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La déficience intellectuelle : du diagnostic en puces ADN à l'identification de gènes candidats / Intellectual disability : from microarray diagnosis to the identification of candidate genesKeren, Boris 22 November 2013 (has links)
L'analyse chromosomique sur puce ADN (ACPA) tend à devenir le principal examen diagnostique dans la déficience intellectuelle (DI). Parmi les techniques d'ACPA, les puces SNP ont l'intérêt de pouvoir détecter les pertes d'hétérozygotie, et par conséquent d’identifier les isodisomies uniparentales (iUPD) et les zones d'identité liées à la consanguinité. Nous avons étudié une cohorte de 1 187 patients atteints de DI, dans un cadre diagnostique, sur puces SNP. Nous avons réalisé, par cette étude, 145 diagnostics (12%) dont 2 iUPD et 6 délétions n'incluant qu'un seul gène. De plus, nous avons détecté 639 CNV rares non décrits chez des sujets contrôles et incluant des séquences codantes, ce qui nous a permis d'identifier 11 gènes candidats dans la DI : CAMTA1, SP3, CNTNAP4, NUDT12, STXBP6, DOCK8, DOCK10, SMARCA2, NYAP2, ATAD3A et ATAD3B. Nous avons tenté de valider l'implication de ces gènes par séquençage, mais n'avons trouvé de seconde mutation pour aucun d'entre eux. Toutefois, des réarrangements de CAMTA1 ont été retrouvés dans 2 autres familles avec un phénotype homogène (DI et ataxie congénitale) ce qui nous a permis d’affirmer qu'il s'agit d'un gène de DI. Par ailleurs, l'homozygosity mapping, réalisé avec puces SNP, a identifié, par séquençage whole exome, une mutation non-sens homozygote du gène BUD13 dans une famille de DI syndromique. Enfin, de façon fortuite, nous avons caractérisé en ACPA une translocation familiale entraînant une disruption d'un gène d'ataxie spino-cérébelleuse, ATXN10, ce qui a permis de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie. Au total, notre étude démontre l'intérêt des puces SNP dans la DI, d'une part en diagnostic et d'autre part pour l'identification de nouveaux gènes responsables de DI. / Chromosomal Microarray Analysis (CMA) has become the main diagnostic test in the field of intellectual disability (ID). Among CMA techniques, SNP arrays have the advantage of identifying losses of heterozygosity in addition to Copy Number Variants (CNVs). Therefore they can detect uniparental isodisomies (iUPD) and regions of identity by descent. We screened a cohort of 1,187 patients with ID, in diagnostic setting, by CMA using SNP arrays. Causal abnormalities, including 2 iUPDs and 6 deletions comprising only one gene, were detected in 145 patients (12%). Moreover we found 639 rare CNVs, absent from control individuals, which included coding sequences. Our results allowed us to identify 11 genes possibly involved in or contributing to ID: CAMTA1, SP3, CNTNAP4, NUDT12, STXBP6, DOCK8, DOCK10, SMARCA2, NYAP2, ATAD3A and ATAD3B. We then screened additional patients with similar phenotypes in order to find a second mutation, but no second mutation was identified in any of them. Besides, CAMTA1 rearrangements were also found among two other families with homogeneous phenotypes (ID and congenital ataxia), which confirms that this gene is involved in ID. Furthermore, thanks to homozygosity mapping made possible by SNP arrays combined with exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in the BUD13 gene, in a family with syndromic ID. Finally we incidentally characterized a familial translocation resulting in the disruption of ATXN10, a gene responsible for spinocerebellar ataxia. This translocation has helped to better understand the pathophysiology of the disease. Overall, our study shows the importance of SNP arrays for the molecular diagnosis of ID and as a tool to identify genes responsible for ID.
