Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-27T14:08:11Z No. of bitstreams: 1 Vera Lucia Silva Rigoni.pdf: 1348554 bytes, checksum: 28c01d5b4e69fddd38792d76d20fcf02 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T14:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vera Lucia Silva Rigoni.pdf: 1348554 bytes, checksum: 28c01d5b4e69fddd38792d76d20fcf02 (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / The scorpionism is considered a public health worldwide, with Tityus serrulatus the main cause of accidents in Brazil. Symptoms of envenomation by Tityus serrulatus ranging from local pain to severe systemic reactions such as cardiac dysfunction and pulmonary edema, which is the leading cause of death. The amount of venom injected the age, physical and genetic factors of the victims are related to the severity of the symptoms presented by patients. Endothelial cells under physiological conditions play a protective role in the cardiovascular system. In the case of dysfunction or injury of that tissue occurs repercussion in the vascular structure, surrounding tissue, and finally on the cardiovascular system. In bronchial epithelial cells after injury, occurs repair mechanism mediated by cytokines and growth factors also occur increase in cell proliferation and differentiation after epithelial damage. Thus, this study aims to evaluate the modulating effect of Tityus serrulatus scorpion venom on endothelial cells and bronchial epithelial cells analyzing the viability of these cells and the mechanism by which inflammation occurs. Therefore, the cells in this study are cultured and incubated in culture plates with Tityus serrulatus scorpion venom in different concentrations and periods of time. The inflammatory mechanism was assessed through the measurement of cytokines in the supernatant of these cells. The results showed that Tityus serrulatus venom changed the viability of monolayers of endothelial cells (tEnd), and bronchial epithelial cells (BEAS), and this effect was more marked in bronchial epithelial cells. The results also demonstrate that the venom induces the release of cytokines IL-1, IL-6 and IL-8. iii This study extend the knowledge of the actions of the venom of the scorpion Tityus serrulatus on bronchial epithelial and endothelial cells thus demonstrating changes in pulmonary physiology that may contribute to a better treatment strategy of scorpion envenomation. / O escorpionismo é considerado um problema mundial de saúde pública, sendo a espécie Tityus serrulatus a principal causadora de acidentes graves no Brasil. Os sintomas do envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus vão desde dor local até reações sistêmicas severas, como disfunção cardíaca e edema pulmonar agudo, sendo este a principal causa de morte. A quantidade de veneno inoculado, idade, condições físicas e fatores genéticos das vítimas relacionam-se com a gravidade dos sintomas apresentados pelos pacientes. As células endoteliais, em condições fisiológicas, desempenham papel protetor do sistema cardiovascular. Em caso de disfunção ou lesão desse tecido há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente e, por fim sobre o sistema cardiovascular. Já, nas células epiteliais brônquicas após injúria, ocorre mecanismo de reparo mediado por citocinas e fatores de crescimento, ocorrendo também proliferação e diferenciação celular após o dano epitelial. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito modulador do veneno do escorpião Tityus serrulatus em células endoteliais e células epiteliais brônquicas, analisando a viabilidade destas células e o mecanismo de inflamação pela qual são acometidas. Para tanto, as células em estudo foram cultivadas e incubadas em placas de cultura com o veneno do escorpião Tityus serrulatus, em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O mecanismo inflamatório foi avaliado através da dosagem de citocinas no sobrenadante destas células. Os resultados demonstraram que o veneno de Tityus serrulatus alterou a viabilidade de i monocamadas das células epiteliais brônquicas e células endoteliais, sendo que esse efeito foi mais evidente nas células epiteliais brônquicas. Ainda, os resultados demonstraram que o veneno induz a liberação das citocinas IL-1, IL-6 e IL-8. Estes estudos ampliam o conhecimento das ações do veneno do escorpião Tityus serrulatus nas células endoteliais (tEnd) e epiteliais brônquicas (BEAS), comprovando assim alterações na fisiologia pulmonar que poderão contribuir para uma melhor estratégia de tratamento do envenenamento escorpiônico.

