Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esper_LucianaMariaRamires_D.pdf: 999342 bytes, checksum: 3f9fabfdcb18d73bafce5fd0ce00935e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A contaminação de fórmulas infantis por Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) e Bacillus cereus pode ter como origem o contato do alimento com biofilmes formados em ambientes, utensílios e equipamentos empregados na sua produção ou posterior reconstituição nos locais de distribuição. A grande preocupação em relação a estas bactérias é a presença das mesmas em fórmulas infantis, produtos estes utilizados como fonte de alimentação para lactentes de forma exclusiva ou em combinação com outros alimentos. A formação de biofilmes, assim como outros mecanismos celulares como por exemplo a produção de bacteriocinas e fatores de virulência, podem ser modulados pelo processo de comunicação célula-célula ou quorum sensing - mecanismo de sinalização célula-célula mediada pelo acúmulo de uma classe ou mais de moléculas sinalizadoras produzidas pela célula e excretadas para o meio externo. Por sua vez, a quebra deste sistema, pela degradação das moléculas sinalizadoras de comunicação, denomina-se quorum quenching. Neste trabalho objetivou-se, primeiramente, a avaliação da dinâmica de formação de biofilmes mono e multi-espécies de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus em superfície de aço inoxidável utilizando-se como meios de cultivos fórmula Infantil (FI) e caldo Luria Bertani (LB) e a eficácia de soluções de ácido peracético e de hipoclorito de sódio na inativação desses biofilmes. Outro objetivo principal foi pesquisar a ocorrência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching em E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus e a possível influência das moléculas sinalizadoras na sensibilidade destas bactérias aos antimicrobianos. A formação de biofilmes ocorreu de forma mais intensa ao utilizar-se a fórmula infantil, quando comparado com o meio de cultivo LB, fato este relevante por ser a fórmula infantil o mais conhecido e importante veículo de transmissão de E. sakazakii (Cronobacter spp.). Tanto em cultivo mono-espécie quanto em cultivo misto, o nível de contagem de E. sakazakii (Cronobacter spp.) superou o de B. cereus e para ambos o maior desenvolvimento ocorreu em cultivos mono-espécie. Em todos os biofilmes de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus isoladamente e em cultura mista, produzidos em caldo LB e independente do tempo de formação, as contagens foram reduzidas a níveis inferiores a 1 logUFC/cm2 quando em contato com soluções de ácido peracético ([500mg/L]) e hipoclorito de sódio ([100mg/L]) por 15 minutos. No entanto, para os biofilmes produzidos em fórmula infantil ocorreram algumas situações, em que as contagens de microrganismos após o contato com as soluções de sanitizantes, foram superiores a 1 logUFC/cm2, evidenciando assim a ineficácia do procedimento de sanitização para alguns biofilmes formados a 5 dias ou mais e a necessidade da higienização das superfícies ser realizada o mais próximo do término do processamento ou reconstituição destes alimentos. Evidenciou-se a existência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching, através dos testes de atividades biológicas das culturas, extratos e suas frações. Os testes com os biossensores revelaram-se positivos para a produção de homoserinas lactonas em cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e negativos para a espécie B. cereus. Em cultivo misto de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus observou-se a redução e/ou a não detecção das homoserinas lactonas fato este possivelmente associado ao fenômeno quorum quenching. A possível presença de moléculas sinalizadoras AI- 2 e AI-3 foi evidenciada, sendo confirmada a presença de moléculas sinalizadoras AI-1. A caracterização do AI-1 realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) revelou a capacidade da cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) em produzir três compostos, N-heptanoil-HSL, N-dodecanoil- HSL e N-tetradecanoil-HSL, substâncias estas ainda não reportadas na literatura para o microrganismo em estudo. Os autoindutores sintéticos C7-HSL, C12-HSL e C14-HSL adicionados a cultura de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus não exerceram efeito sobre a sensibilidade aos antimicrobianos, sugerindo que estas moléculas não estariam envolvidas em mecanismos de resistência a estes antimicrobianos. Em resumo este trabalho representa um importante passo no estudo da formação de biofilmes e dos sistemas quorum sensing e quenching para as bactérias em questão, cujos conhecimentos são de grande interesse na segurança dos alimentos / Abstract: The contamination of infant formulas by Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus can occur due to contact with biofilms formed in the environment and on equipment used in their production and reconstitution. There is concern about these bacteria due to their presence in foods used as a source of nutrition for infants. Biofilm formation as a wide spectrum of important processes is reported to be regulated by quorum sensing, including, for example, antibiotic production and virulence. Cell-to-cell communication or bacterial quorum sensing is a signaling mechanism that refers to the ability of bacteria to respond to chemical molecules called autoinducers, in response to cell density. Degradation of the signaling molecule prevents it from accumulating in sufficient amounts, leading to disruption of the communication system, known as quorum quenching. The aim of this study was first to evaluate the formation of mono and multi-species biofilms of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus on stainless steel surfaces using infant formula (FI) and Luria Bertani (LB) broth as the culture media, and the efficacy of sodium hypochlorite and peracetic acid in inactivating these biofilms. The other objective was to investigate the involvement of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus in quorum sensing and quorum quenching systems and the possible influence of the signaling molecules on the sensibility of these bacteria to antimicrobials. The formation of biofilms was greater when using the infant formula than the Luria Bertani broth, this fact being important since the infant formula is considered to be an important vehicle in the transmission of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) to infants. In both cases, the growth of the mono species was greater than in the multi species culture. In all the biofilms formed in the Luria Bertani broth, independent of the time of formation, the counts were reduced to less than 1 log CFU/cm2 when in contact with sodium hypochlorite ([100mg/L]) or peracetic acid ([500mg/L]). However for the biofilms produced in the infant formula, many situations occurred, with counts more than1 log CFU/cm2 in some situations after the contact with sanitizers highlighting the need for na efficient sanitization of the surfaces as soon as the processing or reconstitution of these foods has finished. The experiments with biosensors provided evidence of the occurrence of quorum sensing and quorum quenching systems using bioassays with the cultures and extracts of the microorganisms under examination. These bioassays were positive for the production of homoserine lactone by E. sakazakii (Cronobacter spp.) but negative for B.cereus. In the mixed culture a reduction and/or non-detection of the homoserine lactone was observed, a fact that could be associated with quorum quenching. A possible presence of the signaling molecules AI-2 and AI-3 was evident and the presence of AI-1 was confirmed. