In unserem Institut wurde in vorangegangenen Studien der Nachweis für die Präsenz des Natrium-Glukose-Kotransporters (SGLT-1) im Pansenepithel von Schafen sowohl auf molekularbiologischer als auch auf funktioneller Ebene erbracht. Im Dünndarm von Monogastriern und Wiederkäuern hängt die Aktivität des SGLT-1 im Wesentlichen vom phylogenetischen Ernährungstyp (Wiederkäuer: Konzentrat-selektierer oder Rauhfutterkonsumenten), vom aktuellen Substratangebot und der Beeinflussung durch stoffwechselaktive Hormone ab. Es ist bekannt, dass bei vermehrter Aufnahme leicht verdaulicher Kohlenhydrate die Präsenz des intestinalen SGLT-1 erhöht ist. Eine Stimulation des SGLT-1 durch den intrazellulären Messenger cAMP ist beschrieben. Im Rattendünndarm wurde eine cAMP-vermittelte Erhöhung der Glukoseaufnahme durch pankreatisches Glukagon 29, enterisches Glukagon 37 und Adrenalin nachgewiesen. Die vorliegenden In-vitro- Studien am Pansenepithel waren der Frage gewidmet, inwiefern sich die bisher am Dünndarm untersuchten Regulationswege auf den ruminalen SGLT-1 übertragen lassen. Dies betraf im Einzelnen: - Phylogenetische Unterschiede bei der ruminalen SGLT-1-Aktivität zwischen verschiedenen Ernährungstypen (Schaf, Damwild) - Regulation des SGLT-1 durch kurzfristige Änderungen des Substratangebots - Steigerung der Glukoseaufnahme durch Hormone (Katecholamine u. Glukagon), Die Studien wurden mittels einer modifizierten Ussing-Kammer-Technik durchgeführt. Von Schafen und Damwild wurde die Tunica mucosa der Pansenepithelien präpariert und in Ussing-Kammern inkubiert. Nach einer einminütigen mukosalen Inkubation mit D-Glukose (einschließlich 14C-markierter Glukose) erfolgte die Bestimmung der Glukosekonzentration im Epithelzelllysat mittels Szintillationszählung der radioaktiv markierten Glukose. Der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Glukoseaufnahme wurde durch entsprechende Vorinkubation untersucht. Es konnten folgende Befunde erhoben werden: - Die ruminale Glukoseaufnahme bei einer mukosalen Glukosekonzentration von 200 µM erfolgt bei Schafen zu ca. 60 % über den SGLT-1, bei Damwild betrug dieser Anteil nur etwa 25 %. - Eine mehrstündige Erhöhung des mukosalen Glukoseangebotes auf 10 mM resultierte in einer ca. 50%igen Steigerung der SGLT-1-vermittelten Glukoseaufnahme beim Schaf. - Die Hormone Glukagon 37 und Adrenalin bewirkten am Schafspansen eine deutliche Steigerung der SGLT-1-vermittelten Glukoseaufnahme. Glukagon 29 hatte einen geringen Effekt, während Noradrenalin die Glukoseaufnahme nicht nachweisbar beeinflusste. - Im Rahmen einer detaillierteren Charakterisierung des Adrenalineffektes konnte eine Stimulation des SGLT-1 auch durch den -Rezeptoragonist Isoproterenol und den 2-spezifischen Agonisten Terbutalin ausgelöst werden. Andere rezeptorspezifische Agonisten (alpha-1, alpha-2, beta-1 und beta-3) hatten keinen Einfluss. Schlussfolgernd lässt sich postulieren, dass der SGLT-1 bei Schafen der bedeutendste Transportmechanismus für die ruminale Glukoseaufnahme ist und bei Damwild im Gegensatz zu den vom Dünndarm bekannten Verhältnissen eine untergeordnete Rolle spielt. Eine Steuerung ist ähnlich wie im Dünndarm sowohl durch erhöhtes Glukoseangebot als auch durch Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration möglich. Die Hormone Adrenalin und Glukagon 37 stimulieren die Glukoseaufnahme in den getesteten Konzentrationen signifikant. Der Signalweg der Adrenalin-vermittelten Stimulation verläuft über Aktivierung der Adenylatzyklase und Proteinkinase A. Dafür scheint ein beta-2-Rezeptor im Pansenepithel verantwortlich zu sein. Die praktische Relevanz der untersuchten Stimulierbarkeit des SGLT-1 könnte in vivo in der schnellen Entfernung überschüssiger Glukosemengen aus dem Vormagen liegen, um eventuell einer bakteriellen Dysfermentation im Pansen entgegenzusteuern. / Recent studies evidenced the presence of the sodium / glucose cotransporter, SGLT-1, in ruminal epithelia of sheep and showed its ability to absorb glucose. Concerning the possibility of regulation of SGLT-1, the influence of substrate concentration has been reported in other tissues. There are phylogenetic adaptions according to the feeding habits of different ruminants (grass and roughage consumer, intermediate mixed feeder and concentrate selectors) and the possibility to short-term adaption in response to the availability of easely fermentable carbohydrates. Furthermore, some hormones are known to stimulate glucose uptake. The important role of cyclic AMP (cAMP) as an intracellular mediator and stimulator of glucose uptake is well described. There is evidence for the influence of hormones stimulating the SGLT-1 by rising the cAMP level. Stimulation of intestinal glucose uptake occured after preincubation with pancreatic glucagon (glucagon 29), enteric glucagon (glucagon 37) and epinephrine in the rat small intestine. To proove whether the regulatory priciples of the intestinal SGLT-1 apply also to the SGLT-1 in the ruminant forestomach, the heredescribed studies addressed the following topics: -Quantification of SGLT-1-mediated glucose uptake in the rumen of ruminants with different feeding habits (sheep vs. fallow deer) -Short-term regulation of glucose uptake by substrate availability -Modulation of glucose uptake by hormones with stimulatory effects on cAMP level Glucose uptake studies were performed in vitro using a modified Ussing chamber technique. Ruminal epithelia were incubated on the mucosal side with glucose (including 50 kBq 14C-glucose) for 1 min. Glucose content of the lysed epithelia was measured by scintillation counting. The influence of certain substances on glucose uptake was investigated by preincubation with these substances either on the serosal, mucosal or both sides of the epithelia. RESULTS - Ruminal glucose absorption in sheep is mediated to approximately 60 % by SGLT-1, whereas the SGLT-1 of fallow deer transports only 25 % of the glucose (at a mucosal glucose concentration of 200 µM). - After mucosal preincubation with 10 mM glucose for several hours, the SGLT-1-mediated glucose uptake of sheep rumen raised up to 150 %. - The hormones glucagon 37 and epinephrine increased SGLT-1-mediated glucose transport in the sheep rumen. A minor stimulation was also observed after addition of glucagon 29, whereas norepinephrine had no effect on glucose uptake. - The effect of epinephrine was characterized in detail. It could be simulated by using the beta-receptoragonist isoproterenol as well as the beta-2-receptor agonist terbutaline. No effect was observed with alpha-1-, alpha-2-, beta-1- and beta-3-receptor agonists. These results lead to the following conclusions: SGLT-1 is the most important transport mechanism for ruminal glucose uptake in sheep. In contrast to the high SGLT-1-activity in the intestine of fallow deer, there is only a minor relevance in the rumen of this species. A fast significant stimulation of the ruminal SGLT-1 of sheep in vitro is possible by rising glucose supply and serosal addition of epinephrine and glucagon 37 in the tested concentrations. Glucagon 29 and norepinephrine had no effect on SGLT-1 under the used experimental conditions. The intracellular signalling of the epinephrine action involves the pathway via adenylate cyclase and protein kinase A. The investigated effect of epinephrine is mediated by beta-2-adrenoceptors. The priciples of regulation of the ruminal SGLT-1 are similar to the intestine. Perhaps, in vivo, up-regulation of glucose absorption by substrates and hormones is important for a fast removal of excess glucose from rumen to prevent dysfermentation.