Les scorpions du genre Androctonus, comme Androctonus australis en Algérie et en Tunisieou Androctonus mauretanicus au Maroc, sont responsables d’environ 100.000 piqûres par ansur l’ensemble du Maghreb, suivies de 1 % de décès. Ils posent un réel problème de santépublique. Les toxines «alpha» modulant les canaux sodium voltage-activés (Nav) sontresponsables de 80 à 90% de l’activité létale des venins d’Androctonus australis etmauretanicus. Cependant, certaines petites molécules sont aussi capables de bloquer lefonctionnement d’autres types de canaux ioniques, en particulier des canaux potassiumvoltage-activés (Kv).Au cours de cette thèse, nous avons isolé et caractérisé les composants du venind’Androctonus amoreuxi, scorpion largement distribué en Afrique du Nord et au Moyen-Orient, mais qui n’avait jusqu’ici fait l’objet d’aucune etude rigoureuse. Nous avons identifiéles constituants impliqués dans la toxicité du venin et précisé leurs propriétéspharmacologiques et immunologiques, ainsi que l’effet qu’elles induisent enélectrophysiologie sur des canaux Nav et Kv clonés exprimés dans l’ovocyte de Xenope.Nous avons recherché de nouveaux membres d’une famille de toxines récemment isolées, lesBirtoxines-like, et interprété leur polymorphisme biologique par la modélisation de leursstructures 3D. Enfin, nous avons mené à bien un programme portant sur les effetsantinociceptifs des toxines de scorpion chez la souris. Cela nous a permis de proposer uneexplication qui fait intervenir le système opiacé et la « contre-irritation ». L’effet des toxinesreconnues « analgésiques » a ensuite été testé en électrophysiologie sur des neuronesnocicepteurs. / The North African scorpion Androctonus australis in Algeria and Tunisia, or Androctonusmauretanicus in Morocco, are responsible of about 100.000 stings each year in Maghreb,followed by 1% of death. Small toxins modulating voltage-gated sodium channels (Nav),named “alpha”, are responsible of 80 to 90% of the total lethal activity from the Androctonusaustralis and mauretanicus venoms. However, smaller molecules are also able to block thefunctioning of another type of ionic channels, in particular, the voltage-gated potassiumchannels (Kv).During this thesis, we have isolated and characterized the compounds of the venom fromAndroctonus amoreuxi, a scorpion widely found in North Africa and Middle East, but neverseriously studied so far. We have identified the constituents implicated in the toxicity anddefined their immunological and pharmacological properties, as well as theirelectrophysiological effects on cloned Nav and Kv channels expressed in Xenopus oocytes.We also have looked for recently characterized new molecules, the Birtoxins-like, and tried toexplain their large biological polymorphism by 3D structural models. At last, we haveevaluated the antinociceptifs effects of scorpion toxins in mice. We have proposed that theantalgic effects observed after administration of scorpion toxins are partly due to a counterirritation phenomenon, which implicates the activation of an endogenous opioid system. The“analgesic” toxins have been further tested in electrophysiology on DRG neurons.

Toxinas que atuam em canais para Na+ operados por voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos tóxicos do envenenamento escorpiônico e podem ser divididas em duas classes: a- e b-neurotoxinas. TsTX-V e TsTX-I da peçonha de Tityus serrulatus (TsV) são, respectivamente, exemplos destas toxinas. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos da TsV e destas toxinas sobre a pressão arterial média (PAM) e liberação de catecolaminas em ratos conscientes e não imobilizados, previamente cateterizados, bem como a captação de GABA, dopamina (DA) e glutamato (Glu) em sinaptosomas isolados de cérebro de ratos e a concentração citoplasmática de Ca+2 ([Ca+2 ]C) em células de músculo liso vascular de aorta de ratos. As toxinas foram isoladas por cromatografia de troca iônica (TsTX-I) seguida por CLAE de fase reversa (TsTX-V). As toxinas (15 e 30 g/kg) e TsV (50 e 100 g/kg) foram injetadas intravenosamente. A PAM foi monitorada continuamente através do cateter femoral. Os níveis plasmáticos de adrenalina (ADR) e noradrenalina (NA) foram determinados por CLAE de fase reversa com detector eletroquímico, em 10 min antes e 2,5, 30 e 90 min após os tratamentos. Efeitos pressores máximos foram observados em 2,5?3,5 min. TsV induziu um intenso aumento de longa duração na PAM, bem como a TsTX-I. A TsTX-V mostrou efeitos pressores menores. TsV mostrou os maiores efeitos sobre a liberação de catecolaminas, seguido pela TsTX-I e TsTX-V com um efeito máximo em 2,5 min, seguido por uma gradual redução, permanecendo, todavia, maior que os controles. Embora ambas as classes de toxinas atuem em canais para Na+, TsTX-I mostrou efeitos mais significantes e intensos sobre a liberação de catecolaminas e pressão arterial que a TsTX-V. Parece que a toxicidade da TsTX-V não está somente relacionada à sua capacidade de liberar catecolaminas, indicando que outros neutrotransmissores podem estar envolvidos em sua toxicidade. Nem a TsV ou suas toxinas foram capazes de afetar a captação de 3H-Glu. TsTXI inibiu somente a captação de 3H-DA (IC50 = 28,41 nM). Por outro lado, TsV (0,43ng/mL) inibiu a captação de 3H-GABA e 3H-DA (~50%). TsTX-V mostrou IC50 = 9,37 nM e 22,2 nM para a captação de 3H-GABA e 3HDA, respectivamente. Esses efeitos foram abolidos pelo pré-tratamento com TTX, indicando o envolvimento de canais para Na+ neste processo. Na ausência de Ca+2 e em baixas concentrações de toxinas, a redução não é tão singnificante como na presença de Ca+2. TsTX-V não reduziu a captação de 3H-GABA em células COS-7 expressando os transportadores de GABA, GAT-1 e GAT-3, sugerindo que esta toxina reduz indiretamente o transporte. A redução da captação de 3H-GABA pelos sinaptosomas pode ser devido a rápida e intensa despolarização celular, como revelado por microscopia confocal em células de glioma C6. Assim, TsTX-V causou redução da captação de 3H-GABA e 3H-DA de uma maneira independente de Ca+2, não afetando diretamente os transportadores de GABA, mas em consequencia da despolarização, envolvendo canais para Na+ operados por voltagem. TsV e suas toxinas foram capazes de aumentar a ([Ca2+ ]C , provavelmente por interargir com canais para Na+. Quando comparado aos efeitos despolarizantes do KCl 60 mM (100 %), TsV (100 e 500 g/mL) exibiu um aumento de 49,60 ± 2,58 % e 103,66 ± 5,17 %, respectivamente, enquanto que a TsTX-I e TsTX-V (50 e 100 g/mL de cada) exibiu 43,92 ± 3,06 % e 121,8 ± 8,9 %; 52,56 ± 8,33 % e 79,5 ± 6,1 % de aumento, respectivamente. TsTX-I (100 g/mL) mostrou-se mais potente nesta preparação, visto que uma dose de 100 g/mL causou efeito muito mais intenso do que a TsTX-V na mesma concentração. É possível que as diferenças observadas sobre os efeitos induzidos pela TsTX-I e TsTX-V sejam conseqüência de alterações estruturais entre canais para Na+ presentes em vários tipos de tecidos e inervações. / Voltage-gated Na+ channel toxins are mainly responsible for the toxic effects of scorpion envenoming and can be classified into two classes: a- and b-neurotoxins. TsTX-V and TsTX-I from Tityus serrulatus venom (TsV) are, respectively, examples of these toxins. In this work, were evaluate the effects of TsV and its toxins on mean arterial pressure (MAP) and catecholamines release in conscious unrestrained rats previously catheterized, as well as GABA, dopamine (DA) and glutamate (Glu) uptake in isolated rat brain synaptosomes and cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+ ]C) in vascular smooth muscle cells from rat aorta. Toxins were isolated by ion exchange chromatography (TsTX-I) followed by RP-HPLC (TsTX-V). The toxins (15 and 30 g/kg) and TsV (50 and 100 g/kg) were injected intravenously. MAP was continuously monitored through femoral catheter. Epinephrine (E) and norepinephrine (NE) plasma levels were determined by RP-HPLC with electrochemical detection, at 10 min before and 2.5, 30 and 90 min after treatments. Maximal pressor effects were observed at 2.5 3.5 min. TsV induced intense long lasting increase in MAP, as did TsTX-I. TsTX-V showed the lowest pressor effects. TsV showed the highest effects on catecholamines release, followed by TsTX-I and TsTX-V with maximal effect at 2.5 min, followed by a gradual reduction, however remaining higher than controls. Although both toxins act on Na+ channels, TsTX-I displayed significant and more intense effects on catecholamines release and blood pressure than TsTX-V. It seems that the toxicity of TsTX-V is not related only with its ability to release catecholamines, indicating that other neurotransmitters, may be involved in its toxicity. Neither the TsV or its toxins was capable to affect the 3H-Glu uptake. TsTX-I inhibited only 3H-DA uptake (IC50 = 28.41 nM). On the other hand, TsV (0.43ng/mL) inhibited both 3H-GABA and 3H-DA uptake (~50%). TsTX-V showed IC50 = 9.37 nM and 22.2 nM for 3H-GABA and 3H-DA uptake, respectively. These effects were abolished by pre-treatment with TTX, indicating the involvement of Na+ channels in this process. In the absence of Ca2+ and at low concentrations of toxin, the reduction is not as significant as in the presence of Ca2+. TsTX-V did not reduce 3H-GABA uptake in COS-7 cells expressing GABA transporters GAT-1 and GAT-3, suggesting that this toxin indirectly reduces the transport. The reduced 3H-GABA uptake by synaptosomes could be due to fast and intense cell depolarization as revealed by confocal microscopy of C6 glioma cells. Thus, TsTX-V causes reduction on 3H-GABA and 3H-DA uptake in a Ca2+-independent manner, not affecting directly GABA transporters, but, in consequence of depolarization, involving voltage-gated Na+ channels. TsV and its toxins were able to increase the ([Ca2+ ]C , probably by interact with Na+ channels. When compared to KCl 60 mM depolarizing effect (100 %), TsV (100 and 500 ?g/mL), showed an increase of 49.60 ± 2.58 % and 103.66 ± 5.17 %, respectively, whereas TsTX-I and TsTX-V (50 and 100?g/mL of each) showed 43.92 ± 3.06 % and 121.8 ± 8.9 %; 52.56 ± 8.33 % and 79.5 ± 6.1 %, respectively. TsTX-I (100 ?g/mL) showed most potent effects in this type of preparation, since induced most intense effect that TsTX-V in the same concentration. Thus, it is possible that the differences observed on the effects induced by both toxins are consequence of structural changes among Na+ channels present in several types of tissues and innervations .

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O veneno do escorpiÃo Tityus serrulatus à uma mistura de peptÃdeos tÃxicos e nÃo tÃxicos com diversas aÃÃes locais e sistÃmicas. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos cardiovasculares e renais induzidos pelo veneno total do escorpiÃo T. serrulatus e de suas fraÃÃes TsTx-V, Toxina &#947; e NatriurÃtica. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) para os experimentos de perfusÃo de rim isolado, leito mesentÃrico, pressÃo arterial e perfusÃo in vivo. Para os ensaios de canal deferente foram utilizados camundongos Swiss (30-40g). O veneno de T. serrulatus apresentou efeito sobre o sistema nervoso autÃnomo observado atravÃs da contraÃÃo do vaso deferente. O veneno total mostrou efeito adrenÃrgico demonstrado pela reversÃo dos seus efeitos renais apÃs prÃ-tratamento dos rins com antagonista &#945;-adrenÃrgico prazosin, especialmente sobre a resistÃncia vascular renal (RVRVTs = 7,51  0,96 vs RVRPz = 5,51  0,43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0,05) e pressÃo de perfusÃo (PPVTs = 150,1  18,40 vs PPPz = 118,1  4,00 mmHg*,*p<0,05). As fraÃÃes isoladas mostraram efeitos renais somatÃrios, haja visto que TsTx-V promoveu aumento da diurese e a Toxina &#947; causou efeitos pressÃricos. ApÃs avaliaÃÃo histopatolÃgica dos efeitos renais das fraÃÃes