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses allowed for a chemical identification of the production of N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl- HSL and N-tetradecanoyl-HSLby the E. sakazakii (Cronobacter spp.), a fact not previously reported in the literature. The addition of synthetic signaling molecules (N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl-HSL and N-tetradecanoyl-HSL) had no significant effect on the sensibility of the E. sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus strains to antimicrobials. In summary this study represents an important step in biofilm's formation, quorum sensing and quorum quenching in these bacteria that are of great interest in food safety / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Arnaldo Yosteruy Kuaye, Luiz Antonio Viotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:42:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_LilianeRodrigues_M.pdf: 1091941 bytes, checksum: 60be1838dcd0800329468f3b7825e521 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O grande consumo de águas minerais tem alavancado muitos estudos de relação caracterização microbiológica, nas mais diversas regiões brasileiras. Trabalhos revelam que a grande maioria das águas brasileiras envasadas e águas de poços artesianos possuem contaminação microbiana, causando grande preocupação com relação à qualidade da água a ser consumida. Dentre os processos para tratamento da água mineral, a fim de atender as exigências comerciais e de legislações, está a microfiltração. O processo consiste da utilização de filtros de membranas poliméricas, nos quais os microrganismos ficam retidos (barreira mecânica). De acordo com a Resolução RDC nº 275/2005 Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), os microrganismos Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, estão inseridos, juntamente com outras bactérias, como Enterococos, Clostridium perfringens e coliformes totais no quadro de controle microbiano de águas minerais. Devido à utilização dos filtros de membrana para controle destes microrganismos, há a necessidade da realização da sanitização desses filtros para evitar proliferação de microrganismos na superfície; prevenindo o entupimento dos poros da membrana e contaminação do processo. O sanitizante a base de ácido peracético e água quente são os principais agentes sanitizantes utilizados na indústria de água mineral para sanitização de equipamentos. Assim este trabalho objetivou avaliar a formação de biofilme microbiano de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa em membranas poliméricas de poliamida e polietersulfona e a eficiência da sanitização das membranas por solução de ácido peracético a 0,1%, 0,2% e água quente a 85 ºC em dois diferentes tempos de contato, 10 minutos e 20 minutos. O teste foi realizado através do contato de cupons de 1 cm2 das membranas com o inóculo na concentração de 104 UFC/ mL, em temperaturas de 5, 25 e 35ºC e a análise dos cupons após 24h, 48h e 72h de contato. A quantidade de células aderidas de Escherichia coli para ambas as membranas foi de 4 log UFC/ cm2 para as primeiras 24h de contato, chegando até 6 log UFC/cm2 após 72h de contato para a temperatura de 35ºC. Para Pseudomonas aeruginosa, o comportamento de adesão foi similar, onde a maior quantidade chegou à 6,25 log UFC/cm2 após 72h de contato para a temperatura de 25ºC. Para avaliar a eficiência dos agentes sanitizantes, os cupons foram submetidos ao processo de adesão dos microrganismos e após 24 horas de contato na temperatura de 35ºC foram colocados em contato com a solução sanitizante à base de ácido peracético 0,1%, 0,2% e água quente à 85ºC durante 10 e 20 minutos. Os sanitizantes utilizados ofereceram grande eficiência na redução das bactérias aderidas nas membranas. A concentração do sanitizante químico mais efetivo foi 0,2% para 10 e 20 minutos de contato, onde cerca de 80% dos cupons tiveram redução de > 4 Log UFC/cm2. A água na temperatura de 85ºC em ambos os tempos de contato (10 minutos e 20 minutos) também ofereceu grande eficiência na redução logarítmica dos microrganismos, onde 100% dos cupons apresentaram redução > 4 Log UFC/cm2 / Abstract: The high consumption of mineral water has leveraged many studies regarding microbiological, in several brazilian regions. Papers reveal that the vast majority of brazilian bottled waters and water from artesian wells have microbiological contamination, causing great concern about the quality of water being consumed. Among the processes for treatment of mineral water in order to meet business requirements and laws is microfiltration. The process consist in the use of polymer membrane filters, the where the microorganisms are withheld (mechanical barrier). According to Resolution RDC 275/2005 of National Agency for Sanitary Vigilance (ANVISA) microorganisms Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, are inserted, along with other bacteria such as Enterococcus, Clostridium perfringens and total coliforms under control of microbiological characteristics of mineral waters. Due to the use of membrane filters to control these microorganisms, there is the need to perform sanitization filters to prevent the proliferation of microorganisms on the surface, preventing the clogging of the pores of the membrane and process contamination. The sanitizing the basis of peracetic acid and hot water are the main agents sanitizers available in the industry of mineral water to equipments sanitize. This study aimed to evaluate the microbial biofilm formation of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa in polymeric membranes of polyamide and polyethersulfone membranes and the sanitizing ef ficiencyprocess with of peracetic acid 0.1%, 0.2% and hot water at 85 °C in two different contact times, 10 minutes and 20 minutes. The test was conducted through the contact of coupons with 1 cm2 of the membranes in the inoculum with concentration of 104 CFU /mL, at temperatures of 5, 25 and 35 °C and an alysis of the coupons after 24h, 48h and 72h of contact. The amount of Escherichia coli cells attached to both membranes was 4 log CFU /cm2 for the first 24 hours of contact, reaching 6 log CFU /cm2 after 72 hours of contact to a temperature of 35 °C. For Pseudomonas aeruginosa, the adherence behavior was similar, where the largest amount reached 6.25 log CFU /cm2 after contact for 72 hours at 25 º C. To evaluate the effectiveness of sanitizing agents, the coupons were subjected to the adhesion of microorganisms and after 24 hours of contact at 35 ºC were placed in contact with the sanitizing solution based on peracetic acid 0.1%, 0.2% and hot water at 85 °C for 10 to 20 minutes. The sanitizers used offered high efficiency in reducing bacteria attached on the membranes. The concentration of chemical sanitizer most effective was 0.2% for 10 and 20 minutes of contact, where about 80% of the coupons was reduced by > 4 Log CFU/cm2. The water temperature at 85 °C in both contact times (10 and 20 minutes) also offered greater efficiency in logarithmic reduction of microorganisms, where 100% of the coupons showed a reduction > 4 Log UFC/cm2 / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Arnaldo Yoshitery Kuaye / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_MarciliaSantosRosado_D.pdf: 7485240 bytes, checksum: 3dad1460f19464270a1613e5d1418506 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na elaboração de produtos lácteos, a qualidade do leite cru é um fator de grande importância. Alguns micro-organismos psicrotróficos produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas, além de apresentar capacidade formar biofilmes em superfícies de equipamentos e utensílios utilizados no processamento. Dentre estes