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Analyse du séquençage de l’exome basée sur le phénotype pour le diagnostic moléculaire des syndromes polymalformatifs / Phenotype-based analysis of exome sequencing for the molecular diagnosis of polymalformative syndromesThuriot, Fanny January 2017 (has links)
Bien que l’hétérogénéité des désordres génétiques nous limite dans l’identification du gène causal avec les approches diagnostiques conventionnelles, le séquençage de l’exome a permis d’accroitre le nombre de diagnostics moléculaires posés récemment. Par contre, le grand nombre de variants identifiés par cette méthode pose un défi significatif dans l’interprétation clinique de ses variants. Nous avons donc élaboré PhenoVar, un logiciel qui intègre les données phénotypiques et génotypiques pour retourner une courte liste de diagnostics potentiels. Nous voulons valider cette approche par phénotype au niveau clinique et montrer qu’elle peut être efficace pour diagnostiquer des patients atteints de maladies génétiques rares. Pour ce faire, le séquençage de l’exome a été effectué sur une cohorte de 51 patients. Ceux-ci présentent des dysmorphismes avec ou sans désordres neurodéveloppementaux dont l’étiologie reste indéterminée après plusieurs analyses conventionnelles. Suite au séquençage de l’exome, un pipeline d’analyse bio-informatique nous a permis de filtrer les variations pour garder seulement les variations rares, codantes, ayant une bonne qualité et pour éliminer les artéfacts de séquençage. Ensuite, pour analyser ces variations filtrées, une analyse manuelle et une analyse avec PhenoVar ont été faites. L’analyse manuelle consiste à regarder manuellement chaque variation pour voir son impact et identifier le diagnostic, sans regarder le phénotype du patient. Puis, Exomiser, un autre logiciel utilisant le phénotype, a été utilisé pour comparer les performances de PhenoVar. En comparaison avec l’analyse manuelle, PhenoVar nous a permis de diminuer de six fois le temps d’analyse et de diminuer de moitié le nombre de diagnostics potentiels. Avec ces deux méthodes, nous avons pu trouver le diagnostic moléculaire de 18 patients, soit un rendement diagnostic de 35%. Il est à noter qu’un diagnostic a été manqué par PhenoVar. Cependant, ce diagnostic a été récupéré en enlevant un filtre au niveau du phénotype. De plus, parmi les diagnostics effectués, 16 (89%) se retrouvent dans les dix premiers rangs de PhenoVar, tandis que seulement 10 (56%) se retrouvent dans les dix premiers rangs d’Exomiser. En conclusion, PhenoVar est supérieur à Exomiser pour trouver un diagnostic dans les dix premiers rangs. De plus, il se compare à l’analyse manuelle tout en diminuant le temps d’analyse et le nombre de variants. / Abstract: Although the heterogeneity of genetic disorders limits our capacity to identify the causal gene with conventional approaches, exome sequencing has increased the diagnostic yield. However, the large number of variants identified by this method poses a significant challenge in their clinical interpretation. Thus, we developed PhenoVar: a software that integrates phenotypic and genotypic data and produces a short list of potential diagnoses. The objective of this study is to validate this phenotype-based approach on a clinical level and show that it can be efficient to diagnose patients with rare genetic disorders. Exome sequencing was performed on a cohort of 51 patients. These presented with dysmorphic features with or without neurodevelopmental disorders of undetermined etiology, following conventional analysis. Following exome sequencing, a bioinformatics pipeline allowed us to filter variations, keeping only rare coding variations harboring high quality. Then, we analysed these filtered variations with both manual analysis and PhenoVar. In the manual analysis each variant was manually examined to determine its impact and to identify the diagnosis without taking the patient’s phenotype into consideration. Then, Exomiser, another phenotype-based tool, was used to compare PhenoVar’s performances. In comparison to the manual analysis, PhenoVar has allowed us to reduce the analysis time by six-fold and to reduce by half the number of potential diagnoses. With both methods, we found the molecular diagnosis in 18 patients; a rate of 35%. Moreover, among these diagnoses, 16 (89%) are found in the top 10 ranks of PhenoVar, compared to only 10 (56%) for Exomiser. In conclusion, PhenoVar proved to Exomiser in prioritizing the correct diagnosis in the top 10 ranks. Finally, diagnostic yield of PhenoVar is comparable to the manual analysis while reducing the analysis time and the number of variants.
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Description et comportement des communautés bactériennes de la viande de poulet conservée sous atmosphère protectrice / Description and behavior of bacterial communities of chicken meat samples stored under modified atmosphere packagingRouger, Amélie 27 June 2017 (has links)
Contrôler les bactéries altérantes des aliments, notamment les produits carnés crus, est un enjeu majeur pour les industries agroalimentaires. Les conditions de stockage de la viande sous différentes atmosphères exercent une pression de sélection et modifient le comportement et le développement des communautés bactériennes initialement présentes. Des méthodes de séquençage à haut débit, utilisées pour caractériser différents écosystèmes microbiens, ont été appliquées pour étudier la dynamique des communautés bactériennes de la viande de poulet au cours du stockage.Nous avons développé une méthode pour constituer des écosystèmes microbiens standards dont la composition a été déterminée par pyroséquençage du gène de l’ARNr 16S. La présence de Brochothrix thermosphacta et de Pseudomonas parmi les espèces dominantes a été confirmée et nous avons mis en évidence que Shewanella et Carnobacterium étaient sous dominantes. Nous avons sélectionné deux écosystèmes pour effectuer des challenges tests reproductibles sur de la viande de poulet conservée sous 3 atmosphères couramment utilisées. Une analyse métatranscriptomique et métagénomique a été réalisée afin de savoir “Quelles bactéries étaient présentes ?”, “Qu’étaient-elles capables de faire?” et “Qu’exprimaient-elles?” suivant les conditions.Nous avons ainsi pu évaluer l’impact des mélanges gazeux sur la dynamique bactérienne et les fonctions exprimées par les bactéries suivant les contaminants initiaux. Cela nous donne des pistes pour fournir des indications afin d’optimiser la conservation de la viande en contrôlant les écosystèmes microbiens / Controlling spoilage microorganisms, especially in raw meat products, is challenging for the food industry.Storage conditions such as modified atmosphere packaging (MAP) have selective effects on the microbiota dynamics. Thanks to the recent developmentof next generation sequencing methods widely used for characterizing microbes in different ecosystems, we studied bacterial community dynamics during chickenmeat storage.We developed a method to constitute a standard meat microbial ecosystem hosting known bacterial species previously described by 16S rRNA sequencing. Our results confirmed the presence of Brochothrix thermosphacta and Pseudomonas and we also showed the presence of subdominant species as Shewanella and Carnobacterium. We selected 2 bacterial communities enabling reproducible challenge tests on meat during 9 days of storage at 4°C under 3 different atmospheres currently used in the industry.Metatranscriptomic and metagenomic analyses were performed to know “Who is there?”, “What can they do?” and “What are they expressing?” depending on the gaseous mixtures and on the initial microbiota.Consequently, we could evaluate the impact of storage atmosphere on the microbiotas dynamics and on the functions the bacteria expressed, depending on the storage condition and on the nature of the bacterial communities present. This led to indications of optimized storage conditions of poultry meat by managing their ecosystems.
