 and GSK3 promoter methylation status and expression profile of -Catenin destruction complex genes and MGA in peripheral blood of breast cancer patients. Methods: We collected peripheral blood samples from 102 breast cancer and 102 healthy subjects. The identification of the mutation was performed using PCR-RFLPs and DNA sequencing. MSP and HRM-MS was used to measure promoter methylation and RT-qPCR to determine expression profile. Results: We found significant association of AXIN2 rs2240308 polymorphism with breast cancer. Increased risk was observed even after stratification based on clinicpathological characteristics. AXIN2 rs151279728 polymorphism was found only in 9 breast cancer patients, but none in control group subject. APC and CDH1 polymorphisms were not associated with breast cancer. GSK3 polymorphism was weak associated with breast cancer and heterozygous status was associated with breast cancer protection after group stratification. APC and CDH1 promoter methylation in breast cancer patients was found. Significant increase was observed in AXIN2, CTNNB1 and GSK3 level expression in breast cancer patients. APC was down-regulated in breast cancer patients. Further analyses, showed APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 and CSKN1A1 gene expression associated to receptor status and histological type. MGA was found only in breast cancer patients and was associated with cancer progression. Conclusion: The present study reports, for the first time, that AXIN2 genetic defect and -catenin destruction complex expression disturbance may be found in breast cancer patients, providing additional support to the role of Wnt/-catenin pathway dysfunction in breast cancer tumorigenesis. However, the functional consequence of this genetic alteration remains to be determined. In another hand MGA was determined like a good biomarker for diagnosis and prognosis outcome.

O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 &#181;M auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 &#181;M NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 &#181;M auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 &#181;M NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.