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Alexandra Flocke Untersuchung von Stoffwechselparametern und Lipoproteinen im Blutserum von einlings- und zwillingsträchtigen Merino- und Schwarzköpfigen Fleischschafen im peripartalen Zeitraum Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2012 (94 Seiten, 15 Abbildungen, 8 Tabellen, 199 Literaturangaben, 12 Tabellen im Anhang) Schlüsselwörter: Lipoproteine, Schaf, Stoffwechsel, Endotoxin, Ketose Problemstellung: Der Lipoproteinstatus in der kritischen Phase der Hochträchtigkeit wurde beim Schaf bisher nur wenig untersucht. Die Fähigkeit der Lipoproteine, sowohl Lipide zu transportieren und im Körper umzuverteilen, als auch ihre Rolle in der Endotoxinneutralisation machen sie zu einem wichtigen Parameter in stoffwechselbelasteten Situationen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Lipoproteinstatus zweier verschiedener Leistungsrassen zu analysieren und zu prüfen, ob und inwiefern peripartal Unterschiede bei Ein- und Zwillingsträchtigkeiten bestehen. Zusätzlich werden die Endotoxine der Tiere bestimmt und mögliche Zusammenhänge mit der Stoffwechselsituation und dem Lipoproteinstatus evaluiert. Tiere, Material und Methoden: Untersucht wurden gesunde einlingsträchtige Merinofleischschafe (MFS1), zwillingsträchtige Merinofleischschafe (MFS2) sowie zwillingsträchtige Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF2). Im Abstand von je sieben Tagen wurden den Tieren im Zeitraum von der 5. Woche a.p. bis eine Woche p.p. Blutproben aus der V. jugularis externa entnommen. Aus dem Serum wurden die Konzentrationen von β-Hydroxybutyrat (BHB), Glucose, Freie Fettsäuren (FFS), Triacylglycerol (TG), Cholesterol, Bilirubin, Gesamtprotein (alle Hitachi 912), Insulin (RIA-Kit, Firma IBL, Hamburg), α- und β-Lipoproteine (LIPIDOPHOR All In12®, - ohne prä-β-Lipoproteine), freies Endotoxin (LAL-Test) und Anti-Lipid A Antikörper (ALAAK; ELISA) bestimmt. Ergebnisse: Die α-Lipoproteinkonzentration stieg bei den MFS1 vor dem Ablammen signifikant an und erreichte eine Konzentration von = 208,0 ± 40,1 mg/dl (1. Woche a.p.). Die MFS2 wiesen vor dem Lammen einen konstanten Verlauf zwischen = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5. Woche a.p.) und = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3. Woche a.p.) auf. Die SKF2 zeigten in der 5. Woche a.p. mit = 206,5 ± 39,0 mg/dl eine größtenteils signifikant höhere Konzentration gegenüber den folgenden Untersuchungszeitpunkten. Bei beiden Rassen ließ sich bei den Zwillingsmuttern nach dem Lammen ein signifikanter Abfall der α-Lipoproteinkonzentration auf = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) bzw. = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) feststellen. Es bestand eine gesicherte Korrelation zu Cholesterol. Die β-Lipoproteinkonzentration lag in der 1. Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern (MFS2 und SKF2) signifikant niedriger als vor dem Lammen. Die SKF2 wiesen in der 5. und 4. Woche a.p. signifikant niedrigere Konzentrationen als die MFS1 auf. Gesicherte Korrelationen bestanden zu TG, Cholesterol und ALAAK (MFS1). Für die α-Lipoproteinkonzentration wurde ein Referenzbereich von 144,3 – 208,0 mg/dl und für die β-Lipoproteinkonzentration von 13,6 – 28,0 mg/dl bei Muttertieren der beschriebenen Rassen ermittelt. Ausgenommen die Insulinkonzentration in der 1. Woche a.p. bestanden keine signifikanten Differenzen zwischen MFS1 und MFS2. Im Vergleich der Rassen zeigten sich signifikante Differenzen in der Glucosekonzentration in der 2. Woche a.p. und in der Konzentration von Bilirubin in der 3. und 1. Woche a.p.. Die BHB-Konzentration zeigte einen konstanten Verlauf und stieg bei den MFS1 bis auf = 0,96 ± 0,36 mmol/l eine Woche p.p., bei den MFS2 auf = 0,73 ± 0,35 mmol/l und bei den SKF2 auf = 0,63 ± 0,14 mmol/l eine Woche a.p. signifikant an. Gesicherte Korrelationen bestanden zu FFS (MFS2) und Insulin (MFS2; SKF2). Die Glucosekonzentration zeigte sich bei den Zwillingsmuttern nach zunächst abfallenden Konzentrationen in der Hochträchtigkeit eine Woche p.p. signifikant höher ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 und = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2) als vor dem Lammen. Gesicherte Korrelationen ließen sich zu FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) und dem Zeitpunkt der Untersuchung (MFS2; SKF2) feststellen. Die FFS-Konzentration stieg bei den SKF2 zur 1. Woche a.p. auf = 265 ± 131 μmol/l an, fiel eine Woche p.p. signifikant auf = 128 ± 95 μmol/l ab und korrelierte gesichert mit TG. Die TG-Konzentration fiel von der 1. Woche a.p. bis zur 1. Woche p.p. signifikant auf = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) bzw. = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2) ab und korrelierte mit Gesamtprotein (MFS1), Cholesterol (MFS1; MFS2), β-Lipoproteinen (MFS1; MFS2) und freiem Endotoxin (MFS1). Die Cholesterolkonzentration fiel eine Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern signifikant ab, bei den MFS1 war der Verlauf konstant. Die Bilirubinkonzentration stieg eine Woche p.p. signifikant an (MFS1; MFS2) und korrelierte mit der Konzentration von freiem Endotoxin. Das Gesamtprotein sank zum Zeitpunkt des Ablammens hin signifikant ab, erreichte jedoch eine Woche p.p. wieder seine Ausgangskonzentration. Eine gesicherte Korrelation konnte mit ALAAK festgestellt werden (MFS2; SKF2). Freies Endotoxin konnte zu jedem Zeitpunkt der Untersuchungsreihe nachgewiesen werden. Dabei lagen die festgestellten Konzentrationen bei x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. Eine gesicherte Korrelation fand sich mit der Konzentration der ALAAK (MFS2). ALAAK konnten ebenfalls zu jedem Zeitpunkt in Konzentrationen von x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-Wert) nachgewiesen werden. Fazit: Die Lipoproteinkonzentrationen in den einzelnen Gruppen zeigten sich a.p. zunächst regulativ den erhöhten peripartalen Belastungen des Lipidstoffwechsels angepasst, p.p. demonstrierte auch die Abnahme der Lipoproteinkonzentrationen das Ende der lipolytischen Aktivität bei den Schafen. Die vorliegenden Ergebnisse der Stoffwechselparameter lassen auf eine stärkere Belastung der Zwillingsmuttern schließen, welche auch die Lipoproteine mit einbezieht. Freies Endotoxin konnte auch bei gesunden Schafen zwar zu jedem Zeitpunkt nachgewiesen, eine gesicherte Korrelation mit der Lipoproteinkonzentration jedoch nicht festgestellt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Physiologische Gravidität des Schafes 4 2.2 Stoffwechsel von Mutterschafen in der Hochträchtigkeit 5 2.3 Stoffwechselparameter 6 2.3.1 β-Hydroxybutyrat 6 2.3.2 Glucose 7 2.3.3 Insulin 10 2.3.4 Freie Fettsäuren 12 2.3.5 Triacylglycerol 13 2.3.6 Cholesterol 14 2.3.7 Bilirubin 15 2.3.8 Gesamtprotein 17 2.4 Lipoproteine 18 2.4.1 Definition von Lipoproteinen 18 2.4.2 Stoffwechsel der Lipoproteine 21 2.4.2.1 Chylomikronen 21 2.4.2.2 Very-Low-Density-Lipoproteins 22 2.4.2.3 Low-Density-Lipoproteins 23 2.4.2.4 High-Density-Lipoproteins 24 2.4.3 Besonderheiten der Lipoproteine beim Schaf 24 2.5 Endotoxin 27 2.5.1 Definition von Endotoxin 27 2.5.2 Aufbau von Endotoxin 27 2.5.3 Herkunft und Wirkung des Endotoxins 28 2.5.4 Inaktivierung und Elimination des Endotoxins 29 2.5.5 Beziehung zwischen Endotoxin und Fettstoffwechsel 30 3 Tiere, Material und Methoden 32 3.1 Versuchsgut 32 3.2 Versuchsanordnung 33 3.3 Material 34 3.4 Methodik 34 3.4.1 Gesundheitszustand der Versuchsgruppen 34 3.4.2 Bestimmungsmethoden klinisch-chemischer Parameter 34 3.4.3 Bestimmung der Lipoproteine 35 3.4.4 Bestimmung von freiem Endotoxin 37 3.4.5 Bestimmung von Anti-Lipid A Antikörpern 38 3.5 Statistische Auswertung 39 4 Ergebnisse 41 4.1 Tierbestand 41 4.2 Stoffwechselparameter 41 4.2.1 β-Hydroxybutyrat 41 4.2.2 Glucose 44 4.2.3 Insulin 46 4.2.4 Freie Fettsäuren 48 4.2.5 Triacylglycerol 50 4.2.6 Cholesterol 52 4.2.7 Bilirubin 54 4.2.8 Gesamtprotein 56 4.3 Lipoproteine 58 4.3.1 α-Lipoproteine 58 4.3.2 ß-Lipoproteine 60 4.4 Endotoxin 62 4.5 Anti-Lipid A Antikörper 64 5 Diskussion 66 5.1 Versuchsprinzip 66 5.2 Tiere und Versuchsbedingungen 66 5.3 Methodenkritik 67 5.4 Stoffwechselparameter 68 5.4.1 β-Hydroxybutyrat 68 5.4.2 Glucose 71 5.4.3 Insulin 72 5.4.4 Freie Fettsäuren 74 5.4.5 Triacylglycerol 76 5.4.6 Cholesterol 78 5.4.7 Bilirubin 79 5.4.8 Gesamtprotein 81 5.5 Lipoproteine 83 5.5.1 α-Lipoproteine 83 5.5.2 β-Lipoproteine 86 5.6 Endotoxin 87 5.7 Anti-Lipid A Antikörper 89 6 Zusammenfassung 91 7 Summary 93 8 Literaturverzeichnis 95 9 Anhang 116 9.1 Stoffwechselparameter 116 9.1.1 β-Hydroxybutyrat 116 9.1.2 Glucose 117 9.1.3 Insulin 118 9.1.4 Freie Fettsäuren 119 9.1.5 Triacylglycerol 120 9.1.6 Cholesterol 121 9.1.7 Bilirubin 122 9.1.8 Gesamtprotein 123 9.2 Lipoproteine 124 9.2.1 α-Lipoproteine 124 9.2.2 β-Lipoproteine 125 9.3 Endotoxin 126 9.4 Anti-Lipid A Antikörper 127 / Alexandra Flocke Evaluation of metabolic parameters and lipoproteins in the serum of merino and blackhead sheep for meat production with one or two lambs in the peripartal period Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2012 (94 pages, 15 figures, 8 