micro-organismos, estão bactérias dos gêneros Enterococcus e Pseudomonas. Neste trabalho, os objetivos principais foram avaliar a presença de bactérias do gênero Enterococcus e Pseudomonas produtoras de enzimas proteolíticas e lipolíticas, em ambientes de processamento de produtos lácteos, a possível formação de biofilmes mono e multi-espécies em superfície de aço inoxidável AISI 304 e seu controle por agentes sanitizantes. As coletas de amostras foram realizadas durante as etapas de processamento de queijo Minas Frescal. Bactérias dos gêneros Enterococcus e Pseudomonas e mesófilos aeróbios foram detectadas em amostras de matéria-prima, superfícies de contato e produto final. Também foram coletadas amostras de leite cru de duas outras indústrias, denominadas leite cru 3 e leite cru 4. O armazenamento das amostras de leite cru a 4, 7 e 10 °C por 2, 4 e 8 dias, perm itiu observar a influência do tempo e temperatura no desenvolvimento bacteriano. O aumento do tempo e temperatura promoveu a elevação das contagens de mesófilos aeróbios, Enterococcus spp. e Pseudomonas spp.. Foram obtidos 315 isolados do gênero Enterococcus e 310 do gênero Pseudomonas. Dentre os isolados identificados pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), o gênero Enterococcus apresentou 35,05% de E.faecium e 64,95% de E.faecalis, e o gênero Pseudomonas, 23,87% de P.aeruginosa e 76,18% de P.fluorescens. A partir da análise da atividade proteolítica das bactérias dos gêneros Enterococcus e Pseudomonas, foram observados resultados positivos em 49,52 e 71,29%, respectivamente. Para atividade lipolítica, estes percentuais foram de 38,73 e 98,38%, respectivamente.A avaliação da formação de biofilmes mono e multi-espécies foi realizada em cupons de aço inoxidável AISI 304, com rugosidade média de 0,366µm, nos tempos 0; 1,2; 4; 6,8 e 8 dias e nas temperaturas 7; 13; 27; 41 e 47°C, segundo delineamento composto central rotacional. Foram realizados cinco delineamentos, para avaliação da formação de biofilme por E.faecium, E.faecalis, P.fluorescens,P.aeruginosa e pela junção das espécies. O inóculo inicial utilizado foi aproximadamente 1x102UFC.cm-2. A análise de variância mostrou ajuste significativo para todos os delineamentos, permitindo a construção de modelos capazes de predizer a adesão em função do tempo e temperatura. Faixas de combinações de tempo e temperatura que permitiram a formação dos biofilmes foram determinadas. Bactérias do gênero Enterococcus inibiram o desenvolvimento das bactérias do gênero Pseudomonas. A microscopia eletrônica de varredura permitiu a visualização das topografias, bactérias aderidas e produção de exopolissacarídeos. A ação dos sanitizantes hipoclorito de sódio a 100mg.L-1 de Cloro Residual Total (CRT), ácido peracético a 300mg.L-1 e digluconato de clorexidina a 400mg.L-1, em relação aos biofilmes formados foi avaliada. O ácido peracético foi o sanitizante mais eficiente, no entanto na maior parte dos ensaios, os micro-organismos não foram totalmente eliminados,evidenciando a dificuldade de sanitização das superfícies após a formação do biofilme / Abstract: In the preparation of dairy products, the quality of raw milk is a factor of great importance. Some psychrotrophic produce lipolytic and proteolytic enzymes, and present the capacity to form biofilms on surfaces of equipament and utensils used in processing. Among these microorganisms are bacteria of the genera Pseudomonas and Enterococcus. In this study, the main objectives were to evaluate the presence of bacteria of the genera Pseudomonas and Enterococcus which produce lipolytic and proteolytic enzymes in environments where dairy products are produced, the possible formation of biofilms mono and multi-species on the surface of stainless steel AISI 304 and its control by sanitizers. The sample collection were collected in processing of Minas cheese. Bacteria of the genera Enterococcus and Pseudomonas, and mesophilic aerobic were detected in samples of raw materials, contact surfaces and the final product. Samples of raw milk from two other industries, denominated raw milk 3 and raw milk 4 were also collected. The storage of raw milk samples at 4, 7 and 10°C for 2, 4 and 8 days allowed to observe the influence of time and temperature on bacterial growth. The increasing time and temperature promoted an increase in counts of aerobic mesophiles, Enterococcus spp. and Pseudomonas spp. in all collected samples. We obtained 315 isolates of the genus Enterococcus and 310 of the genus Pseudomonas. Among the isolates identified by PCR, the genus Enterococcus indicated 35.05% of E.faecium and 64.95% of E.faecalis, and Pseudomonas indicated 23.87% of P.aeruginosa and 76.18% of P.fluorescens. From the analysis of the proteolytic activity of bacteria of the genera Pseudomonas and Enterococcus positive results were observed in 49.52 and 71.29%, respectively. To lipolytic activity these percentages were 38.73 and 98.38%, respectively. The evaluation of the mono and multi-species biofilm formation was developed in coupons of stainless steel AISI 304, with roughness average of 0.366µm, in times of 0, 1.2, 4, 6.8 and 8 days and in temperatures of 7 , 13, 27, 41 and 47°C, according to a central composite design. Five designs were developed for evaluation of biofilm formation by E.faecium, E.faecalis, P.fluorescens, P.aeruginosa and by junction of all species. The initial inoculum used was approximately 1x102 CFU.cm-2. The analysis of variance indicated the significant adjustment for all designs, allowing the construction of models capable of predicting the adhesion according to of time and temperature. The optimum intervals of time and temperature for the formation of biofilms were determined for each design. Bacteria of the genus Enterococcus inhibited the growth of bacteria of the genus Pseudomonas. The scanning electron microscopy allowed the visualization of topographies, the adhered bacteria and the production of exopolysaccharides. The action of sodium hypochlorite 100mg.L-1 of Total Residual Chlorine (TRC), peracetic acid 300mg.L-1 and chlorhexidine gluconate 400mg.L-1 in relation to formed biofilms was evaluated. Peracetic acid was the most effective sanitizing, however in most tests, the microorganisms were not completely eliminated, which demonstrates the difficulty of sanitization of surfaces after formation of the biofilm / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutora em Tecnologia de Alimentos

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O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da formação de biofilme por Staphylococcus coagulase positiva (SCP) isolados de queijo mussarela de búfala sobre a sensibilidade a sanitizantes. A partir de contagens de SCP realizadas em 50 amostras de queijo mussarela de búfala foram obtidos isolados, que foram comparados entre si por rep-PCR e identificados bioquimicamente e por multiplex PCR. As cepas distintas foram testadas quanto a formação de biofilme em placas de microtitulação. As cepas forte formadoras e uma não formadora de biofilme foram testadas em superfícies de polietileno de alta densidade, aço inoxidável e vidro. Também foram testadas quanto à sensibilidade ao hipoclorito de sódio e ao iodo após a formação do biofilme. Vinte amostras de queijo albergavam SCP, entretanto as contagens estavam dentro dos limites estabelecidos pela legislação brasileira. A rep-PCR mostrou que cada uma das amostras que estavam contaminadas apresentava uma única cepa, as quais foram identificadas como S. aureus. Dois isolados foram classificados como forte formadores de biofilme, sete como moderados formadores, dez fracos formadores e um como não formador de biofilme. As duas cepas forte formadoras produziram biofilme nas três superfícies