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Analyse de l’expression génique des macrophages bovins face à la maladie de Johne et leur réponse à l’infection in vitro par Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosisAriel, Olivier January 2017 (has links)
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) est l’agent pathogène responsable de la maladie de Johne qui est aussi connue sous le nom de paratuberculose. Cette maladie affecte principalement les ruminants, mais également d’autres animaux d’élevages et sauvages. Les mécanismes de pathogenèse de la paratuberculose sont toujours peu compris, mais il est connu que MAP est capable de s’évader du système immunitaire de son hôte pendant plusieurs années en utilisant les macrophages comme réservoir principal. L’effet de MAP dans l’infection des macrophages est souvent étudié en utilisant des vaches saines ou encore infectées de façon expérimentale, mais les études sur l’effet à long terme de la paratuberculose en étudiant les macrophages de vaches atteintes sont manquantes. Dans mon projet, le transcriptome de macrophages primaires dérivés des monocytes circulants infectés in vitro par MAP a été analysé par séquençage haut débit de l’ARN (RNA-seq).
Des différences importantes dans les interactions hôtes-pathogènes ont été observées dans les signatures d’expression génique des vaches diagnostiquées comme négatives ou positives. Ces modifications mettent en lumière la mise en place de processus durables dans l’établissement de la paratuberculose. Les modifications clés observées lors de mon projet sont un débalancement immunométabolique, un changement dans l’homéostasie du cholestérol et des lipides intracellulaires, ainsi qu’un patron d’expression génique associé à l’établissement d’une tolérance mémoire chez les macrophages. En effet, les résultats obtenus lors de ce projet consolident l’hypothèse selon laquelle MAP pourrait induire un état de type tolérance dans les monocytes sanguins périphériques circulants lorsqu’ils se différencient en macrophages. De ce fait, MAP pourrait promouvoir davantage la persistance de la maladie en influençant le comportement des macrophages à long terme. Cette étude contribue à une meilleure compréhension du contrôle de MAP sur les cellules immunitaires et de ses mécanismes de survie.
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Étude des formes monogéniques de diabète de type 2 et d’obésité par le séquençage de nouvelle génération / Genetic causes of monogenic forms of diabetes and obesityPhilippe, Julien 19 December 2014 (has links)
Le diabète et l’obésité ont atteint de telles proportions dans le monde qu’on parle de pandémie. Les enjeux médicaux et financiers font de ces deux maladies un problème majeur de santé publique. Deux groupes de facteurs contribuent à ces deux maladies : l’environnement, et la génétique sur laquelle cette thèse s’appuie. Ce travail s’est focalisé sur les formes rares et monogéniques qui constituent les formes extrêmes de diabète de type 2 et d’obésité.Ces formes sont loin d’être totalement élucidées. Mon projet s’est concentré sur l’utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS) pour identifier de manière plus optimale, par rapport au séquençage classique de type Sanger, des mutations dans des gènes déjà connus chez de nouveaux patients introduits dans notre cohorte dans une optique de diagnostic. Le deuxième objectif était d’utiliser les techniques de NGS pour découvrir de nouveaux loci, liés à de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la physiopathologie du diabète et de l’obésité.La première approche utilise une technique d’enrichissement par hybridation en phase liquide et se focalise sur 34 gènes associés à des formes monogéniques et polygéniques d’obésité. Le criblage a été réalisé sur 201 individus dans 13 familles dont la cause d’obésité est inconnue. Cette approche a mené à l’identification d’une mutation dans un gène connu de l’obésité : PCSK1. Cette mutation est causale, car elle conduit à un codon-stop au début de la protéine et n’est présente que chez des individus obèses. De plus, l’étude fonctionnelle a démontré une inhibition partielle de PC1/3 par la protéine tronquée et un possible impact sur la maturation et la sécrétion de l’enzyme.La deuxième approche se base sur une technique d’amplification par PCR dans des microgouttelettes lipidiques développée par la société Raindance, dont le premier test vise à réidentifier les mutations causales du diabète et/ou de l’obésité chez 40 patients. Cette approche a donné des résultats satisfaisants, car pour une large majorité de patients, les mutations causales ont pu être à nouveau identifiées. Seul un patient n’a pu être reconfirmé à cause des outils bioinformatiques actuels qui restent limités dans la détection des indels complexes. Parmi les 39 patients identifiés, 3 d’entre eux sont potentiellement porteurs de plusieurs mutations causales. Cette technique pourrait être envisagée dans le domaine clinique, car elle permet une approche multigénique en fournissant un diagnostic rapide, moins couteux et qualitativement aussi bon que le séquençage Sanger.La troisième approche met en jeu le séquençage de l’exome entier (WES) chez 4 individus où la famille entière s’est précédemment révélée négative pour tous les gènes connus du diabète. Cette approche a permis la découverte d’un 13e gène du MODY, KCNJ11, et confirme le large