tables, 199 references, 12 tablets in the appendix) Keywords: lipoproteins, sheep, metabolism, endotoxin, ketosis Objective: The lipoprotein status in the critical phase of the peripartal period of sheep has been few reviewed. The ability of lipoproteins to transport and redistribute lipids in the organism and their capacity for endotoxinneutralisation makes them a considerable parameter in metabolic bonded situations. The objective of this research is to show the lipoprotein status of two competitive breeds and to proof if and to what extend differences between ewes with one and two lambs exist. Additionally, the endotoxic situation is assigned and possible correlations with the metabolic system and the lipoprotein status are evaluated. Animals, materials and methods: The research contains healthy merino sheep with one lamb (MFS1), merino sheep with two lambs (MFS2) and blackhead sheep with two lambs (SKF2). At intervals of seven days, blood samples out of the V. jugularis externa were taken from the animals in a period from the 5th week a.p. to one week p.p.. Concentrations in the serum of the following parameters were defined: β-hydroxybutyrat (BHB), glucose, free fatty acids (FFS), triacylglycerol (TG), cholesterol, bilirubin, total protein (all Hitachi 912), insulin (RIA-kit, IBL, Hamburg), α- and β-lipoprotein (LIPIDOPHOR All In12® - without pre-β-lipoprotein), free endotoxin (LAL-test) and anti-lipid A antibodies (ALAAK). Results: The concentration of α-lipoproteins of the MFS1 increased significantly before parturition and finally reached 208,0 ± 40,1 mg/dl (1st Week a.p.). The group of MFS2 showed a constant deviation between = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5th Week a.p.) and = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3rd week a.p.) before parturition. The SKF2 evidenced with a concentration of = 206,5 ± 39,0 mg/dl in the 5th week a.p. a predominantly significant higher result as during following points in time. Both groups carrying twins showed a significant decrease of the α-lipoprotein concentration down to = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) or = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) after parturition. There were statistically reliable correlations between the α-lipoprotein concentration and cholesterol. The β-lipoprotein concentration from both twin pregnant groups had been significantly lower one week after parturition than before parturition. The results of the SKF2 in week 5 and 4 a.p. were significantly lower than those of the MFS1. Reliable correlations could be determined with TG, cholesterol and ALAAK (MFS1). An α-lipoprotein reference range for ewes of the introduced breeds could be determined from 144,3 - 208,0 mg/dl and for β-lipoproteins from 13,6 - 28,0 mg/dl. There were no significant differences between MFS1 and MFS2 except the concentration of insulin in the 1st week a.p.. In the comparison of the different breeds, significant differences in the concentration of glucose (2nd week a.p.) and bilirubin (3rd week a.p. and 1st week a.p.) could be shown. The concentration of BHB showed a constant deviation and increased significantly to = 0,96 ± 0,36 mmol/l (MFS1; 1st week p.p.), = 0,73 ± 0,35 mmol/l (MFS2, 1st week a.p.) or = 0,63 ± 0,14 mmol/l (SKF2, 1st week a.p.), respectively. Reliable correlations existed with FFS (MFS2) and insulin (MFS2; SKF2). The concentration of glucose of the twin pregnant ewes decreased initially before parturition and increased significantly again in the 1st week p.p. ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 and = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2). Reliable correlations had been determined with FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) and the time of sampling (MFS2; SKF2). Concentrations of FFS increased in the group of SKF2 to = 265 ± 131 μmol/l in the 1st week a.p., decreased again significantly to = 128 ± 95 μmol/l one week p.p. and showed a correlation with TG. The TG concentration decreased significantly from one week a.p. to one week p.p. down to = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) and = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2), respectively. A reliable correlation existed between TG and total protein (MFS1), cholesterol (MFS1; MFS2), β-lipoproteins (MFS1; MFS2) and free endotoxin (MFS1). Both twin pregnant groups had a significant decrease in the cholesterol concentration one week after parturition, in contrast the group of MFS1 showed a constant deviation. The concentration of bilirubin increased significantly one week p.p. (MFS1; MFS2) and showed a reliable correlation with the concentration of free endotoxin. Total protein decreased significantly towards parturition, but reached its initial concentration again one week p.p.. A statistically reliable correlation could be determined with ALAAK (MFS2; SKF2). Free endotoxin could be detected at any point of the exploration. The observed concentrations ranged from x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. A reliable correlation could be shown with the concentration of ALAAK (MFS2). ALAAK was detected as well in concentrations from x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-value) in any taken sample. Conclusion: The lipoprotein concentrations in each group appeared a.p. initially adapted to the peripartal bonds of the increased lipid metabolism. After parturition, the decrease in lipoprotein concentrations, too, demonstrated the end of the lipolytic activity of the ewes. The results of the metabolic parameters lead to the conclusion of a stronger liability of the ewes with twins. This is also valid for the lipoproteins. Free endotoxin could be detected in healthy sheep at any time, but a reliable correlation with the concentration of lipoproteins was not visible.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Physiologische Gravidität des Schafes 4 2.2 Stoffwechsel von Mutterschafen in der Hochträchtigkeit 5 2.3 Stoffwechselparameter 6 2.3.1 β-Hydroxybutyrat 6 2.3.2 Glucose 7 2.3.3 Insulin 10 2.3.4 Freie Fettsäuren 12 2.3.5 Triacylglycerol 13 2.3.6 Cholesterol 14 2.3.7 Bilirubin 15 2.3.8 Gesamtprotein 17 2.4 Lipoproteine 18 2.4.1 Definition von Lipoproteinen 18 2.4.2 Stoffwechsel der Lipoproteine 21 2.4.2.1 Chylomikronen 21 2.4.2.2 Very-Low-Density-Lipoproteins 22 2.4.2.3 Low-Density-Lipoproteins 23 2.4.2.4 High-Density-Lipoproteins 24 2.4.3 Besonderheiten der Lipoproteine beim Schaf 24 2.5 Endotoxin 27 2.5.1 Definition von Endotoxin 27 2.5.2 Aufbau von Endotoxin 27 2.5.3 Herkunft und Wirkung des Endotoxins 28 2.5.4 Inaktivierung und Elimination des Endotoxins 29 2.5.5 Beziehung zwischen Endotoxin und Fettstoffwechsel 30 3 Tiere, Material und Methoden 32 3.1 Versuchsgut 32 3.2 Versuchsanordnung 33 3.3 Material 34 3.4 Methodik 34 3.4.1 Gesundheitszustand der Versuchsgruppen 34 3.4.2 Bestimmungsmethoden klinisch-chemischer Parameter 34 3.4.3 Bestimmung der Lipoproteine 35 3.4.4 Bestimmung von freiem Endotoxin 37 3.4.5 Bestimmung von Anti-Lipid A Antikörpern 38 3.5 Statistische Auswertung 39 4 Ergebnisse 41 4.1 Tierbestand 41 4.2 Stoffwechselparameter 41 4.2.1 β-Hydroxybutyrat 41 4.2.2 Glucose 44 4.2.3 Insulin 46 4.2.4 Freie Fettsäuren 48 4.2.5 Triacylglycerol 50 4.2.6 Cholesterol 52 4.2.7 Bilirubin 54 4.2.8 Gesamtprotein 56 4.3 Lipoproteine 58 4.3.1 α-Lipoproteine 58 4.3.2 ß-Lipoproteine 60 4.4 Endotoxin 62 4.5 Anti-Lipid A Antikörper 64 5 Diskussion 66 5.1 Versuchsprinzip 66 5.2 Tiere und Versuchsbedingungen 66 5.3 Methodenkritik 67 5.4 Stoffwechselparameter 68 5.4.1 β-Hydroxybutyrat 68 5.4.2 Glucose 71 5.4.3 Insulin 72 5.4.4 Freie Fettsäuren 74 5.4.5 Triacylglycerol 76 5.4.6 Cholesterol 78 5.4.7 Bilirubin 79 5.4.8 Gesamtprotein 81 5.5 Lipoproteine 83 5.5.1 α-Lipoproteine 83 5.5.2 β-Lipoproteine 86 5.6 Endotoxin 87 5.7 Anti-Lipid A Antikörper 89 6 Zusammenfassung 91 7 Summary 93 8 Literaturverzeichnis 95 9 Anhang 116 9.1 Stoffwechselparameter 116 9.1.1 β-Hydroxybutyrat 116 9.1.2 Glucose 117 9.1.3 Insulin 118 9.1.4 Freie Fettsäuren 119 9.1.5 Triacylglycerol 120 9.1.6 Cholesterol 121 9.1.7 Bilirubin 122 9.1.8 Gesamtprotein 123 9.2 Lipoproteine 124 9.2.1 α-Lipoproteine 124 9.2.2 β-Lipoproteine 125 9.3 Endotoxin 126 9.4 Anti-Lipid A Antikörper 127

