La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une obstruction des voies respiratoires, des infections et une inflammation pulmonaire résultant du recrutement massif de neutrophiles qui sécrètent des protéases : l’élastase, la protéase 3 et la cathepsine G. Ces protéases peuvent être sécrétées selon deux voies, la dégranulation ou la sécrétion de NETs (Neutrophil Extracellular Traps), qui sont des fibres de chromatine auxquelles elles sont associées et décrites comme des structures antimicrobiennes. Dans le milieu extracellulaire, la dérégulation du contrôle de l’activité des protéases par leurs inhibiteurs conduit à la dégradation progressive du tissu pulmonaire. Nous avons montré que cette dérégulation était modulée par l’interaction des protéases avec l’ADN présent dans les sécrétions bronchiques des patients et que le ciblage de ces protéases par des inhibiteurs exogènes pouvait être amélioré in vitro par de la DNase ou de la polylysine qui compacte l’ADN. Ce polypeptide est également bactéricide vis-à-vis des pathogènes majeurs de la mucoviscidose, S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent également que les NETs sont sécrétés dans les poumons des patients où ils constituent un réservoir de protéases actives potentiellement délétère et n’ont pas d’effet bactéricide vis-à-vis de S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent que les voies de signalisation conduisant à la sécrétion des NETs varient selon le stimulus, générant des structures aux propriétés différentes. / Cystic fibrosis (CF) is a hereditary disease characterized by the obstruction of the airways, infections and a chronic lung inflammation due to a massive recruitment of neutrophils that secrete proteases: the elastase, the proteinase 3 and the cathepsin G. These proteases can be secreted by two mechanisms, namely degranulation and the secretion of NETs (Neutrophil Extracellular Traps), which are chromatin fibers to which they are bound and that have been described as antimicrobial structures. In the extracellular environment, the dysregulation of these proteases control by their inhibitors leads to progressive lung tissue degradation. We have shown that this dysregulation was influenced by the interaction of the proteases with the DNA found in the lung secretions of CF patients and that targeting these proteases with exogenous inhibitors could be improved in vitro by DNase or polylysine, which compacts DNA. This polypeptide also presents a bactericidal effect towards the major CF-associated pathogens, S. aureus and P. aeruginosa. Our work also shows that NETs are secreted in the lungs of CF patients, where they are a potentially deleterious reservoir of active proteases, and that they do not display any bactericidal effect towards S. aureus and P. aeruginosa. Our work shows that the signalization pathways leading to NETs secretion vary depending on the stimulus, generating structures that present different properties.

Le sujet de cette thèse porte sur la synthèse d'inhibiteurs spécifique de la Sérine-Thréonine phosphatase I (PP1). Un criblage de la chimiothèque de l'institut Curie, réalisé par l'équipe du Dr. Popov a permis d'identifier une 3-aryl-1(2H)isoquinolone, qui perturbe la dynamique des microtubules et qui s’est ensuite avéré être un inhibiteur sélectif de PP1. Dans une première partie, nous avons mis au point une nouvelle méthodologie de synthèse de ces composés hétérocycliques par une réaction tandem d’aminocarbonylation-cyclisation pallado catalysée. L’étude d’une seconde voie de synthèse de ces composés a été étudié par réaction d'arylation direct d'une 1(2H)isoquinolone. Dans le but de trouver d’autres hit, ligand de cette phosphatase, nous avons tenté de développer un test de triple hybride chimique, en collaboration avec la société Hybrigenics. Ce test est basé sur l’interaction de notre inhibiteur hit avec la phosphatase PP1. Pour cela, nous avons synthétisé une sonde à partir de la molécule hit initiale. La deuxième partie a trait à un développement de chimie médicinal pour optimiser le hit initial. Des dérivés de très bonne sélectivité pour l’enzyme cible ont été préparés. / This PhD thesis deals with the synthesis of serine threonine phosphatase I (PPI) inhibitors. This project started with the screening of the Institut Curie’s Library carried out by Dr. Popov team. They identified a 3-aryl-1(2H)isoquinolone (hit molecule) which strongly disturbs the microtubules dynamics. In the first part, we designed an original methodology to prepare those heterocycles, though a tandem palladium catalyzed aminocarbonylation/cyclization reaction. Then, we studied the direct arylation reaction to obtain the desired scaffold. In collaboration with Hybrigenics, we synthesize a probe for a triple hybrid system, based on the specific interaction of the hit molecule with its target PPI. Thanks to this system, one could identify new inhibitors of the targeted phosphatase protein. Eventually, a library of isoquinolones derivatives was synthesized. During the invitro tests, some of those molecules proved to be very specific for the serine threonine phosphatase I.