testadas. A aplicação dos sanitizantes hipoclorito de sódio e iodo promoveu uma redução das populações bacterianas de aproximadamente 2 log em todas as superfícies, tanto das cepas formadoras de biofilme como da não formadora. Embora as cepas formadoras de biofilme não sejam mais resistentes aos sanitizantes hipoclorito de sódio e iodo do que as não formadoras, elas atingem maiores concentrações no biofilme, o que resulta em maiores populações bacterianas remanescentes após a aplicação dos sanitizantes. / The Buffalo milk mozzarella cheese, main type of chesse obtained from this milk in Brazil, is a new product in the market, with high consumer acceptance and excellent prospects for trade. The cheese is rich in nutrients, which favors the proliferation of microorganisms that can cause food toxi-infections in the consumer. The staphylococcal gastro-enteritis is caused by ingestion of food containing enterotoxins produced by coagulase-positive Staphylococcus. One problem that may hinder the elimination of undesirable microorganisms in the food industry is the formation of biofilms. The objective of this study was to determine the effect of biofilm formation by coagulase-positive (CPS) Staphylococcus isolated from buffalo mozzarella cheese on sensitivity to sanitizers. From CPS counts carried out on 50 samples of buffalo mozzarella cheese were obtained isolates, which were compared by rep-PCR and biochemically identified and by multiplex PCR. The distinct strains were tested for biofilm formation in microtiter plates. Strong forming and non-biofilm forming strains were tested on high density polyethylene, stainless steel and glass surfaces. They were also tested for sensitivity to sodium hypochlorite and iodine after biofilm formation. Twenty samples of cheese harbor CPS, however the counts were within the limits established by Brazilian legislation. Rep-PCR showed that each of the samples that were contaminated had a single strain, which was identified as S. aureus. Two isolates were classified as strong biofilm formers, seven as moderate formers, ten weak formers and one as non-biofilm builder. The two strong forming strains produced biofilm on the three surfaces tested. The application of sodium hypochlorite and iodine sanitizers promoted a reduction of approximately 2 log bacterial populations on all surfaces of both the biofilm and non-forming strains. Although biofilm forming strains are no longer resistant to sanitizers sodium hypochlorite and iodine than non-forming sanitizers, they reach higher concentrations in the biofilm, resulting in larger bacterial populations remaining after application of the sanitizers.

Biofilmes de Listeria monocytogenes são fontes potenciais de contaminação de alimentos processados e podem diminuir a efetividade de procedimentos de higienização e sanitização nas indústrias. No presente estudo foi avaliada a estrutura e a dispersão de biofilmes formados por duas cepas de L. monocytogenes em diferentes superfícies, como aço inoxidável, vidro e poliestireno. Foram utilizados diferentes sistemas de cultivo como microplacas de 96 poços de poliestireno e de aço inoxidável, microplacas de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro e, câmaras de poliestireno contendo 8 poços com fundo de borossilicato (vidro). Os experimentos foram realizados com incubação por 1, 4 e 8 dias a 25°C. A formação de biofilme foi verificada em microplacas de 96 de poliestireno e de aço inoxidável através do método de quantificação de biomassa do biofilme por coloração com cristal violeta, e também em sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro, através de enumeração em placa das células aderidas nas superfícies. As estruturas dos biofilmes foram observadas por meio de microscopia de fluorescência (para o sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável) e através de microscopia confocal a laser (para o sistema com câmaras com fundo de vidro). Para isso, os biofilmes foram corados com o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD®, a fim de diferenciar as células viáveis (coradas com Syto 9) das células mortas (coradas com iodeto de propídeo), sendo feitas estimativas do número de células aderidas à superfície de vidro através de quantificação por fluorescência. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de óleos essenciais de plantas de Cymbopogon citratus (capim-limão) e de Zingiber officinale (gengibre) e de dois sanitizantes comerciais (um à base de óleo de coco babaçu e outro à base de dióxido de cloro) frente a L. monocytogenes. Posteriormente, foi testada a eficácia desses antimicrobianos na remoção de biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias a 25ºC, em superfície de aço inoxidável e de vidro, através da enumeração em placas de células aderidas e de observações microscópicas. Foi também avaliada a presença de moléculas relacionadas ao estresse oxidativo e nitrosativo em biofilmes maduros de duas cepas de L. monocytogenes formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, para o estudo do possível efeito do óxido nítrico (NO) exógeno e de inibidores de NO na dispersão de células do biofilme e na alteração dos níveis de expressão de genes de L. monocytogenes relacionados ao estresse oxidativo e nitrosativo (Lmo0990, Lmo0807 e Lmo1485), bem como à regulação do gene de virulência e formação de biofilme (PrfA). Foi verificada a presença de intermediários de oxigênio reativo (ROI - reactive oxygen intermediates) e de intermediários de nitrogênio reativo (RNI - reactive nitrogen intermediates) nos biofilmes de L. monocytogenes com 4 e 8 dias de incubação a 25ºC formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, por meio de marcadores ii fluorescentes específicos e visualizações microscópicas. A fim de confirmar indiretamente a presença de óxido nítrico (NO) em cultivos de L. monocytogenes incubados por 4 e 8 dias a 25ºC, foi realizada a dosagem de nitrito com o emprego do reagente Griess. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) do doador de óxido nítrico como nitroprussiato de sódio (SNP) e dos inibidores de NO como N?-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) e 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina-1-oxi-3-óxido (Carboxi-PTIO sal de potássio, C-PTIO) frente a L. monocytogenes. Foi testada a eficácia do SNP e dos inibidores de NO na remoção de biofilmes pré-formados por 4 e 8 dias de L. monocytogenes em superfície de aço inoxidável. Os resultados deste trabalho demonstraram que o biofilme de L. monocytogenes formado em vidro e em aço inoxidável apresentou uma arquitetura microscópica semelhante a um \"favo de mel\", com presença de canais de água, bem como cavidades de tamanhos variados devido à dispersão de grupos de células planctônicas ou morte celular. A utilização de óleos essenciais e/ou sanitizantes comerciais por 1h em biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias, foi eficaz na redução do número de células aderidas na superfície de aço inoxidável e de vidro. No biofilme de L. monocytogenes foram detectadas moléculas relacionadas ao estresse oxidativo como peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais superóxidos, bem como moléculas de estresse nitrosativo como óxido nítrico (NO) e peroxinitrito. A adição de NO exógeno (por meio do doador SNP) e a adição de inibidores de NO no meio de cultivo não alteraram o crescimento planctônico de L. monocytogenes. Foi observado que a exposição a SNP e a inibidores de NO por 1h em biofilmes de L. monocytogenes pré-formados por 4 e 8 dias, não induziu a dispersão celular. A adição de NO exógeno bem como a remoção de NO do meio de cultura por moléculas inibidoras não alteraram o nível de expressão dos genes Lmo1485, Lmo0990, Lmo0807 