Die Inzidenz von neurodegenerativen Erkrankungen und Schlaganfällen steigt in Folge der Überalterung der westlichen Gesellschaft immer weiter an. Die Behand-lung von Schlaganfall-, Alzheimer und Parkinsonpatienten ist bisher aber meist unbefriedigend bzw. weitgehend erfolglos. Ein neues Modell in der Schlaganfallforschung wurde daher am Schaf entwickelt. In diesem wird auch der in den letzten zwei Jahrzehnten verstärkt verfolgte zelltherapeutische Ansatz untersucht (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). Neurale Vorläuferzellen gelten dabei, auf Grund ihrer wichtigen Rolle bei den endogenen Reparaturmechanismen nach einem Schlaganfall, als besonders vielversprechend. Die Gewinnung dieser Zellen für eine autologe Transplantation ist jedoch aufwendig und nur eingeschränkt möglich. Im Vergleich zu Nervengewebe stellt die Haut eine sowohl beim Tier als auch beim Menschen leicht zugängliche und in ausreichendem Maß verfügbare Quelle verschiedener Stamm- und Vorläuferzellen dar. Bei verschiedenen Spezies wurde die Isolation spezieller, dermaler Vorläuferzellen beschrieben, die als skin-derived precursor cells (SKPs) bezeichnet werden. SKPs wiesen dabei ein ähnliches Differenzierungspotential auf wie neurale Vorläuferzellen (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). Ein Einsatz der SKPs in der Schlaganfalltherapie wäre somit denkbar, muss aber zunächst im Schafmodell erforscht werden. SKPs wurden jedoch noch nicht bei der Spezies Schaf isoliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ein Isolationsprotokoll für SKPs aus der ovinen Dermis zu etablieren und diese morphologisch und immunzytologisch zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene in der Literatur beschriebene Isolati-onsverfahren an ovinen Hautproben getestet und modifiziert. Es wurden verschiedene Körperregionen auf ihre Eignung zur Probenentnahme und zur anschließenden Isolierung untersucht. Des Weiteren wurde der Effekt einer Rasur eine Woche vor Exzision des Hautareals auf die Sphäroidbildung überprüft. Der Einsatz von Enzymen in Kombinationslösungen oder singulär wurde variiert und eine unterschiedlich intensive mechanische Aufbereitung der Proben durchgeführt. Der Erfolg der zwei vielversprechendsten Isolationsprotokolle wurde statistisch validiert. Außerdem wurde der Effekt einer initialen Fibronektinbeschichtung analysiert. Die von den isolierten Zellen gebildeten sphärenartigen Zellaggregate wurden unter morphologischen Gesichtspunkten sechs und neun Wochen nach Isolation ausgewertet. Dabei wurden die Anzahl der Sphäroide/cm², die Größe und die Form berücksichtigt. Des Weiteren erfolgte eine immunzytologische Analyse der Sphäroide mit Fokus auf das in der Literatur beschriebene Expressionsmuster von SKPs und neuralen Vorläuferzellen. Für die Isolation von ovinen SKPs erwies sich die Regio nasofrontalis als das geeignetste Hautareal. Dabei war die Isolation eine Woche nach Rasur des beprobten Areals zuverlässiger als ohne diese. Bei vergleichender Betrachtung der Methoden erwies sich ein enzymatisch orientiertes Isolationsverfahren modifiziert nach FERNANDES und MILLER (2009) als zielführend. Neben einer hohen Anzahl an isolierten Zellen erfolgte in jedem Versuchsdurchgang eine Zusammenlagerung der Zellen in frei flotierenden Aggregaten. Diese waren im Median 70,97 µm groß. Auf Grund ihrer Geometrie ist es korrekter sie als Sphäroide und nicht, wie bei anderen Spezies üblich, als Sphären zu bezeichnen. Eine anfängliche Beschichtung der Zellkulturplatten mit Fibronektin hatte keinen fördernden Effekt auf die Bildung und die Größe der Sphäroide. Lediglich eine anfänglich höhere Proliferationsrate war bemerkbar. Immunzytologisch konnte gezeigt werden, dass in den Sphäroiden eine heterogene Zellpopulation vorlag. Die Sphäroide wurden überwiegend von Zellen gebildet, in denen neben mesenchymalen Markern auch klassische Vorläuferantigene wie Nestin und Sox2 nachgewiesen wurden. Das immunzytologische Expressionsmuster ist damit vergleichbar mit dem von SKPs anderer Spezies. Außerdem wurden in unterschiedlicher Ausprägung Antigene detektiert, die typischerweise in neuralen Vorläuferzellen der ventrikulären und subventrikulären Zone vorkommen. Dies konnte auch in den Positivkontrollen für das ovine Gehirn bestätigt werden. Die Anzahl proliferierender Zellen in den Sphäroiden war relativ gering und die Anzahl an kokultivierter Keratinozyten minimal. Die Zusammenfassung der heterogenen Vorläuferzellpopulation unter dem Begriff skin-derived precursor cells ist auf Grund ihres dermalen Ursprungs und ihrer morphologischen und immunzytologischen Eigenschaften gerechtfertigt. Somit ist es in dieser Arbeit gelungen, zum ersten Mal SKPs aus der ovinen Dermis zu isolieren und über neun Wochen zu kultivieren. Es wurde ein Isolationsprotokoll entwickelt, das eine Sphäroidbildung reproduzierbar ermöglicht und an die Gegebenheiten beim Schaf angepasst ist. Bevor eine autologe Transplantation von diesen SKPs etwa im Schlaganfallmodell am Schaf vorgenommen werden kann, ist eine intensivere Untersuchung der isolierten Zellen etwa mittels PCR durchzuführen und eine fluoreszenzbasierte Zellsortierung der heterogenen Vorläuferzellen zu entwickeln. / In consequence of the demographic changes in modern western society, the inci-dence of neurodegenerative diseases and stroke is increasing. Unfortunately, there is still no successful or at least satisfactory treatment available for patients who suffer from stroke Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Therefore, a new animal model in stroke research has been established in sheep (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). First cell therapy studies have already been performed in this model. Especially neural precursor cells seem to be promising as they play an important role in endogenous repair processes in the brain after stroke. However, the extraction of these cells prior to an autologous transplantation is elaborate and of limited success. Compared to neural tissue, skin is an easily accessible and sufficiently available source of a variety of stem and precursor cells in animals as well as in humans. Thus, the isolation of a specific type of dermal precursor cells, called skin-derived precursor cells (SKPs), seems to be easier compared to neural precursor cells and in vitro SKPs are capable of neural differentiation as well (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). According to these findings, a therapeutic application of SKPs after stroke seems to be promising. Prior to that, however, intensive studies in the ovine stroke model are necessary. Thus, SKPs have to be isolated from the dermis of sheep for an autologous transplantation. Therefore, the aim of this dissertation has been the establishment of an optimal isolation protocol for SKPs from the ovine dermis as well as the morphological and by immunocytochemical characterisation of those cells. Within this study, several previously described isolation protocols were modified for ovine skin. Skin samples were taken from several body regions to assess the local suitability for excision and isolation. Additionally, the effect of shaving the areas one week before sampling on spheroid forming was tested. A variety of enzymes was used alone and in combination. Furthermore, the effectiveness of an isolation protocol using enhanced mechanical treatment was analysed. The two most promising protocols were evaluated statistically and compared to each other. In these experiments, the influence of an initial fibronectin coating was determined as well. The isolated cells formed spheroids, which were assessed after six and nine weeks of cultivation considering the amount of spheroids per cm², their size and form. Moreover, immunocytochemical tests were conducted, focusing on expression patterns described for SKPs and neural precursor cells. According to these experiments, it is advisable to take skin samples from the naso-frontal region one week after shaving. Comparing all tested protocols, a predominantly enzymatic isolation protocol modified according to FERNANDES and MILLER (2009) was most successful. A high cell yield was achieved and free-floating spheroids formed spontaneously in all test runs. The median diameter of these spheroids was 70.97 µm. Due to their three-dimensional shape, it is more correct to use the term “spheroid” instead of the commonly used term “sphere”. Growing the isolated cells initially on fibronectin coated culture plates does not support both formation and size of the spheroids. Only a higher cell proliferation at the beginning of cultivation can be noticed. Immunocytochemical assays demonstrated that the formed spheroids consisted of a heterologous cell population. Besides mesenchymal antigens the cells in the spheroids expressed characteristic antigens of precursor cells, like Nestin and Sox2. Thus, the immunocytochemical expression pattern is comparable to SKPs isolated from other species. Furthermore, common markers of neural precursor cells of the ventricular and subventricular zone, whose existence in the ovine brain was also proven in this study, were detected in the spheroid forming cells. There were only a few proliferating cells and a minimal amount of keratinocytes in the spheroids. Due to the dermal origin and the given morphological and immunocytochemical characteristics, the heterogeneous cell population can be addressed by the term “skin-derived precursor cells”. In conclusion, in this study ovine SKPs were isolated for the first time and cultured successfully over nine weeks. An isolation protocol was established, which guarantees reproducible formation of spheroids in cell isolates from ovine dermis. Further intensive examinations of the isolated cells, for example using PCR, have to be conducted before SKPs can be applied in autologous transplantation in the ovine stroke model. Additionally, the usage of fluorescence-activated cell sorting of the heterogeneous precursor cells should be considered.