Ce projet porte sur la synthèse d'oligonucléotides modifiés décorés par des groupements chimiques rappelant les chaines latérales des acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des protéases à sérine, à savoir l'acide aspartique (Asp), la sérine (Ser) et l'histidine (His) afin d'en mimer l'activité protéolytique. L'approche synthétique de type phosphoramidite a été mise en oeuvre. De ce fait nous avons synthétisé des phosphoramidites fonctionnalisés avec une fonction acide carboxylique rappelant l'Asp, une fonction hydroxyle pour la Ser ou un imidazole pour l'His, correctement protégés pour être ensuite incorporés au sein de séquences oligonucléotidiques, et des phosphoramidites convertibles, qui portent une fonction chimique réactive permettant une conjugaison post synthèse supportée et automatisée de l'oligonucléotide. Ces deux types de phosphoramidites offrent la possibilité de les combiner et donc d'obtenir des séquences hautement fonctionnalisées. Les séquences oligonucléotidiques ont été choisies afin d'apporter un contrôle topologique structurant. Les structures secondaires envisagées sont de type bulge, épingle à cheveux et jonction trois voies car stables grâce aux appariements Watson et Crick entre les bases tout en ayant une flexibilité importante due à la présence de bases non appariées. Les travaux présentés dans ce manuscrit décrivent la synthèse des phosphoramidites modifiés ainsi que l'incorporation du nucléotide convertible de type alcyne au sein de séquences qui ont été conjuguées par CuAAC, et qui ont permi d'obtenir une jonction trois voies qui a été caractérisée par dichroïsme circulaire, gel de polyacrylamide et par dénaturation thermique. / We are interested in the synthesis of modified oligonucleotides decorated by chemical fonctions mimicking the amino acids side chains involved in enzymatic catalysis of serine proteases, acid aspartic (Asp), serine (Ser) and histidine (His), in order to mimic proteolytic activity. The phosphoramidite synthetic approach was choosen. We synthesised functionnalized phosphoramidites bearing either a carboxylic acid function reminding Asp, a hydroxyle function for Ser or an imidazole for His properly protected for their incorporation in oligonucleotides sequences, and convertible phosphoramidites, bearing a reactive function that permits a conjugation post automated oligonucleotides solid phase synthesis. Oligonucleotides sequences have been choosen in order to have a perfect structural control. The envisaged secondary structures are bulge, hairpin and three way junction because of their stability, thanks to Watson et Crick base pairing, and their flexibility thanks to the unpaired bases. The work presented here regards the synthesis of modified phosphoramidites and their incorporation of the convertible alkyne in sequences then conjugated by CuAAC reaction to form a three way junction whose stability and physico-chemical behavior have been evaluated.

Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) sont des récepteurs ionotropiques du glutamate jouant un rôle clé dans la plasticité synaptique et les fonctions cognitives. En conséquence, la perturbation de leur activité est impliquée dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques tels que l'épilepsie et la schizophrénie. La particularité de ces récepteurs est qu'ils nécessitent pour être activés la liaison simultanée de leur agoniste, le glutamate, et d'un co-agoniste. La glycine fut le premier co-agoniste identifié mais plus récemment, de nombreuses études ont révélé que la D-sérine joue également ce rôle dans de nombreuses régions cérébrales, notamment dans l'hippocampe. Toutefois il restait à définir si les fonctions de ces deux co-agonistes étaient régulées au cours du développement ou si elles étaient spécifiques à certaines synapses. Dans la première partie de mon travail, j'ai montré que la D-sérine est le co-agoniste préférentiel des synapses SC-CA1 matures alors que la glycine est le co-agoniste préférentiel des synapses mPP-DG. De plus, le remplacement des récepteurs NMDA composés de sous-unités GluN2B par des récepteurs contenant GluN2A au cours du développement post-natal survient au même moment qu'un changement dans l'identité du co-agoniste préférentiel des synapses SC-CA1. Dans la seconde partie de mon travail, je me suis intéressée à la contribution de la D-sérine en conditions pathologiques sur un modèle murin d'épilepsie chimio-induite par la pilocarpine. J'ai ainsi montré l'implication de la D-sérine dans l'activité épileptique initiée par la pilocarpine. / N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors are glutamate-gated ionotropic receptors which play a crucial role in synaptic plasticity and cognitive functions. As a consequence, disturbance in their activity is correlated with a broad range of neurological and psychiatric disorders including epilepsy and schizophrenia. The major particularity of NMDA receptors is the requirement of simultaneous binding of their agonist, glutamate, and a co-agonist to be activated. Glycine was the first co-agonist identified but more recently several studies showed that D-serine is also playing this role in many brain areas including the hippocampus. Whether the identity of the co-agonist is synapse specific or developmentally regulated remains unexplored. In the first part of my work I showed that D-serine is the preferred co-agonist at SC-CA1 mature synapses while glycine is the preferred one at mPP-DG synapse. Moreover, we showed that during postnatal development, the replacement of GluN2B by GluN2A-containing NMDA receptors at SC-CA1 synapses parallels a change in the co-agonist identity from glycine to D-serine. In the second part of my work I investigated the contribution of D-serine in pathological conditions. By using a model of acute intoxication of pilocarpine, I demonstrated that D-serine is implicated in epileptiform activity initiated after pilocarpine perfusion.

Les patients atteints de la MA souffrent d'altérations métaboliques et synaptiques précoces. Via la glycolyse et le cycle de Krebs, le métabolisme du glucose permet la production d'ATP, essentielle à l'activité et la plasticité synaptique. Contrairement aux neurones, les astrocytes utilisent majoritairement la glycolyse pour métaboliser le glucose. En plus de la production d'énergie, la glycolyse fournit les précurseurs indispensables à la synthèse de biomolécules comme la L-sérine. Cet acide aminé est produit à partir du glucose par la déviation du 3-phosphoglycérate (3PG), un intermédiaire glycolytique, via l'enzyme 3-phosphoglycérate déshydrogénase (PHGDH), exprimée spécifiquement dans les astrocytes. La L-sérine est le précurseur de la D-sérine, le principal co-agoniste des NMDAR nécessaires à l'activité et la plasticité synaptique.Nous avons utilisé des souris 3xTg-AD, un modèle développant une MA progressive, afin d'étudier si une altération de la production de L-/D-sérine pouvait contribuer à des déficits synaptiques.A 6 mois, lorsque les souris 3xTg-AD ne possèdent pas encore de plaques amyloïdes dans l'hippocampe, nous avons observé in vivo une diminution du métabolisme du glucose, de la concentration de L-sérine et des déficits synaptiques (LTP). L'expression locale de la PHGDH est aussi altérée. L'application de D-sérine restaure complètement les déficits de LTP chez les souris 3xTg-AD.Ces données supportent l'hypothèse qu'un déficit de production de L-sérine par les astrocytes médié par une diminution du flux glycolytique serait responsable de l'altération synaptique observée dans l'hippocampe des souris 3xTg-AD. / An early alteration of both cerebral glucose metabolism and synaptic activity has been consistently described in Alzheimer's disease (AD) patients. Metabolism of glucose via glycolysis and the citric acid cycle produces ATP that is essential for synaptic activity and plasticity. In the brain, glucose is predominantly processed glycolytically into astrocytes and not by neurons. Beyond ATP production, a major function of aerobic glycolysis is to provide precursors to support macromolecular synthesis. L-serine, generated from glucose through diversion of the glycolytic intermediate 3-phosphoglycerate (3PG) into the phosphorylated pathway, is only produced in astrocytes by 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), selectively expressed in those glial cells. L-serine is the precursor of D-serine, the main co-agonist of synaptic NMDAR, required for synaptic activity and plasticity. We used 3xTg-AD mice, which develop a progressive pathology, to investigate whether a defective production of L-/D-serine contributes to early synaptic deficits in AD. We found that 3xTg-AD mice display early in vivo alterations of glucose metabolism, synaptic deficits (LTP) in the CA1 region and also lower concentration of L-serine. The local expression of PHGDH was significantly altered. Exogenous D-serine completely rescued LTP in 3xTg-AD mice. These data support the hypothesis that a deficit of L-serine synthesis by astrocytes likely mediated by a decreased glycolytic flux may be responsible for the synaptic alteration mediated by NMDAR in the hippocampus of 3xTg-AD mice.