e PrfA, em culturas de L. monocytogenes de 8 dias. A utilização de óleos essenciais de plantas e/ou sanitizantes comerciais em biofilmes pré-formados pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de L. monocytogenes em superfícies de manipulação de alimentos, mas a melhor estratégia de controle é impedir a formação de biofilme pelo emprego de tratamentos combinados nos estágios iniciais de contaminação. Em conclusão, L. monocytogenes formou biofilme com estruturas bem definidas que podem contribuir para a sobrevivência e disseminação da bactéria no ambiente de processamento de alimentos. Apesar de L. monocytogenes não formar um biofilme espesso com multicamadas, as células aderidas apresentam geralmente maior resistência à ação dos antimicrobianos em comparação com as células planctônicas, conseguindo sobreviver e persistir na superfície, com mecanismos regulatórios bastante eficientes frente a diferentes tipos de estresse. / Biofilms of Listeria monocytogenes are potential sources of contamination of processed foods, and may interfere in the effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in food industry. In the present study the structures and dispersion of biofilms formed by two strains of L. monocytogenes on different abiotic surfaces, such as stainless steel, glass and polystyrene were evaluated. Different cultivation systems such as polystyrene and stainless steel 96-wells microplates, 24-wells microplates containing round stainless steel or glass slides, and 8-wells polystyrene chambers with borosilicate bottom were used. The experiments were done for 1, 4 and 8 days of incubation at 25°C. Biofilm formation was observed in 96-wells microplates of polystyrene and stainless steel by the quantification of biofilm biomass by staining with crystal violet, and also in 24-wells microplates system with circular slides of stainless steel or glass, with enumeration of adhered cells on agar plates. The structure of biofilms were observed by fluorescence microscopy (for the system of 24-wells microplates containing circular slides of stainless steel) and by confocal laser scanning microscopy (for the system of glass bottom chambers). For this, biofilms were stained with the LIVE/DEAD® bacterial viability kit, in order to differentiate viable cells (stained with Syto 9) from dead cells (stained with propidium iodide). The estimative of the number of viable cells was done by measurement of fluorescence. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oils plants of Cymbopogon citratus (lemon grass) and Zingiber officinale (ginger) and two commercial sanitizers (babassu coconut oil-based sanitizer and chlorine dioxide-based sanitizer) against L. monocytogenes were also determined. Subsequently, the antimicrobials were evaluated against L. monocytogenes biofilms formed by 4 and 8 days at 25°C on the stainless steel and glass surfaces by enumeration on agar plates of adhered cells and microscopic observations. The presence of molecules related to oxidative and nitrosative stresses in mature biofilms of two strains of L. monocytogenes formed on glass and stainless steel surfaces was also evaluated, and the possible role of exogenous nitric oxide (NO) and inhibitors of NO were studied for induction of biofilm dispersal cells and changed of genic expression levels of L. monocytogenes related to oxidative and nitrosative stress genes (Lmo0990, Lmo0807 and Lmo1485), as well as the regulation of virulence and biofilm formation gene (PrfA). The presence of reactive nitrogen intermediates (RNI) and reactive oxygen intermediates (ROI) was investigated in biofilms of L. monocytogenes formed on stainless steel and glass surfaces with 4 and 8 days-old at 25°C, using specific fluorescent dyes and microscopic views. In order to indirectly confirm the presence of nitric oxide (NO) in cultures of L. monocytogenes incubated for 4 and 8 days at 25°C, the dosage of nitrite was carried out with Griess reagent. The minimum inhibitory concentration (MIC) of a nitric oxide donor as sodium nitroprusside (SNP) and two NO inhibitors such as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetrametilimidazoline-1-oxy-3-oxide (Carboxy-potassium salt, C-PTIO), were iv evaluated for L. monocytogenes. It was also determined the effectiveness of SNP and of the two inhibitors of NO to eliminate biofilms of L. monocytogenes preformed for 4 and 8 days on stainless steel surfaces. The results of this work showed that L. monocytogenes biofilms formed on glass and on stainless steel surfaces, presented similar microscopic architectures in a \"honeycomb\" like structure, with water channels and hollows of different sizes, possibly due to cell dispersion or death. The exposure to essential oils and/or commercial sanitizers for 1h for L. monocytogenes biofilms formed for 4 and 8 days was effective in reducing the number of cells adhered on stainless steel and on glass surfaces. In biofilms of L. monocytogenes, molecules were detected related to oxidative stress such as hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide radicals, as well as molecules related to nitrosative stress as nitric oxide (NO) and peroxynitrite. The addition of exogenous NO (SNP) and inhibitors of NO in the culture medium did not inhibit planktonic growth of L. monocytogenes, and exposure to SNP and to inhibitors of NO for 1 h for biofilms of L. monocytogenes preformed by 4 and 8 days did not induce cell dispersion. The addition of exogenous NO and NO removal from the culture medium by inhibitory molecules did not alter the level of expression of Lmo1485, Lmo0990, and PrfA Lmo0807 genes in cultures of 8- days-old of L. monocytogenes. The use of essential oils from plants and/or sanitizing commercial agents on pre-formed biofilms can be an effective alternative in the control of L. monocytogenes in food handling surfaces, but the best control strategy is avoid the biofilm formation by applying combined treatments in initial stages of contamination. In conclusion, L. monocytogenes formed biofilms with well defined structures that may contribute to the survival and spread of bacteria in food processing environment. Despite L. monocytogenes do not form a multilayer thick biofilms, adherent cells generally have greater resistance to antimicrobial activity compared to planktonic cells, surviving and persisting on the surface with regulatory mechanisms effective against different types of stress.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-21T13:25:13Z No. of bitstreams: 1 Carine Rosa Naue.pdf: 1778234 bytes, checksum: 87c8b0b79d12b0deec69551209abe1ed (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-21T13:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carine Rosa Naue.pdf: 1778234 bytes, checksum: 87c8b0b79d12b0deec69551209abe1ed (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The introduction and spread of grapevine bacterial canker caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) occurs, among other ways, through plantlets, grapevine cuttings and farming tools. This study aimed to: evaluate the effectiveness of treatments of cuttings to eradicate Xcv using thermotherapy, bactericides and sanitizers; prove the survival of Xcv into thinning shears; and select efficient sanitizers for disinfection of these tools and water used in the production of plantlets. In the first study, the Xcv isolates were tested for pathogenicity and "in vitro" sensitivity to bactericides and sanitizers (streptomycin+oxytetracycline, oxytetracycline+copper sulfate, kasugamycin and oxytetracycline; dodecyldimethyl ammonium chloride, sodium hypochlorite and benzalkonium chloride) at different concentrations. The eradication of Xcv on cuttings was tested in experiments with