isolados do veneno de T. serrulatus, observamos a presenÃa de material protÃico nos espaÃos urinÃrios glomerulares e nos tÃbulos. Entretanto, no leito vascular mesentÃrico, somente a toxina &#947; mostrou-se ativa. Os efeitos renais induzidos pela fraÃÃo natriurÃtica (0,03 e 0,1Âg/mL) revelaram aumento da pressÃo e, de maneira concentraÃÃo-dependente, diminuiÃÃo da reabsorÃÃo de eletrÃlitos e aumento da excreÃÃo urinÃria de guanosina monofosfato cÃclico (GMPc). Nos experimentos in vivo, tanto o veneno total quanto a fraÃÃo natriurÃtica causaram aumento da pressÃo arterial mÃdia (PAM) e diminuiÃÃo do hematÃcrito. Em adiÃÃo, a fraÃÃo natriurÃtica causou ainda a elevaÃÃo do fluxo urinÃrio e da freqÃÃncia cardÃaca. O clearance de inulina foi utilizado para a avaliaÃÃo da funÃÃo renal in vivo. O veneno total diminui significativamente o clearance da inulina, enquanto a fraÃÃo natriurÃtica causou elevaÃÃo. O fluxo plasmÃtico renal cortical, avaliado atravÃs do clearance de p-aminohipurato, foi reduzido por aÃÃo do veneno total de T. serrulatus. Em conclusÃo, o veneno de Tityus serrulatus promoveu efeitos hemodinÃmicos renais que foram prontamente revertidos in vitro pelo prazosin. Os experimentos in vivo mostraram que o veneno de Tityus serrulatus induziu a elevaÃÃo da pressÃo arterial mÃdia, taquicardia e alteraÃÃo da funÃÃo renal. / The venom of Tityus serrulatus has a mixture of toxic and non toxic peptides presenting diverse systemic and local effects. The aim of this work was to investigate the cardiovascular and renal effects promoted by the crude venom of the scorpion Tityus serrulatus and its isolated components such as Tityus serrulatus toxin V (TsTx-V), Gamma Toxin and the newly isolated Natriuretic Peptide. The experiments of isolated perfused rat kidney, isolated mesenteric bed, arterial pressure and in vivo perfusion were performed using male Wistar rats weighing 250-300g. The assays with vas deferens were done using Swiss mice weighing 30-40g. The crude venom presented autonomic nervous system effects showed by the contraction of vas deferens. Adrenergic effects were demonstrated specially with the decrease of renal vascular resistance (RVRVTs = 7.51  0.96 vs RVRPz = 5.51  0.43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0.05) and renal perfusion pressure (PPVTs = 150.1  18.40 vs PPPz = 118.1  4.00 mmHg*,*p<0.05) induced by the crude venom after kidneys pre-treatment with prazosin. The venoms isolated components showed kidney addictional effects, where TsTx-V caused diuresis while Gamma Toxin increased perfusion pressure. We could also observe the presence of protein inside the tubules and in glomerular spaces after renal histopathologic evaluation in the groups treated with the isolated components. However, only Gamma Toxin promoted an increase of the mesenteric bed perfusion pressure. The Natriuretic Peptide (0.03 and 0.1Âg/mL) increased renal perfusion pressure. In addition, the natriuretic peptide increased cyclic guanosine monophosphate (cGMP) urinary excretion, but reduced electrolytes reabsorption in a dependent-concentration manner. The crude venom and the natriuretic peptide increased the arterial blood pressure, but decreased the hematocrit values, evaluated after in vivo experiments. However, the natriuretic peptide increased urinary flow and heartbeat frequency. In vivo renal function was evaluated by the clearance of inulin. The scorpion crude venom decreased the clearance of inulin, but this parameter was increased after natriuretic peptide treatment. The renal cortex blood flux, estimated by the clearance of p-aminohippurate, was reduced after the crude venom treatment. In conclusion, we demonstrated that Tityus serrulatus venom induced renal hemodynamic effects that were blocked in vitro by prasozin. In vivo experiments showed how the crude venom and its isolated components act increasing arterial blood pressure, heartbeat frequency and altered renal function.