La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus

La perte de mémoire est un des premiers symptômes caractéristiques de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans les cerveaux des patients, on retrouve des dépôts extracellulaires de plaques amyloïdes ainsi que des agrégats intracellulaires de la protéine tau. Les patients présentent également des déficits du métabolisme cérébral du glucose, une quinzaine d’années avant les premiers défauts cognitifs, suggérant que le métabolisme pourrait contribuer à la physiopathologie de la MA. Pour mieux comprendre les mécanismes qui relient le métabolisme énergétique et l’activité synaptique, nous nous sommes intéressés à la production de L-serine, une molécule dont la synthèse de novo dérive d’un intermédiaire de la glycolyse. La L-serine est le précurseur de la D-sérine, un acide aminé en conformation D présent en grande quantité dans le cerveau. La D-sérine est un co-agoniste des récepteurs au N-méthyl-D-aspartate (NMDA-R) nécessaire à la potentialisation à long terme (LTP) de l’activité synaptique dans l’hippocampe. La voie de biosynthèse de la L-serine est ainsi à l’interface entre métabolisme énergétique et activité synaptique. Afin d’étudier le rôle de cette voie, nous avons mis au point un modèle de délétion conditionnelle de la Phgdh, la première enzyme de la voie de biosynthèse de la L-serine. Nous avons injecté par stéréotaxie des vecteurs adéno-associés permettant l’expression de la Cre recombinase dans l’hippocampe de souris Phgdh(flox/flox), une lignée de souris qui possède des sites LoxP autour des exons 4 et 5 du gène de la Phgdh. Nous avons validé ce modèle en montrant que l’expression de Phgdh ainsi que les taux de D-serine diminuent d’environ 60% dans l’hippocampe des souris injectées. Nous avons ensuite réalisé des enregistrements électrophysiologiques sur tranches et nous avons mis en évidence une diminution de la LTP dans l’hippocampe des souris injectées avec la Cre recombinase. Ces souris présentent également un déficit de mémoire à long terme mis en évidence avec le test de la piscine de Morris. Ces déficits sont restaurés lorsque les souris reçoivent chroniquement un régime enrichi en L-serine. Ces résultats montrent que la biosynthèse de sérine est nécessaire et suffisante pour la plasticité synaptique et la mémoire à long terme.Afin d’étudier le rôle de cette voie dans la MA, nous avons mesuré l’expression de différentes enzymes dans des extraits d’hippocampes de patients atteints de MA et nous avons mis en évidence des changements significatifs dès les stades intermédiaires. Finalement, nous avons étudié un modèle murin de MA, les souris 3xTg, qui présentent des déficits métaboliques, synaptiques et comportementaux. Les déficits de LTP sont restaurés en ajoutant de la L- ou de la D-sérine de façon aigue sur les tranches d’hippocampe. Nous montrons que le déficit de mémoire spatiale à long terme peut être restauré par une supplémentation chronique en D-sérine, suggérant l’importance de cette voie dans le contexte de la MA. / Memory loss is among the first symptoms reported by patients suffering from Alzheimer’s disease (AD). AD is characterized by extracellular amyloid plaques and intracellular aggregations of tau. A decrease of brain glucose metabolism has also been described in the brain of AD patients. Since this decrease appears decades before memory loss, we hypothesize that metabolic deficits could directly contribute to AD physiopathology. To understand the mechanisms linking brain metabolism and synaptic activity, we proposed to study the production of L-serine, a signaling molecule whose de novo synthesis diverts part of the glycolytic flux. L-serine is the precursor of D-serine, a co-agonist of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDA-R) that is required to maintain long term potentiation (LTP) of synaptic activity in the hippocampus. Since both L- and D-serine are formed through the activity of the Phosphorylated Pathway that diverts part of the glycolytic flux, any metabolic deficits may impact synaptic activity.We developed a model of conditional Phgdh deletion, the first enzyme of the phosphorylated pathway, by stereotaxically injecting Adeno-Associated Vectors allowing the expression of Cre recombinase in the hippocampus of Phgdh(flox/flox) mice, a mice strain with loxP sites flanking exons 4 and 5 of Phgdh gene. We validated this model showing that Phgdh expression and D-serine level are decreased