Stoffwechsel und antioxidativer Status bei Merinofleischschafen im peripartalen Zeitraum Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2010 (99 Seiten, 28 Abbildungen, 38 Tabellen, 357 Literaturangaben) Problem- und Zielstellung: Dem antioxidativen System wird im Rahmen von Stoffwech-seluntersuchungen bei Schafen nur wenig Bedeutung geschenkt, jedoch gewinnt es als Schutz- und Regulationssystem zunehmend an Bedeutung. Besonders die Trächtigkeit und die Frühlaktation bei Mutterschafen sowie die postnatale Entwicklung der Lämmer stellen enorme Anforderungen an die Energieversorgung und an das antioxidative System. Das Ziel dieser Arbeit ist, die Bewältigung dieser Anforderungen darzustellen und zu zei-gen, ob und wie stark Zwillingsträchtigkeiten ein Belastung für Mutterschafe darstellen, und ob Lämmer aus einer Zwillingsträchtigkeit möglicherweise benachteiligt sind. Tiere, Material und Methoden: Untersucht wurden insgesamt 23 trächtige Merinofleisch-schafe und zwölf Merinofleischschaflämmer. Bei 13 Muttertieren wurde sonografisch eine Einlingsträchtigkeit (M1) und bei zehn eine Zwillingsträchtigkeit (M2) festgestellt. Bei den Lämmern stammten sechs Tiere aus einer Einlingsgeburt (L1) und sechs aus Zwillingsge-burten (L2). Den Muttertieren wurden von der 5. Woche a.p. bis 1 Woche a.p. wöchentlich sowie 2 Wochen p.p., den Lämmern eine, vier und zwölf Wochen post natum Blutproben entnommen. Im Serum wurden die Konzentrationen von Betahydroxybutyrat (BHB), Glu-cose, Bilirubin, freien Fettsäuren (FFS), Gesamtprotein und Albumin, die Aktivitäten der Glutamatdehydrogenase (GLDH), sowie im Vollblut die Aktivitäten der Superoxiddismutase (SOD) und der Glutathionperoxidase (GPX) gemessen. Ergebnisse: Die SOD- und GPX-Aktivitäten stiegen gleichermaßen bei einlingsträchtigen und zwillingsträchtigen Muttertieren signifikant an. Die SOD-Aktivitäten stiegen bei M1 von 488,2 ± 28 vier Wochen a.p. auf 524,8 ± 96,1 U/g Hb eine Woche a.p. und bei M2 von 447,4 ± 65,1 fünf Wochen a.p. auf 619,4 ± 141,1 U/g Hb zwei Wochen p.p. an. Die GPX-Aktivitäten bei M1 stiegen von 782,1 ± 220,5 eine Woche a.p. auf 1037,62 ± 382,9 U/ml Hk zwei Wochen p.p.. M2 zeigten eine tendenziell niedrigere Aktivität, welche von 641,8 ± 118,4 auf 911,8 ± 168,5 U/ml Hk anstieg. Es bestanden signifikante Zusammenhänge der SOD mit FFS, BHB und Gesamtprotein sowie der GPX mit Bilirubin, FFS und GLDH. Für die SOD-Aktivität wurde ein Referenzbereich von 328,10 bis 837,25 U/g Hb und für die GPX-Aktivität von 473,38 bis 1259,05 U/ml Hk bei Muttertieren ermittelt. Ausgenommen die Glucosekonzentration eine Woche a.p. bestanden keine signifikanten Differenzen zwi-schen M1 und M2. Die BHB-Konzentrationen zeigten bis zur Lammung einen konstanten Verlauf und stiegen bei M1 eine Woche a.p. auf 0,59 ± 0,27 mmol/l sowie bei M1 und M2 zwei Wochen p.p. auf 0,76 ± 0,29 mmol/l (M1) bzw. 0,77 ± 0,25 mmol/l (M2) signifikant an. Gesicherte Korrelationen bestanden zu FFS, Gesamtprotein und Glucose. Die Gesamtprotein- und Albuminkonzentrationen verliefen über den gesamten Untersuchungszeitraum nahezu konstant. Die Albuminkonzentration sank bei M1 nach einem kontinuierlichen An-stieg von einer Woche a.p. (37,2 ± 2,9 g/l) zu zwei Wochen p.p. (35,3 ± 3,6 g/l) signifikant ab. Gesicherte Korrelationen bestanden zu Glucose, SOD, BHB, Bilirubin und FFS. Die Glucose- Konzentrationen stiegen bei M1 bis eine Woche a.p. auf 4,84 ± 1,17 mmol/l sig-nifikant an, korrelierten neben den Proteinen mit Bilirubin und fallen 2 Wochen p.p. wieder auf ihren Ausgangswert ab, der bei M2 konstant blieb. Die Bilirubinkonzentrationen verlie-fen konstant, die der FFS fielen nach einem Anstieg eine Woche a.p. (M1) signifikant ab. Die GLDH-Aktivitäten zeigten a.p. einen konstanten Verlauf und p.p. einen signifikanten Anstieg auf 20,61 ± 14,11 U/l bei M2. Zwischen L1 und L2 bestanden zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede. Die SOD zeigte abnehmende Aktivitäten mit zunehmendem Lebensalter, - bei L1 von 757,7 ± 94,4 eine Woche p.p. auf 597,8 ± 255,0 U/g Hb 4 Wochen p.p. und bei L2 von 487,17 ± 353,3 auf 464,0 ± 330,9 U/g Hb. Sie korrelierte gesichert mit Albumin und Glucose in der ersten Lebenswoche. Die GPX-Aktivitäten stiegen mit zunehmendem Lebensalter bei statistisch gesicherter Korrelation mit Glucose von 724,3 ± 199,8 auf 1011,5 ± 132,9 U/ml Hk bei L1 und von 693,3 ± 120,8 auf 1052,0 ± 146,9 U/ml Hk bei L2. Für Lämmer wurden als Refe-renzwerte 43,00 bis 932 U/g Hb für die SOD bzw. 406,00 bis 1321,00 U/ml Hk für die GPX berechnet. Die Albumin- und BHB-Konzentrationen stiegen zur vierten bzw. zwölften Le-benswoche an, die Glucose-, Bilirubin- und FFS-Konzentrationen im Serum sanken zur 12. Lebenswoche ab. Die Gesamtproteinkonzentration und die Aktivität der GLDH verlie-fen konstant. Es bestanden signifikante Korrelationen zwischen BHB und Gesamtprotein, FFS, GLDH sowie zwischen Gesamtprotein und Glucose, Albumin sowie FFS. Des Weite-ren bestanden gesicherte Korrelationen zwischen Bilirubin und FFS sowie FFS und GLDH. Fazit: Die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme SOD und GPX sowie die Konzentrationen der klinisch-chemischen Parameter zeigen mit dem Anstieg der SOD-Aktivität von 447 auf 619 U/g Hb bei M2 einerseits die peripartalen Belastungen und andererseits mit dem An-stieg der GPX-Aktivität von 782 auf 1038 U/g Hk bei M1 die Kompensations- und Regel-mechanismen bei dieser Belastungssituation auf. Die Untersuchungen entsprechen dem Zustand einer ausgeglichen Energiebilanz und gesundheitlich stabilen Bedingungen. Ein Einfluss der Lämmerzahl auf das antioxidative System bzw. den Stoffwechsel kann weder bei Mutterschafen noch bei Lämmern statistisch signifikant belegt werden. / Metabolism and antioxidative status of merino sheep for meat production in the peripartum time period Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2010 (100 pages, 28 figures, 38 tables, 357 references) Definition of the problem and objective: Until now, the research regarding the metabol-ism of sheep focussed very little on the importance of the antioxidative system, but the significance of its function as a protective and regulative system is increasing. Especially the pregnancy and the early lactation of the ewes as well as the postnatal development of the lambs places enormous demands upon the energy supply and the antioxidative sys-tem. The objective of this study is to show how these demands are met and to determine whether a twin-pregnancy represents an additional stress for the ewes, and whether lambs from a twin-pregnancy are possibly disadvantaged. Animals, materials and methods: 23 pregnant merino ewes and twelve merino lambs were analyzed. Sonographic tests showed that 13 ewes were pregnant with one lamb (M1), and ten showed a twin-pregnancy (M2). Six of the lambs were born as single lambs (L1), six as twins (L2). Blood samples were taken from the ewes every week from the fifth until the week before the birth, as well as two weeks after birth, the blood samples from the lambs were taken one, four and twelve weeks postpartum. The concentration in the serum of the following components was measured: betahydroxybutyrate (BHB), glucose, biliru-bine, free fatty acids (FFS), total protein and albumine, the activity of the glutamatedehy-drogenasis (GLDH), as well as the activity in whole- blood of superoxidedismutasis (SOD) and glutathionperoxidasis (GPX). Results: The SOD- and GPX-activities rose significantly at the same rate for mother sheep pregnant with one lamb or with twins. The SOD-activity rose for M1 from 488,2 +/- 28 four weeks prepartum to 524 +/- 96,1 U/g Hb one week prepartum, and for M2 from 447,4 +/- 65,1 five weeks prepartum to 619,4 +/- 141,1 U/g Hb two weeks prepartum. The GPX-activity for M1 rose from 782,1 +/- 220,5 one week prepartum to 1037,62 +/- 382,9 U/ml two weeks postpartum, while M2 showed a tendency towards lower activity, which rose from 641,8 +/- 118,4 to 911,8 +/- 168,5 U/ml Hk. There were significant correlations between the SOD and the FFS, the BHB and the total protein as well as the GPX with bili-rubine, FFS and GLDH. For the ewes, an SOD-activity reference range between 328,10 and 837,25 U/g Hb was determined, and a GPX-activity reference range between 473,38 and 1259,05 U/ml Hk. There were no significant differences between M1 and M2 except for the concentration of glucose. The BHB-concentration stayed constant up to birth and then rose significantly to 0,59 +/- 0,27 mmol/l for M1 one week postpartum and for both M1 and M2 to 0,76 +/- 0,29 mmol/l (M1) and 0,77 +/- 0,25 mmol/l (M2) two weeks postpartum. A reliable correlation could be determined with FFS, total protein and glucose. The total protein and the albu-mine concentration stayed almost constant during the whole analyzed time period. After a continuous increase between one week prepartum (37,2 +/- 2,9 g/l) and two weeks post-partum (35,3 +/- 3,6 g/l), the albumine concentration dropped considerably. Here, reliable correlations could be determined with glucose, SOD, BHB, bilirubine and FFS. For the group M1, the glucose concentrations rose significantly until one week prepartum to 4,84 +/- 1,17 mmol/l, correlated with both the proteins and bilirubine, then fell back to their initial level two weeks postpartum, while they did not change for M2. The concentrations of bili-rubine stayed constant, the FFS-concentrations fell significantly after an increase one week prepartum (M1). The GLDH-activities showed a constant trend prepartum, then rose significantly postpartum to 20,61 +/14,11 U/l for M2. There were no significant differences between L1 and L2 at any time. The SOD showed decreasing activity with increasing age, from 757,7 +/- 94,4 one week prepartum to 597,8 +/- 255,0 U/g Hb four weeks postpartum for L1 and from 487,17 +/- 353,3 to 464,0 +/- 330,9 U/g Hb for L2. A reliable correlation was determined with albumine and glucose in the first week after birth. The GPX-activities rose with increasing age with a statistically reliable correlation with glucose from 724,3 +/- 199,8 to 1011,5 +/- 132,9 U/ml Hk for L1 and from 693,3 +/- 120,0 to 1052,0 +/- 146,9 U/ml Hk for L2. The calculated reference val-ues for lambs were 43,00 to 932 U/g Hb for SOD and 406,00 to 1321,00 U/ml Hk for GPX. The concentrations of albumine and BHB rose towards the fourth and respectively the twelvth week of life, the levels of glucose, bilirubine and FFS dropped towards the 12th week. The total protein concentration and the GLDH-activities stayed constant. There were significant correlations between BHB and total protein, FFS, GLDH as well as between total protein and glucose, albumine and FFS. In addition, there were reliable correlations between bilirubine and FFS and FFS and GLDH. Conclusion: The activities of the antioxidative enzymes SOD and GPX as well as the concentrations of the clinical-chemical parameters show the prepartum stress on one side with the rise of the SOD-activity from 447 to 619 U/g for the group M2, and the compensa-tion and regulation mechanisms during this stress period on the other side with the in-crease of the GPX-activity from 782 to 1038 U/g Hk for the group M1. The results of the tests correspond to the status of a well-regulated energy balance and stable health condi-tions. An influence of the number of lambs on the antioxidative system or the metabolism for both lambs and ewes can not be shown with statistical significance.

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Quantitative computertomographische Studie zu den pulmonalen Auswirkungen intramuskulär applizierten Xylazins beim Schaf Einleitung. α2-Agonisten wie z.B. Xylazin werden in der veterinärmedizinischen Praxis häufig zur Se-dierung eingesetzt. Dabei ist für das Schaf eine besonders ausgeprägte Sensibilität gegenüber Xylazin nachgewiesen. Bisher nur unzureichend untersucht wurde der Einfluss der Applikationsform des α2-Agonisten Xylazin (intravenöse versus intramuskuläre Injektion) auf den Ausprägungsgrad der entste-henden Lungenveränderungen. Ziele der Untersuchungen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Xylazin-induzierten pulmonalen Reaktionen nach intramuskulärer Applikation zu quantifizieren und mit den Auswirkungen einer intrave-nösen Gabe beim Schaf zu vergleichen. Um wissenschaftlich konsequent zu arbeiten, wurde weiterhin die Wirkung der in Xylazin-Präparaten enthaltenen sonstigen Bestandteile untersucht. Material und Methode. Als Studientiere wurden sieben weibliche Schafe der Rasse Merinoland zwei-malig in einem Abstand von acht Wochen untersucht. Bei diesen Tieren handelte es sich um die Scha-fe, welche in einem vorausgegangenen Projekt zu den pulmonalen Wirkungen von intravenös appliziertem Xylazin in identischer Dosierung am deutlichsten reagiert hatten. Nach Prämedikation der Tiere mit Midazolam (0,25 mg/kg KM) und Sufentanil (0,6 µg/kg KM) wurde die Narkose mit Propofol aufrechterhalten (5-10 mg/kg KM/h). Nach abgeschlossener Instrumentierung wurden die Schafe in Rückenlage im Computertomographen positioniert und mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von 100 Vol.-% beatmet. Zur Reduktion lagerungsbedingter Atelektasen wurde vor Versuchsbeginn ein Recruit¬ment¬ma¬nö¬ver (druckkontrollierte Beatmung, inspiratorischer Spitzendruck 60 cmH2O, PEEP 40 cmH2O, Atemfrequenz 10/min, Dauer zwei Minuten) durchgeführt. Nach abgeschlossenem Recruitmentmanöver wurden die Schafe bis zum Ende des Versuchsabschnittes volumenkontrolliert beatmet (Atemzugvolumen 8 ml/kg KM, PEEP 10 cmH2O, Adjustierung der Atemfrequenz, Ziel endexspiratorische Kohlendioxidkonzentration etwa 4,5 Vol.-%). Im Versuchsabschnitt „i.m.“ wurde Xylazin intramuskulär in einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM injiziert. 10 Minuten vor sowie 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der Xylazin-Injektion wurden computertomographische Untersuchungen des Thorax durchgeführt. Im Versuchsabschnitt „Vehikel“ wurde den Schafen eine dem verwendeten Xylazin-Präparat analoge, jedoch Xylazin-freie Lösung intravenös appliziert (enthält 1 mg/ml des Konservierungsstoffs Methyl-para-hydroxybenzoat). Als Dosis wurde eine der Xylazin-Gabe entsprechende Dosis von 0,015 ml/kg KM gewählt. Zusätzlich wurde 45 Minuten nach Versuchsbeginn Xylazin® 2 % in einer Dosis von 0,3 mg/kg KM intravenös injiziert. Die computertomographischen Untersuchungen wurden 10 Minuten vor sowie 5, 15, 30 Minuten nach erfolgter Injektion des Vehikel-Präparates und 5 Minuten nach erfolgter Injektion von Xylazin® durchgeführt. Unter Anwendung der Extrapolationsmethode wurden mit der quantitativen computertomographischen Analyse jeweils das totale Lungenvolumen (Vtot), das totale Lungengewicht (Mtot) und der Anteil der nicht belüfteten Lungenmasse (% Mnon) bestimmt. Dabei galt ein Abfall im totalen Lungenvolumen als Nachweis für Atelektasen, ein Anstieg im totalen Lungengewicht war gleichbedeutend mit der Entstehung eines Lungenödems. Als klinisch relevant galt eine Zunahme der totalen Lungenmasse um 100 g. In beiden Versuchsabschnitten wurden mittels arterieller Blutgasanalysen zusätzlich der arterielle Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxidpartialdruck (PaO2, PaCO2) erfasst. Ergebnisse. Vor der intramuskulären Xylazin-Gabe wurden folgende Medianwerte ermittelt: Vtot: 4220 ml, Mtot: 1280 g, % Mnon: 3 %, PaO2: 443 mmHg, PaCO2: 48 mmHg. Nach intramuskulärer Xylazin-Injektion zeigten sich die nachfolgenden statistisch signifikanten Maximaländerungen: Vtot-Abfall: 516 ml (Interquartilbereich 408-607), Mtot bzw. % Mnon-Zunahme: 108 g (Interquartilbereich 70-140) bzw. 15 % (Interquartilbereich 8-24) PaO2-Abfall: 280 mmHg (Interquartilbereich 200-346), PaCO2-Anstieg: 17 mmHg (Interquartilbereich 7-27). Die intramuskuläre Gabe von Xylazin verursachte im Vergleich zur intravenösen tendenziell, aber statistisch nicht signifikant, geringere Abnahmen im totalen Lungenvolumen sowie eine tendenziell, aber statistisch nicht signifikant geringere Zunahme im Anteil der nicht belüfteten Lungenmasse. Des Weiteren konnte ein statistisch signifikant geringerer Abfall im arteriellen Sauerstoffpartialdruck bei intramuskulär erfolgter Injektion nachgewiesen werden. Die Xylazin-induzierte Hypoxämie erreichte unter Beatmung mit 100 Vol.