spectre phénotypique qui va du diabète néonatal au MODY selon les mutations. La difficulté majeure de cette technique est le filtrage des variants en vue d’aboutir à une seule mutation causale (ou éventuellement plusieurs sur un même gène) pour identifier de nouveaux gènes du MODY. La stratégie utilisée combinait à la fois un filtrage bioinformatique, avec par exemple des filtres sur la coségrégation familiale et sur des bases de SNPs référencés, et un filtrage biologique, avec l’utilisation d’une technique de génotypage haut débit. En conclusion, ce travail a permis de tirer parti des avancées technologiques comme la capture, le séquençage ciblé de masse et le NGS pour élucider et améliorer le criblage des formes monogéniques de diabète et d’obésité. Cette amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires conduira peut-être au développement de meilleurs traitements comme la médecine personnalisée. On espère voir des améliorations directes pour le patient dans un futur proche, par exemple un diagnostic moléculaire plus rapide, plus sûr et plus exhaustif. / Diabetes and obesity have reached such proportions worldwide we are talking about pandemic. Both diseases are a major cause of mortality and multiple complications. Medical and financial issues are for both diseases a major public health problem. Two groups of factors contribute to these two diseases: environment, and genetics on which this thesis is based. This work focused on rare and monogenic forms which are extreme forms of type 2 diabetes and obesity.These forms are far from being fully understood. My project focused on the use of next generation sequencing (NGS) to identify more optimally, compared to conventional Sanger sequencing, mutations in already known genes among new patients in our cohort for diagnostic purposes. The second objective was to use NGS to discover new loci associated with new signaling pathways involved in the pathophysiology of diabetes and obesity.The first approach uses a liquid-phase hybridization technique and focuses on 34 genes associated with monogenic and/or polygenic obesity. The screening was carried out on 201 people in 13 families for which the cause of obesity is unknown. This approach led to the identification of a mutation in a known gene of obesity: PCSK1. This mutation is causal because it leads to a stop codon at the beginning of the protein and is present only in obese individuals. Additionally, functional studies have demonstrated partial inhibition of PC1/3 by the truncated protein and the possible impact on the processing and secretion of this enzyme. This study has been published published in the "International Journal of Obesity" newspaper.The second approach is based on a PCR amplification technique in lipid microdroplets developed by Raindance. The first test is to re-identify the causal mutations of diabetes and/or obesity in 40 patients. This approach has yielded satisfactory results because for a large majority of patients, the causative mutations have been identified again. Only one patient was unable to be reconfirmed because current bioinformatics tools are limited in the detection of complex indels. Of the 39 patients identified, 3 of them are potential carriers of several causative mutations. This technique could be considered in the clinical field because it allows a multigene approach by providing a rapid diagnosis, cheaper and with a quality similar to the gold standard Sanger sequencing. For us, the purpose of this technique is a fast and optimal clinical diagnosis in order to identify unsolved cases, which are candidates for exome sequencing. This second study was published in "Diabetes Care" journal.The third approach involves whole exome sequencing (WES) in 4 individuals where the whole family was previously tested negative for all known genes of diabetes. This approach led to the discovery of a thirteen MODY gene, KCNJ11, and confirms the broad phenotypic spectrum that goes from neonatal diabetes to MODY depending on the mutations. The major difficulty with this technique is filtering variants in order to get a single causal mutation (or possibly several on the same gene) to identify new MODY genes. The strategy we used combined both a bioinformatics filter for example with filters on family cosegregation and on SNP databases and a biological filter, with the use of a technique for high-throughput genotyping. This pioneering study in the use of NGS to identify new genes of MODY has been published in "PLoS ONE".In conclusion, this work took advantage of technological advances such as capture, targeted sequencing and NGS to elucidate and to improve the screening of monogenic forms of diabetes and obesity. This improved understanding of the molecular mechanisms may lead to the development of better treatments like personalized medicine. We hope to see direct improvements for patients in the near future, such as a more accurate, faster and more comprehensive molecular
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Etude quantitative des variations structurelles des chromosomes chez Saccharomyces cerevisiae / Quantitative study of structural variations of chromosomes in saccharomyces cerevisiaeGillet-Markowska, Alexandre 21 September 2015 (has links)