by 60% in the hippocampus of injected mice. We performed electrophysiological recordings and showed that LTP is significantly reduced in mice injected with Cre recombinase. Those mice also show long term memory deficits in the Morris Water Maze test. Those deficits are restored by chronically feeding Cre injected mice with a diet enriched in L-serine indicating that serine biosynthesis is necessary and sufficient for synaptic plasticity and long term memory.To assess whether this pathway may be involved in AD pathogenesis, we quantified the expression of several enzymes of the serine biosynthesis pathway in human brain samples and found major changes in AD patients even at intermediate stages. To further investigate this hypothesis, we used 3xTg-AD mice, a mouse model for AD showing deficits in brain metabolism, synaptic activity and cognition. LTP deficits in 3xTg mice are restored by acute supplementation of L- or D-serine on hippocampal slices. We show that chronic administration of D-serine restores long term spatial memory. It suggests that serine biosynthesis is an important pathway in AD.

RAS est une petite protéine Rho-GTPase à la tête d'un réseau de signalisation prolifératif important. Les sentiers activés par RAS incluent les Mitogen-Activated proteins Kinases (MAPK) et la voie Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) /Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Bien que de nombreuses évidences soutiennent une forte implication de RAS dans la carcinogenèse, les mécanismes moléculaires précis liant RAS et prolifération cellulaire ne sont pas tous élucidés. En utilisant des données publiques de phosphoprotéomique, notre équipe a identifié Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) comme une nouvelle cible de RAS essentielle à la croissance et à la prolifération. ZNF768 est un facteur de transcription qui est déstabilisé au niveau post-traductionnel par les voies MAPK et mTOR/AKT. La déplétion aigue de ZNF768 induit prématurément une entrée en sénescence, un état caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, et souvent mis en place en réponse au stress. Nos études montrent que ZNF768 est dégradée durant ce phénomène ainsi que durant la sénescence réplicative. De plus, la surexpression de ZNF768 réduit l'entrée en sénescence, via un mécanisme majoritairement dépendant du facteur de transcription p53, qui joue un rôle important dans la sénescence. ZNF768 affecte négativement la phosphorylation de certains résidus clés pour l'activation de p53 et inhibe son activité transcriptionnelle. Nous avons par ailleurs démontré une interaction physique entre ces deux protéines. L'ensemble de ces résultats suggère que les voies MAPK et mTOR, toutes deux activées par RAS, déstabilisent ZNF768 afin de renforcer la sénescence prématurée. De manière intéressante, les niveaux de ZNF768 sont élevés dans certaines tumeurs humaines. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel ZNF768 puisse favoriser la carcinogenèse en réduisant la sénescence et en favorisant la prolifération. / RAS is a small Rho-GTPase protein that integrates growth factors signaling and activates several proliferating pathways including Mitogen-Activated Proteins Kinases (MAPK) and Phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Although many evidence indicate that RAS is involve in carcinogenesis, the molecular mechanisms that link RAS to cellular proliferation are not well understood. By using phosphoproteomics data, our team identified Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) as a new target of RAS signaling essential to growth and proliferation. ZNF768 is a transcription factor destabilized at the post-translational level by MAPK and mTOR/AKT. The acute depletion of ZNF768 induces senescence, a stable arrest of the cell cycle triggered by cellular stress. Our results show that ZNF768 is depleted during replicative and premature senescence. In addition, overexpression of ZNF768 bypasses senescence by a mechanism that is mainly dependent on the activity of p53, a transcription factor involved in senescence. Interestingly, ZNF768 interacts with p53 and inhibits its transcriptional activity by modulating its phosphorylation. Thus, MAPK and mTOR/AKT pathways destabilise ZNF768 to reinforce senescence. Moreover, ZNF768 levels are high in various human tumors. Altogether, these results suggest that ZNF768 promotes carcinogenesis by blocking senescence and by stimulating proliferation.