-% Sauerstoff auch nach intramuskulärer Gabe des α2-Agonisten im Mittel einen moderaten Ausprägungsgrad, wobei 50 % der Studientiere sogar eine schwere Belüftungsstörung zeigten (PaO2 < 100 mmHg). Entsprechend dem Schweregrad der durch den α2-Agonisten induzierten Belüftungsstörung trat eine Hyperkapnie auch nach intramuskulärer Xylazin-Gabe auf. Auch die korrespondierenden % Mnon-Zunahmen erreichten bei intramuskulärer Xylazin-Injektion neben der statistischen Signifikanz erhebliche klinische Relevanz. So waren im Mittel 18 % (Interquartilbereich 10-28) des Lungengewebes nach intramuskulärer Gabe des α2-Ago¬nis¬ten nicht belüftet. Bei jeweils 50 % der Tiere konnte für beide Applikationsformen ein klinisch relevantes Lungenödem nachgewiesen werden. Eine Reaktion der Versuchstiere auf die sonstigen im Xylazin-Präparat enthaltenen Bestandteile konnte ausgeschlossen werden. So konnte für keinen der untersuchten Parameter eine statistisch signifikante Änderung nach Injektion der Vehikel-Lösung nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Zu- bzw. Abnahmen in den untersuchten Parametern konnten eindeutig der Wirkung des α2-Agonisten Xylazin zugewiesen werden. Schlussfolgerungen. Trotz quantitativ geringerer Ausprägung in den detektierten Änderungen von Vtot, PaO2 und % Mnon zeigten die Xylazin-induzierten pulmonalen Reaktionen bei der Mehrzahl der Studientiere auch nach intramuskulär erfolgter Applikation des α2-Agonisten erhebliche klinische Relevanz. Ein zeitlich verzögertes Eintreten im Vergleich zur intravenösen Gabe des α2-Agonisten konnte nur für die Formation des Xylazin-induzierten Lungenödems festgestellt werden. Analog zu den Ergebnissen des vorausgegangenen Projektes zur Wirkung von intravenös verabreichtem Xylazin, kann das morphologische Bild der Xylazin-induzierten Lungenveränderungen durch eine Koexistenz von Atelektasen und Lungenödem beschrieben werden. Derzeit konnte noch kein logisches Muster gefunden werden, dass die interindividuelle Variabilität in der Reaktion auf Xylazin beim Schaf aufzuklären vermag. Ebenso ist der Erkenntnisstand bezüglich einer möglicherweise vorhandenen Rasseabhängigkeit bis dato nicht ausreichend, um im Vorfeld die Sensibilität gegenüber Xylazin bei einem Schaf abschätzen zu können. Demzufolge muss beim Schaf auf der Grundlage der vorliegenden Ergebnisse im Einzelfall auch nach einer intramuskulären Xylazin-Gabe mit einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM von schwerwiegenden Lungenveränderungen ausgegangen werden. Sofern Schafe als Tier-Modell in der experimentellen Lungenforschung verwendet werden, sollte aufgrund der Gefahr von fehlerhaften Forschungsergebnissen sowohl auf den intramuskulären Einsatz von Xylazin zur Prämedikation verzichtet werden als auch auf die intravenöse Verabreichung des α2-Agonisten als Narkosebestandteil. Um in der Praxis zukünftig unnötiges Leiden oder gar Versterben von Tieren verhindern zu können, muss die Problematik der Xylazin-induzierten Lungenveränderungen beim Schaf weiter verfolgt und näher erforscht werden.

Der Effekt des Cagedesigns, von Carrier-Systemen und Wachstumsfaktoren auf die intervertebrale Spondylodese am Tiermodell der Schafshalswirbelsäule wurde in einer anatomisch-biomechanischen, einer rein biomechanischen und sechs tierexperimentellen Teilstudien untersucht. Cages weisen eine designspezifische in vitro Primärstabilität auf. Jedoch besteht kein direkter Zusammenhang zwischen der in vitro Primärstabilität und der in vivo Sekundärstabilität der Implantate. Daher sind rein biomechanische in vitro Untersuchungen nicht dazu geeignet das Einheilungsverhalten eines Cages zu prognostizieren. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen auch, dass die Auflagefläche für das Sinterungsverhalten eines Cages in vivo nur von untergeordneter Bedeutung ist. Hingegen sind das "stress-shielding" und die Volumen-bezogene-Steifigkeit eines Cages für das Einheilungsverhalten des Implantates in vivo entscheidend. In den vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die biodegradierbare PDLLA-Beschichtung intervertebraler Implantate eine sichere, einfache und effektive Applikation von Wachstumsfaktoren im Intervertebralraum gewährleistet. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der PDLLA-Carrier dem Kollagen-Carrier in seiner Effektivität signifikant überlegen ist. Nebenwirkungen der PDLLA-Beschichtung konnten in diesen Untersuchungen nicht ermittelt werden. Die Applikation einer geeigneten Dosis von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-beschichtetem Cage ist in der Lage, die intervertebrale Spondylodese signifikant zu stimulieren. Des weiteren konnte demonstriert werden, dass die verwendeten Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-(1 eine signifikante Verbesserung der intervertebralen Fusionsergebnisse im Vergleich zu autologem Knochenmaterial ermöglichen und gleichzeitig die Entnahme dieses Knochenmaterials überflüssig machen. Die Applikation von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-Carrier zeigte außerdem im Vergleich zum bisherigen Standard BMP-2 appliziert mittels Kollagen-Carrier signifikant bessere Fusionsergebnisse. Lokale oder systemische Nebenwirkungen konnten in den bisherigen Untersuchungen für die verwendeten Wachstumsfaktorendosen nicht ermittelt werden. Weiterführende Untersuchungen müssen belegen, ob die kombinierte lokale Applikation von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-beschichtetem Cage auch beim Menschen zu einer signifikanten Verbesserung der Ergebnisse der zervikalen Spondylodese führen können. / Anatomical, biomechanical and animal experimental studies were carried out to determine the effect of cage design, carrier systems and growth factors on interbody fusion in a sheep cervical spine model. Primary stability of cages was influenced by the implant design. However, there was no direct correlation between primary and secondary stability of cages. The dimension of the endplate-implant-contact area had no significant influence on subsidence of cages. Yet, stress-shielding and volume-related-stiffness significantly influenced bone matrix formation inside the cage. Biodegradable PDLLA-coating of cages allowed a safe, simple and effective intervertebral application of growth factors. The PDLLA-carrier was more effective than the collagen sponge carrier. No side effects were associated with the use of the PDLLA-carrier. An adequate dose of IGF-I and TGF-(1 applied by a PDLLA-coated interbody fusion cage stimulated interbody bone matrix formation. In comparison to autologous bone grafts the local application of IGF-I and TGF-(1 demonstrated significantly better fusion results and eliminated donor site morbidity. Further, in comparison to the golden standard BMP-2 applied by a collagen sponge carrier the combined application of IGF-I and TGF-(1 by a PDLLA-carrier significantly increased fusion results. No local or systemic side effects were associated with the use of the growth factors. Further studies have to determine, if the local combined application of IGF-I and TGF-(1 by a PDLLA-coated interbody cage increases fusion results in the human cervical spine.