L’accumulation de remaniements de la structure des chromosomes aussi appelés variations structurelles (SV) est un important contributeur à la transformation des cellules malignes et à la constitution d’une hétérogénéité intratumorale. Nous avons développé un outil bio-informatique qui permet désormais d’obtenir une image fine de ces SV qui se produisent dans le génome humain. Nous avons ainsi pu démontrer l’existence de SV présentes à de faibles fréquences dans différentes populations cellulaires supposées clonales montrant que les taux de formation des SV pourraient être grandement sous-estimés. Parallèlement, nous avons montré que le niveau d’instabilité des individus dépend de facteurs génétiques de prédisposition. Pour les identifier, nous avons développé des systèmes génétiques de mesure des taux de SV chez la levure qui vont nous permettre d'identifier les gènes contrôlant l'instabilité chromosomique par analyse de liaison à grande échelle. Ces régulateurs représenteront de nouveaux gènes candidats impliqués dans le développement du cancer chez l’homme, car les déterminants génétiques impliqués dans le métabolisme de l'ADN sont très conservés entre la levure et les mammifères. / The accumulation of chromosomal rearrangements also called Structural Variations (SV) is a major contributor to the transformation of tumoral cells and to the constitution of intratumoral heterogeneity. We have developed a bio-informatic tool that can now provide a sharp image of SV that occur in the human genome. We have demonstrated the existence of SV present in low proportions in different supposedly clonal cell populations showing that the rates of SV formation could be greatly underestimated. In parallel, we have shown that the level of instability of the genome depends on predisposition factors. To identify those, we have developed genetic assays to measure the rate of SV in yeast that will allow us to identify new genes controlling the stability of the genome using large scale linkage analysis. These regulators represent new gene-candidates involved in the development of cancer in human as the determinants involved in DNA metabolism are very conserved between yeast and mammals.
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Résistance de Mycobacterium tuberculosis aux fluoroquinolones : histoire naturelle et diagnostic de la résistance / Mycobacterium tuberculosis fluoroquinolone resistance : natural history and diagnosis of resistanceBernard, Christine 10 October 2016 (has links)
La résistance aux fluoroquinolones (FQ) est le principal facteur d'aggravation du pronostic de la tuberculose multi-résistante. Il apparait donc essentiel de mieux comprendre le développement de la résistance aux FQ afin d'améliorer les outils permettant une détection précoce de cette résistance. Nous avons (i) évalué les performances du séquençage des gènes gyrA et gyrB dans la détection de la résistance aux FQ grâce à une étude prospective menée au CNR-MyRMA ; (ii) étudié l'histoire naturelle de l'émergence de la résistance aux FQ in vivo dans un modèle murin de tuberculose et (iii) identifié de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ par génomique comparative. Nous avons montré que la méthode des proportions, désignée comme méthode de référence, n'est pas performante pour la détection des bas niveaux de résistance aux FQ et que ni les méthodes génotypiques ni les méthodes phénotypiques, ne permettent le diagnostic de la résistance hétérogène aux FQ. Une stratégie combinée reposant sur une détection phénotypique d'une proportion anormale de bactéries résistantes et une caractérisation génotypique de ces bactéries résistantes permettrait d'améliorer la détection de cette résistance hétérogène. Nous avons identifié des pistes pour de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ. Il pourrait s'agir de mécanismes responsables d'une résistance de bas niveau facilitant la sélection d'une résistance de haut niveau due à une mutation dans les gènes codant l'ADN gyrase dans un deuxième temps. Cependant, leur implication dans la résistance aux FQ, ainsi que notre hypothèse quant au processus de sélection, reste à démontrer. / Fluoroquinolone (FQ) resistance is the main factor of worsened prognosis of multidrug resistant tuberculosis. Therefore to better understand the development of FQ resistance is essential in order to improve the tools for early detection of this resistance. We have (i) evaluated the performance of gyrA and gyrB sequencing in the detection of FQ resistance through a prospective study; (ii) studied the natural history of the emergence of FQ resistance in vivo using a murine model of tuberculosis; and (iii) identified tracks for new mechanisms of resistance to FQ by comparative genomics. We showed that the proportion method, designated as the reference method, is not effective in detecting low levels of FQ resistance and that, neither genotypic methods nor phenotypic methods, allow the diagnosis of FQ heterogeneous resistance. A combined strategy based on phenotypic detection of an abnormal proportion of resistant bacteria and genotypic characterization of these resistant bacteria would improve the detection of this heterogeneous resistance. We have identified hypotheses for new FQ resistance mechanisms. These new mechanisms could be responsible of a low-level resistance facilitating the selection of a high-level resistance due to mutations in genes encoding DNA gyrase in a second time. However, their involvement in FQ resistance and our assumption about the selection process remain to be demonstrated.