Les voies de signalisation Wnt et FGF sont parmi les plus importantes dans les communications inter-cellulaires qui régissent le développement et l’homéostase des tissus embryonnaires ou adultes. Bien que l’on connaisse énormément de choses sur ces voies et les protéines qui les composent, plusieurs questions persistent quant à leur régulation. Notre travail fait usage du modèle amphibien Xenopus laevis dans l’étude du rôle de deux MAP4K kinases de la famille Misshapen: xTNIK et xMINK dans la balance entre les branches «canonique» et «non-canonique» de la signalisation Wnt, ainsi que dans l’étude d’une nouvelle protéine adaptatrice de l’endocytose: E-Syt2 et de son rôle dans la régulation de la signalisation FGF. La voie signalétique Wnt est principalement traduite par la famille des récepteurs serpentins Frizzled vers deux voies distinctes : la voie dite «canonique» régulant la β-catenine nucléaire, et la voie dite «non-canonique» qui active les petites GTPases Rac et RhoA ainsi que la MAP-kinase JNK et les PKCs. Nous montrons ici que TNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) et xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) sont des composantes essentielles de ces deux voies de réponse. xTNIK et xMINK interagissent ensemble in vivo et subissent un clivage protéolytique libérant des domaines Kinase et Citron-NIK-Homology (CNH) respectivement activateur et suppresseur du signal. Les deux kinases interviennent dans la voie «non-canonique» cependant, alors que xTNIK est également un médiateur de la voie «canonique», xMINK y joue un rôle antagoniste et ces effets dépendent de leurs activités catalytiques. Nous apportons enfin la preuve qu’une régulation spécifique du clivage protéolytique des deux pro-enzymes dans les différents tissus embryonnaires régule leur activité de façon différentielle et suggérons qu’il s’agit là d’un mode d’aiguillage de la réponse Wnt entre les voies «canonique» et «non-canonique» in vivo. Enfin, nous montrons que la protéine membranaire de type synaptotagmine E-Syt2 est essentielle dans la phase précoce de l’endocytose du récepteur aux FGF activé, elle-même nécessaire à l’activation de ERK et à l’induction du mésoderme. E-Syt2 interagit spécifiquement avec le récepteur aux FGF activé ainsi qu’avec l’Adaptin-2. Il est en outre requis en amont de Ras dans l’activation de ERK et nos données identifient donc E-Syt2 comme un adaptateur endocytique de la voie de la clathrine. / The Wnt and FGF pathways are among the most critical inter-cellular signalling pathways controlling embryo development and the homeostasis of adult tissues. Although much is known about the signal transduction routes and proteins constituting these pathways, many questions concerning their regulation remain to be answered. The present work uses the Xenopus laevis model system to study the role of two kinases of the Misshapen family of MAP4K signalling kinases, xTNIK and xMINK, in the balance between canonical and non-canonical branches of Wnt signalling, and the role of a new endocytic adapter protein, E-Syt2, in regulation of FGF signalling by endocytosis. Wnt signals are predominantly transduced via the Frizzled family of serpentine receptors to two distinct pathways, the canonical pathway regulating nuclear -catenin and a non-canonical pathway that activates the small GTPases Rac and RhoA, the JNK MAP-kinase and PKC. My work shows that xTNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) and xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) are essential and indeed integral components of both the canonical and non-canonical Wnt pathways. xTNIK and xMINK interact with each other and are proteolytically cleaved in vivo to generate Kinase domain fragments that are active in signal transduction, and Citron-NIK-Homology domain (CNH) fragments that are suppressive. The Kinase domain fragments of xTNIK mediate both canonical and non-canonical signalling, whereas those derived from xMINK mediate non-canonical signalling but strongly antagonize canonical signalling. This work suggests that tissue specific regulation of the proteolytic cleavage of xTNIK and xMINK controls the balance between canonical and non-canonical Wnt signalling. The synaptotagmin-related membrane protein E-Syt2 was found to be essential for an early phase of activated FGF receptor endocytosis that is necessary for functional ERK activation and mesoderm induction. E-Syt2 interacts selectively with the activated FGF receptor and with Adaptin-2, and is required upstream of Ras for ERK activation. Together these data identified E-Syt2 as an endocytic adapter for the Clathrin-dependent pathway.