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Quantitative computertomographische Studie zu den pulmonalen Auswirkungen intramuskulär applizierten Xylazins beim Schaf Einleitung. α2-Agonisten wie z.B. Xylazin werden in der veterinärmedizinischen Praxis häufig zur Se-dierung eingesetzt. Dabei ist für das Schaf eine besonders ausgeprägte Sensibilität gegenüber Xylazin nachgewiesen. Bisher nur unzureichend untersucht wurde der Einfluss der Applikationsform des α2-Agonisten Xylazin (intravenöse versus intramuskuläre Injektion) auf den Ausprägungsgrad der entste-henden Lungenveränderungen. Ziele der Untersuchungen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Xylazin-induzierten pulmonalen Reaktionen nach intramuskulärer Applikation zu quantifizieren und mit den Auswirkungen einer intrave-nösen Gabe beim Schaf zu vergleichen. Um wissenschaftlich konsequent zu arbeiten, wurde weiterhin die Wirkung der in Xylazin-Präparaten enthaltenen sonstigen Bestandteile untersucht. Material und Methode. Als Studientiere wurden sieben weibliche Schafe der Rasse Merinoland zwei-malig in einem Abstand von acht Wochen untersucht. Bei diesen Tieren handelte es sich um die Scha-fe, welche in einem vorausgegangenen Projekt zu den pulmonalen Wirkungen von intravenös appliziertem Xylazin in identischer Dosierung am deutlichsten reagiert hatten. Nach Prämedikation der Tiere mit Midazolam (0,25 mg/kg KM) und Sufentanil (0,6 µg/kg KM) wurde die Narkose mit Propofol aufrechterhalten (5-10 mg/kg KM/h). Nach abgeschlossener Instrumentierung wurden die Schafe in Rückenlage im Computertomographen positioniert und mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von 100 Vol.-% beatmet. Zur Reduktion lagerungsbedingter Atelektasen wurde vor Versuchsbeginn ein Recruit¬ment¬ma¬nö¬ver (druckkontrollierte Beatmung, inspiratorischer Spitzendruck 60 cmH2O, PEEP 40 cmH2O, Atemfrequenz 10/min, Dauer zwei Minuten) durchgeführt. Nach abgeschlossenem Recruitmentmanöver wurden die Schafe bis zum Ende des Versuchsabschnittes volumenkontrolliert beatmet (Atemzugvolumen 8 ml/kg KM, PEEP 10 cmH2O, Adjustierung der Atemfrequenz, Ziel endexspiratorische Kohlendioxidkonzentration etwa 4,5 Vol.-%). Im Versuchsabschnitt „i.m.“ wurde Xylazin intramuskulär in einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM injiziert. 10 Minuten vor sowie 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der Xylazin-Injektion wurden computertomographische Untersuchungen des Thorax durchgeführt. Im Versuchsabschnitt „Vehikel“ wurde den Schafen eine dem verwendeten Xylazin-Präparat analoge, jedoch Xylazin-freie Lösung intravenös appliziert (enthält 1 mg/ml des Konservierungsstoffs Methyl-para-hydroxybenzoat). Als Dosis wurde eine der Xylazin-Gabe entsprechende Dosis von 0,015 ml/kg KM gewählt. Zusätzlich wurde 45 Minuten nach Versuchsbeginn Xylazin® 2 % in einer Dosis von 0,3 mg/kg KM intravenös injiziert. Die computertomographischen Untersuchungen wurden 10 Minuten vor sowie 5, 15, 30 Minuten nach erfolgter Injektion des Vehikel-Präparates und 5 Minuten nach erfolgter Injektion von Xylazin® durchgeführt. Unter Anwendung der Extrapolationsmethode wurden mit der quantitativen computertomographischen Analyse jeweils das totale Lungenvolumen (Vtot), das totale Lungengewicht (Mtot) und der Anteil der nicht belüfteten Lungenmasse (% Mnon) bestimmt. Dabei galt ein Abfall im totalen Lungenvolumen als Nachweis für Atelektasen, ein Anstieg im totalen Lungengewicht war gleichbedeutend mit der Entstehung eines Lungenödems. Als klinisch relevant galt eine Zunahme der totalen Lungenmasse um 100 g. In beiden Versuchsabschnitten wurden mittels arterieller Blutgasanalysen zusätzlich der arterielle Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxidpartialdruck (PaO2, PaCO2) erfasst. Ergebnisse. Vor der intramuskulären Xylazin-Gabe wurden folgende Medianwerte ermittelt: Vtot: 4220 ml, Mtot: 1280 g, % Mnon: 3 %, PaO2: 443 mmHg, PaCO2: 48 mmHg. Nach intramuskulärer Xylazin-Injektion zeigten sich die nachfolgenden statistisch signifikanten Maximaländerungen: Vtot-Abfall: 516 ml (Interquartilbereich 408-607), Mtot bzw. % Mnon-Zunahme: 108 g (Interquartilbereich 70-140) bzw. 15 % (Interquartilbereich 8-24) PaO2-Abfall: 280 mmHg (Interquartilbereich 200-346), PaCO2-Anstieg: 17 mmHg (Interquartilbereich 7-27). Die intramuskuläre Gabe von Xylazin verursachte im Vergleich zur intravenösen tendenziell, aber statistisch nicht signifikant, geringere Abnahmen im totalen Lungenvolumen sowie eine tendenziell, aber statistisch nicht signifikant geringere Zunahme im Anteil der nicht belüfteten Lungenmasse. Des Weiteren konnte ein statistisch signifikant geringerer Abfall im arteriellen Sauerstoffpartialdruck bei intramuskulär erfolgter Injektion nachgewiesen werden. Die Xylazin-induzierte Hypoxämie erreichte unter Beatmung mit 100 Vol.-% Sauerstoff auch nach intramuskulärer Gabe des α2-Agonisten im Mittel einen moderaten Ausprägungsgrad, wobei 50 % der Studientiere sogar eine schwere Belüftungsstörung zeigten (PaO2 < 100 mmHg). Entsprechend dem Schweregrad der durch den α2-Agonisten induzierten Belüftungsstörung trat eine Hyperkapnie auch nach intramuskulärer Xylazin-Gabe auf. Auch die korrespondierenden % Mnon-Zunahmen erreichten bei intramuskulärer Xylazin-Injektion neben der statistischen Signifikanz erhebliche klinische Relevanz. So waren im Mittel 18 % (Interquartilbereich 10-28) des Lungengewebes nach intramuskulärer Gabe des α2-Ago¬nis¬ten nicht belüftet. Bei jeweils 50 % der Tiere konnte für beide Applikationsformen ein klinisch relevantes Lungenödem nachgewiesen werden. Eine Reaktion der Versuchstiere auf die sonstigen im Xylazin-Präparat enthaltenen Bestandteile konnte ausgeschlossen werden. So konnte für keinen der untersuchten Parameter eine statistisch signifikante Änderung nach Injektion der Vehikel-Lösung nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Zu- bzw. Abnahmen in den untersuchten Parametern konnten eindeutig der Wirkung des α2-Agonisten Xylazin zugewiesen werden. Schlussfolgerungen. Trotz quantitativ geringerer Ausprägung in den detektierten Änderungen von Vtot, PaO2 und % Mnon zeigten die Xylazin-induzierten pulmonalen Reaktionen bei der Mehrzahl der Studientiere auch nach intramuskulär erfolgter Applikation des α2-Agonisten erhebliche klinische Relevanz. Ein zeitlich verzögertes Eintreten im Vergleich zur intravenösen Gabe des α2-Agonisten konnte nur für die Formation des Xylazin-induzierten Lungenödems festgestellt werden. Analog zu den Ergebnissen des vorausgegangenen Projektes zur Wirkung von intravenös verabreichtem Xylazin, kann das morphologische Bild der Xylazin-induzierten Lungenveränderungen durch eine Koexistenz von Atelektasen und Lungenödem beschrieben werden. Derzeit konnte noch kein logisches Muster gefunden werden, dass die interindividuelle Variabilität in der Reaktion auf Xylazin beim Schaf aufzuklären vermag. Ebenso ist der Erkenntnisstand bezüglich einer möglicherweise vorhandenen Rasseabhängigkeit bis dato nicht ausreichend, um im Vorfeld die Sensibilität gegenüber Xylazin bei einem Schaf abschätzen zu können. Demzufolge muss beim Schaf auf der Grundlage der vorliegenden Ergebnisse im Einzelfall auch nach einer intramuskulären Xylazin-Gabe mit einer Dosierung von 0,3 mg/kg KM von schwerwiegenden Lungenveränderungen ausgegangen werden. Sofern Schafe als Tier-Modell in der experimentellen Lungenforschung verwendet werden, sollte aufgrund der Gefahr von fehlerhaften Forschungsergebnissen sowohl auf den intramuskulären Einsatz von Xylazin zur Prämedikation verzichtet werden als auch auf die intravenöse Verabreichung des α2-Agonisten als Narkosebestandteil. Um in der Praxis zukünftig unnötiges Leiden oder gar Versterben von Tieren verhindern zu können, muss die Problematik der Xylazin-induzierten Lungenveränderungen beim Schaf weiter verfolgt und näher erforscht werden.