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Rôle du facteur de transcription EGR1 dans le contrôle de l' autorenouvellement des cellules souches de glioblastomes / Role of EGR1 transcription factor in the control of self-renewal of glioblastoma initiating cellsSakakini, Nathalie 02 December 2014 (has links)
Le glioblastome est la tumeur cérébrale de mauvais pronostic la plus fréquente et la plus agressive. Les traitements actuels combinent la chirurgie à la radio thérapie et la chimiothérapie. Cependant ces traitements sont peu efficaces. Le taux de récidive est élevé et la survie moyenne est de 15 mois.La récidive s'explique en partie par la présence de cellules initiatrices de glioblastomes (CIG). Ces cellules possèdent des propriétés de cellules souches adultes. Elles s'auto-renouvellent en maintenant un pool de cellules tumorales et se différencient en différents types cellulaires. Elles sont aussi résistantes aux thérapies par l'activation de mécanismes d'élimination des molécules destinées à les détruire. L'engagement des CIGs vers un état tumoral différencié diminue fortement leur potentiel tumorigénique les rendant plus vulnérables.Le facteur de transcription EGR1 est impliqué dans des processus biologiques comme la prolifération et la différenciation. Dans les CIG l'expression d'EGR1 est anormalement élevée. Ce niveau diminue lorsque les cellules se différencient. L'expression d'EGR1 est donc corrélée avec un état souche suggérant sa contribution dans la régulation de la prolifération des CIG ou dans le maintien de cet état.Mon objectif est de caractériser le rôle d'EGR1 dans la régulation de l'état proliférant des CIG.Nous avons démontré l'implication d'EGR1 dans une cascade de régulation impliquant le mir18a* et les gènes SHH et GLI1. Il contribue ainsi à l'autorenouvellement, à la prolifération et au maintien de l'état souche des CiGs. De plus en régulant directement le gène PDGFa, EGR1 entretient ce système régulatoire par une deuxième boucle moléculaire. / Glioblastoma is the most commun and agressive cerebral tumor. The current treatments combine surgery with chemotherapy and radiotherapy. However these treatments are poor effective. The relapse is frequent and the rate survival is less than 18 months.The relapse is in part due to the presence of glioblastoma initiating cells (GIC). The cells have stem cell properties. They can self-renew to maintain a pool of tumor cells and they can differentiate in different kind of tumor cells. They are also able to resist to the therapies by activating mechanisms of drug efflux. The commitment of GIC toward a differentiated tumor state decreases strongly their tumorigenic potential.EGR1 transcription factor is involved in many biological processes such as proliferation and differentiation. In the GIC EGR1 expression is abnormally elevated. This level decreases when cells are differentiated. EGR1 expression is strongly correlated with stem state suggesting its contribution in the proliferation regulation of GIC or in the maintenance of this state.My aim is to characterize the role of EGR1 in the regulation of proliferating state of the GIC.We have demonstrated the involvement of EGR1 in the pathway involving the mir18a* and the genes SHH and GLI1. It contributes so to the self-renewal, to the proliferation and to the maintenance of the stem state of GIC. In addition by directly regulating the gene PDGFa EGR1 maintains this system by a second molecular loop.