thermotherapy (50˚C for 30 and 40 min; 53˚C for 5 and 10 min); bactericides oxytetracycline+copper sulphate (150+2000, 165+2200, 180+2400 and 195+2600 mg L-1 of H2O) and oxytetracycline (600, 700, 800 and 900 mg L-1) and sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride (600, 1200, 1800, 2400, 3000 μl L-1) sodium hypochlorite (5000, 10000, 20000, 30000, 40000 μl L-1) and benzalkonium chloride (125, 167, 250, 334, 500 μl L-1). The bactericidal oxytetracycline and sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride and sodium hypochlorite provided the largest zones of inhibition, in vitro. However, it was not possible to recommend an efficient treatment of temperature/time, and concentrations of bactericides or sanitizers, among those tested, capable of eradicating Xcv of infected grapevine cuttings. In the second study, survival was evaluated 0-42 h after dipping the scissors in pathogen suspension. In vitro susceptibility test and initial selection in scissors were performed with the sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride (1200 μl L-1), sodium hypochlorite (20000 μl L-1), benzalkonium chloride (250 μl L-1), sodium dichloroisocyanurate (16.25 mg L-1), calcium hypochlorite (130 mg L-1), calcium oxychloride (97.5 mg L-1) and chlorine dioxide (25 μl L-1). To validate the efficiency of sanitizers for disinfection of scissors the first two products were tested at the same concentrations, and 50 cuts were sequentially made in vine leaves. The controls only with Xcv allow verifying the dissemination ability of Xcv from an inoculum source. The viability of the same sanitizers was studied 0-8 h after solution preparation. Disinfection of water contaminated with Xcv was tested with two bactericidal and three sanitizers. Xcv survived 24 h in thinning shears. Sodium hypochlorite (20000 μl L-1) and dodecyldimethyl ammonium chloride (1200 μl L-1) provided the greatest inhibition halos and disinfested scissors contaminated with Xcv. Solutions of these sanitizers remained viable for 8 h. Xcv was spread by contaminated thinning shears, on average, until the 24th cut. Disinfestation of the water contaminated with Xcv utilized in the plantlets production was obtained by dodecyldimethyl ammonium chloride (600 μl L-1), sodium hypochlorite (5000 μl L-1) and benzalkonium chloride (250 μl L-1). / A introdução e a disseminação do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) ocorre, dentre outras formas, por meio de mudas, bacelos e ferramentas de cultivo. Este trabalho teve como objetivos: avaliar a eficiência dos tratamentos de bacelos de videira para erradicação de Xcv utilizando termoterapia, bactericidas e sanitizantes; comprovar a sobrevivência de Xcv em tesouras de raleio; e selecionar sanitizantes eficientes para a desinfestação destas ferramentas e da água utilizada na produção de mudas. No primeiro trabalho, os isolados de Xcv foram testados quando à patogenicidade e realizado o teste de sensibilidade “in vitro” a bactericidas e sanitizantes (oxitetraciclina+estreptomicina, oxitetraciclina+sulfato de cobre, casugamicina e oxitetraciclina; cloreto de dodecildimetil amônio, hipoclorito de sódio e cloreto de benzalcônio) em diferentes concentrações. A erradicação de Xcv em bacelos de videira foi testada em experimentos com termoterapia (50oC por 30 e 40 min; 53oC por 5 e 10 min); bactericidas [oxitetraciclina+sulfato de cobre (150+2000, 165+2200, 180+2400 e 195+2600 mg L-1 de H2O) e oxitetraciclina (600, 700, 800 e 900 mg L-1)]; e sanitizantes [cloreto de dodecildimetil amônio (600, 1200, 1800, 2400, 3000 μL L-1); hipoclorito de sódio (5000, 10000, 20000, 30000, 40000 μL L-1) e cloreto de benzalcônio (125, 167, 250, 334, 500 μL L-1)]. O bactericida oxitetraciclina e os sanitizantes cloreto de dodecildimetil amônio e hipoclorito de sódio proporcionaram os maiores halos de inibição, in vitro. No entanto, não foi possível recomendar um tratamento termoterápico, bactericida ou sanitizante, dentre os testados, capaz de erradicar Xcv de bacelos de videira infectados. No segundo trabalho, a sobrevivência foi avaliada de 0 a 42 h após imersão das tesouras em suspensão do patógeno. Teste de sensibilidade de Xcv in vitro e seleção inicial em tesouras foram realizados com os sanitizantes cloreto de dodecildimetil amônio (1200 μl L-1), hipoclorito de sódio (20000 μl L-1), cloreto de benzalcônio (250 μl L-1), dicloroisocianurato de sódio (16,25 mg L-1), hipoclorito de cálcio (130 mg L-1), oxicloreto de cálcio (97,5 mg L-1) e dióxido de cloro (25 μl L-1). Para validação da eficiência dos sanitizantes na desinfestação de tesouras, os dois primeiros produtos foram testados nas mesmas concentrações, sendo realizados 50 cortes sequenciais, em folhas de videira. A testemunha com Xcv permitiu verificar a capacidade de disseminação de Xcv a partir da fonte de inóculo. A viabilidade dos sanitizantes foi estudada de 0 a 8 h após o preparo das soluções. Para desinfestação de água contaminada com Xcv foram testados 2 bactericidas e três sanitizantes. Xcv sobreviveu 24 h em tesouras de raleio. Hipoclorito de sódio (20000 μl L-1) e cloreto de dodecildimetil amônio (1200 μl L-1) proporcionaram os maiores halos de inibição e desinfestaram tesouras contaminadas com Xcv. As soluções destes sanitizantes mantiveram-se viáveis por 8 h. Xcv foi disseminada por tesouras de raleio contaminadas, em média, até o 24o corte. A desinfestação da água contaminada com Xcv utilizada na produção de mudas foi obtida pelo uso de cloreto de dodecildimetil amônio (600 μl L-1), hipoclorito de sódio (5000 μl L-1) e cloreto de benzalcônio (250 μl L-1).

Biofilmes de Listeria monocytogenes são fontes potenciais de contaminação de alimentos processados e podem diminuir a efetividade de procedimentos de higienização e sanitização nas indústrias. No presente estudo foi avaliada a estrutura e a dispersão de biofilmes formados por duas cepas de L. monocytogenes em diferentes superfícies, como aço inoxidável, vidro e poliestireno. Foram utilizados diferentes sistemas de cultivo como microplacas de 96 poços de poliestireno e de aço inoxidável, microplacas de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro e, câmaras de poliestireno contendo 8 poços com fundo de borossilicato (vidro). Os experimentos foram realizados com incubação por 1, 4 e 8 dias a 25°C. A formação de biofilme foi verificada em microplacas de 96 de poliestireno e de aço inoxidável através do método de quantificação de biomassa do biofilme por coloração com cristal violeta, e também em sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro, através de enumeração em placa das células aderidas nas superfícies. As estruturas dos biofilmes foram observadas por meio de microscopia de fluorescência (para o sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável) e através de microscopia confocal a laser (para o sistema com câmaras com fundo de vidro). Para isso, os biofilmes foram corados com o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD®, a fim de diferenciar as células viáveis (coradas com Syto 9) das células mortas (coradas com iodeto de propídeo), sendo feitas estimativas do número de células aderidas à superfície de vidro através de quantificação por fluorescência. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de óleos essenciais de plantas de Cymbopogon citratus (capim-limão) e de Zingiber officinale (gengibre) e de dois sanitizantes comerciais (um à base de óleo de coco babaçu e outro à base de dióxido de cloro) frente a L. monocytogenes. Posteriormente, foi testada a eficácia desses antimicrobianos na remoção de biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias a 25ºC, em superfície de aço inoxidável e de vidro, através da enumeração em placas de células aderidas e de observações microscópicas. Foi também avaliada a presença de moléculas relacionadas ao estresse oxidativo e nitrosativo em biofilmes maduros de duas cepas de L. monocytogenes formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, para o estudo do possível efeito do óxido nítrico (NO) exógeno e de inibidores de NO na dispersão de células do biofilme e na alteração dos níveis de expressão de genes de L. monocytogenes relacionados ao estresse oxidativo e nitrosativo (Lmo0990, Lmo0807 e Lmo1485), bem como à regulação do gene de virulência e formação de biofilme (PrfA). Foi verificada a presença de intermediários de oxigênio reativo (ROI - reactive oxygen intermediates) e de intermediários de nitrogênio reativo (RNI - reactive nitrogen intermediates) nos biofilmes de L. monocytogenes com 4 e 8 dias de incubação a 25ºC formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, por meio de marcadores ii fluorescentes específicos e visualizações microscópicas. A fim de confirmar indiretamente a presença de óxido nítrico (NO) em cultivos de L. monocytogenes incubados por 4 e 8 dias a 25ºC, foi realizada a dosagem de nitrito com o emprego do reagente Griess. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) do doador de óxido nítrico como nitroprussiato de sódio (SNP) e dos inibidores de NO como N?-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) e 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina-1-oxi-3-óxido (Carboxi-PTIO sal de potássio, C-PTIO) frente a L. monocytogenes. Foi testada a eficácia do SNP e dos inibidores de NO na remoção de biofilmes pré-formados por 4 e 8 dias de L. monocytogenes em superfície de aço inoxidável. Os resultados deste trabalho demonstraram que o biofilme de L. monocytogenes formado em vidro e em aço inoxidável apresentou uma arquitetura microscópica semelhante a um \"favo de mel\", com presença de canais de água, bem como cavidades de tamanhos variados devido à dispersão de grupos de células planctônicas ou morte celular. A utilização de óleos essenciais e/ou sanitizantes comerciais por 1h em biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias, foi eficaz na redução do número de células aderidas na superfície de aço inoxidável e de vidro. No biofilme de L. monocytogenes foram detectadas moléculas relacionadas ao estresse oxidativo como peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais superóxidos, bem como moléculas de estresse nitrosativo como óxido nítrico (NO) e peroxinitrito. A adição de NO exógeno (por meio do doador SNP) e a adição de inibidores de NO no meio de cultivo não alteraram o crescimento planctônico de L. monocytogenes. Foi observado que a exposição a SNP e a inibidores de NO por 1h em biofilmes de L. monocytogenes pré-formados por 4 e 8 dias, não induziu a dispersão celular. A adição de NO exógeno bem como a remoção de NO do meio de cultura por moléculas inibidoras não alteraram o nível de expressão dos genes Lmo1485, Lmo0990, Lmo0807 e PrfA, em culturas de L. monocytogenes de 8 dias. A utilização de óleos essenciais de plantas e/ou sanitizantes comerciais em biofilmes pré-formados pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de L. monocytogenes em superfícies de manipulação de alimentos, mas a melhor estratégia de controle é impedir a formação de biofilme pelo emprego de tratamentos combinados nos estágios iniciais de contaminação. Em conclusão, L. monocytogenes formou biofilme com estruturas bem definidas que podem contribuir para a sobrevivência e disseminação da bactéria no ambiente de processamento de alimentos. Apesar de L. monocytogenes não formar um biofilme espesso com multicamadas, as células aderidas apresentam geralmente maior resistência à ação dos antimicrobianos em comparação com as células planctônicas, conseguindo sobreviver e persistir na superfície, com mecanismos regulatórios bastante eficientes frente a diferentes tipos de estresse. / Biofilms of Listeria monocytogenes are potential sources of contamination of processed foods, and may interfere in the effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in food industry. In the present study the structures and dispersion of biofilms formed by two strains of L. monocytogenes on different abiotic surfaces, such as stainless steel, glass and polystyrene were evaluated. Different cultivation systems such as polystyrene and stainless steel 96-wells microplates, 24-wells microplates containing round stainless steel or glass slides, and 8-wells polystyrene chambers with borosilicate bottom were used. The experiments were done for 1, 4 and 8 days of incubation at 25°C. Biofilm formation was observed in 96-wells microplates of polystyrene and stainless steel by the quantification of biofilm biomass by staining with crystal violet, and also in 24-wells microplates system with circular slides of stainless steel or glass, with enumeration of adhered cells on agar plates. The structure of biofilms were observed by fluorescence microscopy (for the system of 24-wells microplates containing circular slides of stainless steel) and by confocal laser scanning microscopy (for the system of glass bottom chambers). For this, biofilms were stained with the LIVE/DEAD® bacterial viability kit, in order to differentiate viable cells (stained with Syto 9) from dead cells (stained with propidium iodide). The estimative of the number of viable cells was done by measurement of fluorescence. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oils plants of Cymbopogon citratus (lemon grass) and Zingiber officinale (ginger) and two commercial sanitizers (babassu coconut oil-based sanitizer and chlorine dioxide-based sanitizer) against L. monocytogenes were also determined. Subsequently, the antimicrobials were evaluated against L. monocytogenes biofilms formed by 4 and 8 days at 25°C on the stainless steel and glass surfaces by enumeration on agar plates of adhered cells and microscopic observations. The presence of molecules related to oxidative and nitrosative stresses in mature biofilms of two strains of L. monocytogenes formed on glass and stainless steel surfaces was also evaluated, and the possible role of exogenous nitric oxide (NO) and inhibitors of NO were studied for induction of biofilm dispersal cells and changed of genic expression levels of L. monocytogenes related to oxidative and nitrosative stress genes (Lmo0990, Lmo0807 and Lmo1485), as well as the regulation of virulence and biofilm formation gene (PrfA). The presence of reactive nitrogen intermediates (RNI) and reactive oxygen intermediates (ROI) was investigated in biofilms of L. monocytogenes formed on stainless steel and glass surfaces with 4 and 8 days-old at 25°C, using specific fluorescent dyes and microscopic views. In order to indirectly confirm the presence of nitric oxide (NO) in cultures of L. monocytogenes incubated for 4 and 8 days at 25°C, the dosage of nitrite was carried out with Griess reagent. The minimum inhibitory concentration (MIC) of a nitric oxide donor as sodium nitroprusside (SNP) and two NO inhibitors such as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetrametilimidazoline-1-oxy-3-oxide (Carboxy-potassium salt, C-PTIO), were iv evaluated for L. monocytogenes. It was also determined the effectiveness of SNP and of the two inhibitors of NO to eliminate biofilms of L. monocytogenes preformed for 4 and 8 days on stainless steel surfaces. The results of this work showed that L. monocytogenes biofilms formed on glass and on stainless steel surfaces, presented similar microscopic architectures in a \"honeycomb\" like structure, with water channels and hollows of different sizes, possibly due to cell dispersion or death. The exposure to essential oils and/or commercial sanitizers for 1h for L. monocytogenes