Toxinas que atuam em canais para Na+ operados por voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos tóxicos do envenenamento escorpiônico e podem ser divididas em duas classes: a- e b-neurotoxinas. TsTX-V e TsTX-I da peçonha de Tityus serrulatus (TsV) são, respectivamente, exemplos destas toxinas. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos da TsV e destas toxinas sobre a pressão arterial média (PAM) e liberação de catecolaminas em ratos conscientes e não imobilizados, previamente cateterizados, bem como a captação de GABA, dopamina (DA) e glutamato (Glu) em sinaptosomas isolados de cérebro de ratos e a concentração citoplasmática de Ca+2 ([Ca+2 ]C) em células de músculo liso vascular de aorta de ratos. As toxinas foram isoladas por cromatografia de troca iônica (TsTX-I) seguida por CLAE de fase reversa (TsTX-V). As toxinas (15 e 30 g/kg) e TsV (50 e 100 g/kg) foram injetadas intravenosamente. A PAM foi monitorada continuamente através do cateter femoral. Os níveis plasmáticos de adrenalina (ADR) e noradrenalina (NA) foram determinados por CLAE de fase reversa com detector eletroquímico, em 10 min antes e 2,5, 30 e 90 min após os tratamentos. Efeitos pressores máximos foram observados em 2,5?3,5 min. TsV induziu um intenso aumento de longa duração na PAM, bem como a TsTX-I. A TsTX-V mostrou efeitos pressores menores. TsV mostrou os maiores efeitos sobre a liberação de catecolaminas, seguido pela TsTX-I e TsTX-V com um efeito máximo em 2,5 min, seguido por uma gradual redução, permanecendo, todavia, maior que os controles. Embora ambas as classes de toxinas atuem em canais para Na+, TsTX-I mostrou efeitos mais significantes e intensos sobre a liberação de catecolaminas e pressão arterial que a TsTX-V. Parece que a toxicidade da TsTX-V não está somente relacionada à sua capacidade de liberar catecolaminas, indicando que outros neutrotransmissores podem estar envolvidos em sua toxicidade. Nem a TsV ou suas toxinas foram capazes de afetar a captação de 3H-Glu. TsTXI inibiu somente a captação de 3H-DA (IC50 = 28,41 nM). Por outro lado, TsV (0,43ng/mL) inibiu a captação de 3H-GABA e 3H-DA (~50%). TsTX-V mostrou IC50 = 9,37 nM e 22,2 nM para a captação de 3H-GABA e 3HDA, respectivamente. Esses efeitos foram abolidos pelo pré-tratamento com TTX, indicando o envolvimento de canais para Na+ neste processo. Na ausência de Ca+2 e em baixas concentrações de toxinas, a redução não é tão singnificante como na presença de Ca+2. TsTX-V não reduziu a captação de 3H-GABA em células COS-7 expressando os transportadores de GABA, GAT-1 e GAT-3, sugerindo que esta toxina reduz indiretamente o transporte. A redução da captação de 3H-GABA pelos sinaptosomas pode ser devido a rápida e intensa despolarização celular, como revelado por microscopia confocal em células de glioma C6. Assim, TsTX-V causou redução da captação de 3H-GABA e 3H-DA de uma maneira independente de Ca+2, não afetando diretamente os transportadores de GABA, mas em consequencia da despolarização, envolvendo canais para Na+ operados por voltagem. TsV e suas toxinas foram capazes de aumentar a ([Ca2+ ]C , provavelmente por interargir com canais para Na+. Quando comparado aos efeitos despolarizantes do KCl 60 mM (100 %), TsV (100 e 500 g/mL) exibiu um aumento de 49,60 ± 2,58 % e 103,66 ± 5,17 %, respectivamente, enquanto que a TsTX-I e TsTX-V (50 e 100 g/mL de cada) exibiu 43,92 ± 3,06 % e 121,8 ± 8,9 %; 52,56 ± 8,33 % e 79,5 ± 6,1 % de aumento, respectivamente. TsTX-I (100 g/mL) mostrou-se mais potente nesta preparação, visto que uma dose de 100 g/mL causou efeito muito mais intenso do que a TsTX-V na mesma concentração. É possível que as diferenças observadas sobre os efeitos induzidos pela TsTX-I e TsTX-V sejam conseqüência de alterações estruturais entre canais para Na+ presentes em vários tipos de tecidos e inervações. / Voltage-gated Na+ channel toxins are mainly responsible for the toxic effects of scorpion envenoming and can be classified into two classes: a- and b-neurotoxins. TsTX-V and TsTX-I from Tityus serrulatus venom (TsV) are, respectively, examples of these toxins. In this work, were evaluate the effects of TsV and its toxins on mean arterial pressure (MAP) and catecholamines release in conscious unrestrained rats previously catheterized, as well as GABA, dopamine (DA) and glutamate (Glu) uptake in isolated rat brain synaptosomes and cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+ ]C) in vascular smooth muscle cells from rat aorta. Toxins were isolated by ion exchange chromatography (TsTX-I) followed