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Recherche de mutations induisant des résistances aux antiviraux chez des patients atteints du virus de l'immunodéficience humaine de type 1, du virus de l'hépatite B et de l'hépatite C / Research of mutations inducing antiviral drugs resistance in patients infected with the Human Immunodeficiency type 1 virus, Hepatitis C and Hepatitis B virusMohamed, Sofiane 20 January 2015 (has links)
Les tests de laboratoire basés sur des techniques de biologie moléculaire sont des outils inestimables pour le suivi des patients, en particulier dans le cadre de l’infectiologie. Dans ce contexte clinique, ils peuvent permettre d’établir un diagnostic, un pronostic ainsi que de déterminer la stratégie thérapeutique antivirale la plus adaptée. Les virus hautement variables tel que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), de l’hépatite B (VHB) et de l’hépatite C (VHC) sont présents sous forme de quasi-espèces au sein de leur environnement réplicatif. Lorsque des pressions de sélection s’exercent telle que l’administration d’un antiviral, une redistribution des variants majoritaires est fréquemment observée en variants mutés pour mieux s’adapter à cet environnement. Nos travaux ont permis, dans ce contexte, de valider l’impact clinique des mutations majoritaires mais aussi minoritaires grâce à la mise en œuvre de plusieurs techniques de séquençage (pyroséquençage, séquençage à haut débit et PCR en allèle spécifique). Nous avons également validé l’utilisation d’un logiciel simple, fiable et utilisable en routine par le clinicien pour l’interprétation clinique de la masse de données générées par le séquençage à haut débit. Enfin dans le contexte du test diagnostique, nous avons cliniquement validé sur une cohorte de patients infectés par le VHB, l’utilisation du papier buvard (Dried Blood Spot) comme support de prélèvement alternatif non invasif de diagnostic, en particulier pour les populations n’ayant pas accès aux structures classiques de soins et pour les pays en voie de développement. / Molecular biology based assays are invaluable tools for the patients follow-up. They can help to establish the prognosis, guide for the treatment decisions and assess the virological response to therapy. Highly variable viruses like Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B Virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV) which have a quasispecies distribution. Selection pressure on viral replicative environment such as an antiviral drug treatment, generally lead to a redistribution of the viral quasispecies with an increasing of the best adapted viral mutant. Our work allowed in this context to validate the clinical impact of majority but also minority mutations through the implementation of several sequencing techniques (pyrosequencing, high-throughput sequencing and allele-specific PCR). We also validated the use of a simple, reliable and routinely software solution by clinician for clinical interpretation of the mass of data generated by high-throughput sequencing. Finally, in the context of the diagnostic testing, we clinically validated in a cohort of patients infected with HBV, use the Dried Blood Spot technique as a supporting noninvasive diagnostic alternative sampling, especially for populations that have no access to conventional health structures and developing countries.
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Génotypage des papillomavirus humains par séquençage haut-débit : conséquences dans le dépistage du cancer du col de l’utérus et apport conceptuel au virome cutané / HPV genotyping by high-throughput sequencing : consequences in cervical cancer screening and conceptual contribution to human skin viromeMolet, Lucie 18 May 2018 (has links)
Les papillomavirus humains (HPV) sont classés en 5 genres α, β, γ, µ et η. Leur génome comprend six gènes précoces dont deux oncogènes E6 et E7 et deux gènes tardifs codant les protéines de capside. Les β- et γ-HPV constituent une part importante du virome cutané. Généralement asymptomatiques ils peuvent se manifester par des papillomatoses et sont associés à certains cancers de la peau, en particulier chez l’immunodéprimé. Les α-HPV ont un tropisme muqueux ; les α-HPV à haut risque (HR) HPV16 et 18 sont impliqués dans 99% des cancers du col de l’utérus.La détection des α-HR-HPV dans les frottis cervico-utérins (FCU) lors d’atypie cellulaire de signification indéterminée (ASCUS) constitue une information décisive dans le dépistage du cancer du col de l’utérus, bien que les tests de génotypage ne ciblent que les types les plus fréquents. Le génotypage des β- et γ-HPV devient nécessaire pour l’étude du virome notamment dans des contextes de susceptibilité aux pathogénies HPV (syndrome WHIM : Warts, Hypogammaglobulimemia, Infections and Myelokathexis). Cet immunodéficit congénital rare causé par une mutation gain de fonction du récepteur CXCR4 se manifeste dans 70% des cas par des papillomatoses cutanées étendues et ano-génitales évoluant souvent en cancer. Des études du laboratoire ont identifié le rôle intrinsèque de l’axe CXCL12/CXCR4 dérégulé dans la pathogénie virale en démontrant notamment l’action bénéfique du blocage de cet axe par un antagoniste de CXCR4 (AMD3100) in vitro et in vivo sur l’oncogenèse due à HPV.Nos objectifs étaient : (i) d’identifier dans des FCU ASCUS, les HPV dont le génotype n’avait pu être déterminé (HPV-X) par un test classique (INNO-LiPA HPV Genotyping Extra II®), (ii) de caractériser le virome HPV d’un patient atteint de WHIM au cours d’un essai thérapeutique par AMD3100 administré à titre compassionnel pendant 7 mois avec pour objectif d’évaluer son impact sur les anomalies associées à HPV.Dans les deux cas, nous avons mis au point une méthode de génotypage