Les protéines kinases de type NIMA (NIMA related kinases - Neks) forment une famille relativement bien conservée chez les eucaryotes. Plusieurs d’entre elles, comme la protéine kinase NIMA d’Aspergillus nidulans et la protein Nek2 de mammifères ont fait l’objet d’études suffisamment approfondies pour les impliquer dans la régulation du cycle cellulaire. L’objectif du présent travail était de caractériser la famille des Neks chez les plantes, et plus particulièrement de déterminer le rôle de PNek1, une Nek de peuplier. J’ai identifié neuf PtNeks chez Populus trichocarpa, sept AtNeks chez Arabidopsis thaliana et six OsNeks chez Oryza sativa. L’analyse phylogénétique et leur distribution chromosomique suggèrent une descendance unique chez les plantes, probablement à partir de Nek1. L’analyse du profil d’expression transcriptionnelle indique que la régulation de l’expression des Neks est liée aux patrons de développement basipétal de la feuille et vasculaire de la plante. Plus particulièrement, l’analyse de l’expression du gène PNek1 révèle une concordance exacte avec les sites de production de l’auxine, du développement basipétal de la feuille et de l’initiation du système vasculaire. PNek1 n’est toutefois pas induite par la signalisation de l’auxine. La surexpression de PNek1 chez Arabidopsis induit des anomalies importantes au niveau de l’inflorescence, empêchant même la fertilisation de la fleur. Au plan cellulaire, PNek1 est localisé dans le nucléole et s’accumule lors de la phase G2 précédant la mitose. L’accumulation de PNek1 est aussi induite lors d’un stress génotoxique au point de contrôle en G1/S. Des résultats récents de double hybride indiquent que PNek1 pourrait être impliquée dans la maturation de l’ARNm puisqu’elle interagit avec DBR1, une protéine directement impliquée dans l’épissage. Le présent travail offre une perspective inédite de la littérature des Neks comme régulateurs du cycle cellulaire. Le contexte biologique particulier du peuplier m’a aussi conduit à associer les Neks au développement d’organes complexes. Cette approche et ces observations représentent donc en soit une contribution originale, se distinguant des nombreuses études antérieures faites chez les mammifères, où seule leur relation au cycle cellulaire a été étudiée. / The NIMA-related kinases family (Neks) is well conserved among eukaryotes. Several studies, especially on Aspergillus nidulans NIMA and mammalian Nek2, have tagged them as cell cycle regulators. The objective pursued in this work was to characterise the plant Nek family and, more specifically, to identify a possible role for PNek1, a Nek from poplar tree. Here, I describe nine PtNeks in Populus trichocarpa, seven AtNeks in Arabidopsis thaliana and six OsNeks in Oryza sativa. Phylogenetic analysis in addition to their chromosomal distribution suggest a unique origin for all plant Neks. Exhaustive transcript expression analysis indicates that plant Neks regulation is related to the basipetal and vascular plant development patterns. Moreover, PNek1 promoter expression analysis reveals a striking similarity with sites of auxin production, basipetal leaf development and vascular initiation. However, PNek1 is not induced by auxin signalling. PNek1 overexpression in Arabidopsis induces severe inflorescence anomalies, which can lead to flower sterility. At the cell level, PNek1 is localised in the nucleoli and accumulates during the G2 phase before the onset for mitosis. PNek1 transcript accumulation could also be induced by a genotoxic stress at the G1/S checkpoint. Yeast two-hybrid experiments indicate that PNek1 could be involved in mRNA maturation since it interacts with DBR1, a protein directly involved in RNA splicing. This work offers a unique perspective to the actual Neks literature as cell cycle regulators. The particular biological context of poplar trees also brought me to associate Neks with complex organ development. This approach and these observations represent an original contribution, distinguishing itself from the numerous mammalians studies which only looked at their relation to the cell cycle regulation.