by RP-HPLC (TsTX-V). The toxins (15 and 30 g/kg) and TsV (50 and 100 g/kg) were injected intravenously. MAP was continuously monitored through femoral catheter. Epinephrine (E) and norepinephrine (NE) plasma levels were determined by RP-HPLC with electrochemical detection, at 10 min before and 2.5, 30 and 90 min after treatments. Maximal pressor effects were observed at 2.5 3.5 min. TsV induced intense long lasting increase in MAP, as did TsTX-I. TsTX-V showed the lowest pressor effects. TsV showed the highest effects on catecholamines release, followed by TsTX-I and TsTX-V with maximal effect at 2.5 min, followed by a gradual reduction, however remaining higher than controls. Although both toxins act on Na+ channels, TsTX-I displayed significant and more intense effects on catecholamines release and blood pressure than TsTX-V. It seems that the toxicity of TsTX-V is not related only with its ability to release catecholamines, indicating that other neurotransmitters, may be involved in its toxicity. Neither the TsV or its toxins was capable to affect the 3H-Glu uptake. TsTX-I inhibited only 3H-DA uptake (IC50 = 28.41 nM). On the other hand, TsV (0.43ng/mL) inhibited both 3H-GABA and 3H-DA uptake (~50%). TsTX-V showed IC50 = 9.37 nM and 22.2 nM for 3H-GABA and 3H-DA uptake, respectively. These effects were abolished by pre-treatment with TTX, indicating the involvement of Na+ channels in this process. In the absence of Ca2+ and at low concentrations of toxin, the reduction is not as significant as in the presence of Ca2+. TsTX-V did not reduce 3H-GABA uptake in COS-7 cells expressing GABA transporters GAT-1 and GAT-3, suggesting that this toxin indirectly reduces the transport. The reduced 3H-GABA uptake by synaptosomes could be due to fast and intense cell depolarization as revealed by confocal microscopy of C6 glioma cells. Thus, TsTX-V causes reduction on 3H-GABA and 3H-DA uptake in a Ca2+-independent manner, not affecting directly GABA transporters, but, in consequence of depolarization, involving voltage-gated Na+ channels. TsV and its toxins were able to increase the ([Ca2+ ]C , probably by interact with Na+ channels. When compared to KCl 60 mM depolarizing effect (100 %), TsV (100 and 500 ?g/mL), showed an increase of 49.60 ± 2.58 % and 103.66 ± 5.17 %, respectively, whereas TsTX-I and TsTX-V (50 and 100?g/mL of each) showed 43.92 ± 3.06 % and 121.8 ± 8.9 %; 52.56 ± 8.33 % and 79.5 ± 6.1 %, respectively. TsTX-I (100 ?g/mL) showed most potent effects in this type of preparation, since induced most intense effect that TsTX-V in the same concentration. Thus, it is possible that the differences observed on the effects induced by both toxins are consequence of structural changes among Na+ channels present in several types of tissues and innervations .

The Simpson Mountains have long been of economic interest and have renewed interest in their potential value. Field mapping of the project area redefined structural relationships between stratigraphic units. Geometric and kinematic analysis of structures in the Simpson Mountains show the range is deformed by the three most recent tectonic events: the Sevier Orogeny, the Laramide Orogeny, and Basin and Range Extension. Laramide structures define the range with a significant E-W normal fault and an E-W thrust fault, which are both likely related to Eocene-age igneous intrusions. Principal component analysis (PCA) of regional quartzite X-ray Fluorescence (XRF) data resulted in distinctive populations between the Eureka Quartzite and the Mutual and Prospect Mountain Quartzites. The PCA was paired with petrographic analysis of regional quartzites where samples were diagnostically classified to help validate the PCA results. XRF analysis of volcanic rocks show volcanic arc origin. 40Ar/39Ar dating of the volcanic rocks associated with the intrusions yield new ages of 34.09±0.10 to 37.05±0.06 Ma and 19.11±0.02 to 19.18±0.03. Lithostratigraphy of the map area was validated by identification of fossil samples. The Eocene intrusions are likely sources of mineralization in the range along older Sevier structures.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células &#946; e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or &#946; cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin&#174;, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células &#946; e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or &#946; cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin&#174;, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.