par séquençage haut débit sur Illumina Miseq®. La distribution des génotypes et leur polymorphisme nucléotidique ont été étudiés par analyses comparatives et phylogénétiques. (i) Notre stratégie a permis d’identifier dans 54 ASCUS/HPV-X étudiés une majorité d'HPV bas risque réalisant dans 41% des cas une infection à multiples génotypes (2 à 7), et aussi l’existence de quasi-espèces (41% des FCU) comprenant jusqu’à 17 variants pour un même génotype. Ainsi, de probables compétitions ou défauts d’hybridation des variants minoritaires peuvent expliquer le manque de performance du test INNO-LiPA. (ii) Chez le patient WHIM, le séquençage a été complété par des qPCR spécifiques de types, permettant une étude qualitative et quantitative. L’AMD3100 n’a pas modifié qualitativement le virome HPV cutané composé de 16 types, principalement des β- et γ-HPV, déjà présents 3 ans auparavant dans des verrues cutanées analysées rétrospectivement. En revanche, l’analyse quantitative montre des modifications en proportion relative des génomes viraux suggérant un effet du traitement sur l‘expression de certains types pouvant être associés sélectivement à la papillomatose. A cet égard, un des HPV composant le virome cutané du patient qui se trouve être un des deux seuls types présents dans une biopsie profonde de verrue, étaye l’hypothèse d’une sélection dans le processus lésionnel. De plus, les protéines oncogènes E6 et E7 de ce virus présentent des mutations, en comparaison à la séquence du génome HPV de référence, qui pourraient favoriser le potentiel pathogène de ce varian; hypothèse en cours d’investigation.En conclusion, les techniques de séquençage haut débit que nous avons développées ont permis de mieux caractériser la composition du virome HPV démontrant à la fois sa complexité en génotypes viraux ou en dérivés de ceux-ci (concept de quasi-espèces) et sa dynamique d’évolution qui pourraient sous-tendre le potentiel pathogène de ce virome HPV. / Human papillomaviruses (HPV) are classified into 5 genera α, β, γ, μ and η. Their genome comprises six early genes including two oncogenes E6 and E7, and two late genes encoding the L1 and L2 capsid proteins. β- and γ-HPV constitute an important part of the cutaneous virome; usually asymptomatic, they can manifest as papillomatosis like warts and are associated with certain skin cancers, especially in immunocompromised patients. α-HPV has a mucosal tropism; high-risk (HR) α-HPV16 and 18 are involved in 99% of cervical cancers.Detection of α-HR-HPV in cervical samples guide the management of women whose Pap smear result shows atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), although genotyping targets only the most common HPV types. Genotyping of β- and γ-HPV becomes necessary for the study of the virome especially in contexts of susceptibility to HPV pathogenesis (i.e. WHIM syndrome (for Warts, Hypogammaglobulimemia, Infections and Myelokathexis)). WHIM syndrome is a rare congenital immunodeficiency caused by a gain-of-function mutation of the CXCR4 receptor of the chemokine CXCL12 and manifests in 70% of cases by extensive cutaneous papillomatosis and ano-genital lesions that often evolve into cancer. Studies in our laboratory have identified the intrinsic role of the dysregulated CXCL12/CXCR4 axis in viral pathogenesis by demonstrating in particular the beneficial action of the blocking of this axis by an antagonist of CXCR4 (AMD3100) in vitro and in vivo on HPV-associated oncogenesis.Our objectives were: (i) to identify HPV whose genotype could not be determined (HPV-X) by a conventional test (INNO-LiPA HPV Genotyping Extra II®) in cervical samples with Pap smear report of ASCUS (ii) to characterize the HPV virome of a patient suffering from WHIM syndrom during a 7-month compassionate AMD3100 clinical trial to assess its impact on HPV-associated abnormalities.In both cases, we have developed a high-throughput sequencing genotyping method on Illumina Miseq®. The distribution of genotypes and their nucleotide polymorphism were studied by comparative and phylogenetic analyzes. (i) Our strategy identified in the 54 investigated ASCUS/HPV-X a majority of low-risk HPV, achieving a multiple infection (2 to 7 genotypes) in 41% of cases, and also the existence of quasi-species (41% of FCU) comprising up to 17 variants for the same genotype. Thus, probable competitions or hybridization defects of the minority variants may explain the lack of performance of the INNO-LiPA test. (ii) In the WHIM patient, sequencing was supplemented with type-specific qPCRs, allowing a qualitative and quantitative study. AMD3100 did not qualitatively modify the cutaneous HPV virome composed of 16 types, mainly β- and γ-HPV. In contrast, the quantitative analysis shows changes in the relative proportions of viral genomes suggesting a treatment effect on the expression of certain types that can be selectively associated with. papillomatosis. In this respect, one of the HPVs belonging to the cutaneous virome of the patient was found to be one of only two types present in a deep wart biopsy. This result supports the hypothesis of HPV selection in the lesion process. In addition, the oncogenic proteins E6 and E7 of this virus have mutations which could promote the pathogenic potential of this viral variant in comparison with the sequence of the reference HPV genome; a hypothesis that is under investigation.In conclusion, the high throughput sequencing techniques that we have developed have made it possible to better characterize the composition of the HPV virome demonstrating both its complexity in viral genotypes or in derivatives (i.e. quasi-species concept). The dynamics of which may underlie the pathogenic potential of this HPV virome.
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