biofilms formed for 4 and 8 days was effective in reducing the number of cells adhered on stainless steel and on glass surfaces. In biofilms of L. monocytogenes, molecules were detected related to oxidative stress such as hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide radicals, as well as molecules related to nitrosative stress as nitric oxide (NO) and peroxynitrite. The addition of exogenous NO (SNP) and inhibitors of NO in the culture medium did not inhibit planktonic growth of L. monocytogenes, and exposure to SNP and to inhibitors of NO for 1 h for biofilms of L. monocytogenes preformed by 4 and 8 days did not induce cell dispersion. The addition of exogenous NO and NO removal from the culture medium by inhibitory molecules did not alter the level of expression of Lmo1485, Lmo0990, and PrfA Lmo0807 genes in cultures of 8- days-old of L. monocytogenes. The use of essential oils from plants and/or sanitizing commercial agents on pre-formed biofilms can be an effective alternative in the control of L. monocytogenes in food handling surfaces, but the best control strategy is avoid the biofilm formation by applying combined treatments in initial stages of contamination. In conclusion, L. monocytogenes formed biofilms with well defined structures that may contribute to the survival and spread of bacteria in food processing environment. Despite L. monocytogenes do not form a multilayer thick biofilms, adherent cells generally have greater resistance to antimicrobial activity compared to planktonic cells, surviving and persisting on the surface with regulatory mechanisms effective against different types of stress.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2018-08-13T19:38:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Letícia-Final.pdf: 1670426 bytes, checksum: ab2b251db5406cfbebb79dcc3b6f9add (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-08-16T19:59:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Letícia-Final.pdf: 1670426 bytes, checksum: ab2b251db5406cfbebb79dcc3b6f9add (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T19:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Letícia-Final.pdf: 1670426 bytes, checksum: ab2b251db5406cfbebb79dcc3b6f9add (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O emprego das Boas Práticas de Fabricação na indústria de alimentos, como a higienização de superfícies, é importante para evitar a formação de biofilmes. Campylobacter jejuni, que é o principal agente etiológico da campilobacteriose, pode sobreviver em condições adversas no ambiente pela capacidade de formação de biofilme. As bactérias formadoras de biofilme podem adquirir resistência à compostos utilizados como sanitizantes na etapa de sanitização, como o cloreto de benzalcônio (CB). Assim, faz-se necessário a busca por novos compostos com ação antibacteriana que possam ser utilizados em alternativa aos sanitizantes sintéticos. Os extratos de plantas vêm sendo amplamente estudados devido às suas características antimicrobianas e por serem compostos naturais. O extrato metanólico de Butia odorata Barb. Rodr. (EMB) teve sua ação antibacteriana comprovada em estudos anteriores. Portanto, os objetivos deste estudo foram avaliar a influência da superfície, temperatura, atmosfera e co-cultura com Pseudomonas aeruginosa sobre a formação de biofilme de Campylobacter jejuni isolados de abatedouro de frangos da região sul do Rio Grande do Sul, bem como identificar a presença de alguns genes relacionados à formação de biofilme nesses isolados. Também objetivou-se avaliar a suscetibilidade desses isolados ao EMB e ao CB, através do teste qualitativo de disco difusão em ágar para o EMB, e da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM) para o EMB e para o CB. A atmosfera não afetou a formação de biofilme monoespécie de C. jejuni tanto em poliestireno como em aço inoxidável. Houve maior formação de biofilme em temperaturas que não são as ótimas para a multiplicação d e C. jejuni. A forma como P. aeruginosa foi inoculada para formar biofilmes duoespécie com C. jejuni (concomitante ou pré-formado por P . aeruginosa), não influenciou a formação de biofilme pelos isolados. Nos biofilmes duo-espécie com P. aeruginosa, as maiores contagens de biofilme por C. jejuni em aço inoxidável ocorreram a 25 oC. Os sete isolados de C. jejuni avaliados possuem 10 genes envolvidos no processo de formação de biofilme, porém o gene katA não foi encontrado em três isolados, e o gene kpsM não foi encontrado em um isolado, o que não afetou a formação de biofilme por esses isolados. O EMB apresentou atividade antibacteriana contra os sete isolados no teste qualitativo de disco difusão em ágar, com halos de inibição acima de 23 mm. A CIM do EMB ficou entre 83,3 e 166,6 μL.mL-1, e a CBM foi o mesmo valor de CIM em todos os isolados. Já para o CB, o valor de CIM ficou entre 1 e 2 μg.mL-1, e a CBM variou entre 1 e 4 μg.mL-1 entre os isolados. Dessa forma, o EMB pode tornar-se uma boa alternativa ao CB empregado na etapa de sanitização em indústrias de alimentos. / The employment of good manufacturing practice in the food industry, as surfaces sanitization, is important to avoid the biofilm formation. Campylobacter jejuni, which is the main etiological agent of campilobacteriosis, can survives in adverse environmental conditions by capacity of biofilm formation. Biofilm forming bacteria can acquire resistance to compounds used as sanitizers in sanitization step, such as benzalkonium chloride (BC). Thereby, it is necessary the search for new compounds with antibacterial activity which can be used in alternative to syntetic sanitizers. The plants extracts have been widely studied due to it’s antimicrobial characteristics and for being natural compounds. The Butia odorata Barb. Rodr. methanolic extract (BME) had it’s antibacterial activity proven in studies performed previously. Therefore, the aims of this study were evaluate the factors that influence of surface, temperature, atmosphere and co-culture with Pseudomonas aeruginosa on biofilm formation in Campylobacter jejuni isolated from poultry slaughterhouse of Southern Rio Grande do Sul, Brazil, as well identify the presence of some genes related to biofilm formation in these isolates. Moreover, was aimed to evaluate the susceptibility of these isolates to the BME and to the BC, through the agar disc diffusion qualitative test for BME, and minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) for BME and BC. The atmosphere did not affected the monospecies biofilm formation both in polystyrene and stainless steel. There was greater biofilm formation in temperatures that are not the optimals for C. jejuni growth. The way how P. aeruginosa was inoculated to form dual-species biofilms with C. jejuni (concomitant or preformed by P. aeruginosa) did not influenced the biofilm formation by the isolates. In duo-species biofilms with P. aeruginosa, the higher biofilm counts of C. jejuni in stainless steel occurred at 25 oC. The seven isolates had 10 genes that are involved in biofilm formation process, but the katA gene was not found in three isolates, and the kpsM gene was not observed in one isolate, which did not affected the biofilm formation by these isolates. The BME presented antibacterial activity against the seven C. jejuni isolates tested in the qualitative test of agar disc diffusion, resulting in inhibition halos above of 23 mm. The MIC of BME ranged between 83,3 and 166,6 μL.mL-1, and the MBC was the same value that MIC in all isolates. Already for BC, the MIC value stay between 1 and 2 μg.mL-1, and the MBC value ranged between 1 and 4 μg.mL- 1 among isolates. In this way, the BME can become a good alternative to the BC employed in sanitization step in food industries.