O escorpião Tityus serrulatus (Ts) é o responsável pela maioria casos de envenenamento escorpiônicos do Brasil. Embora sua peçonha seja constituída de inúmeros componentes, as neurotoxinas apresentam maior relevância por interagirem especificamente com canais para sódio (Nav) ou potássio (Kv) dependentes de voltagem. Até o momento, já foram descritas 20 neurotoxinas (Ts1 -> Ts20) na peçonha do Ts. No entanto, através de análises ômicas, estima-se que este número seja bem superior. Toxinas que interagem seletivamente com canais iônicos são utilizadas como ferramentas farmacológicas, pois permitem a identificação de canais específicos e a determinação de seus papéis fisiológicos. Adicionalmente, estas toxinas podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratar doenças relacionadas a canais iônicos. Considerando o elevado potencial biotecnológicos desta classe de moléculas, o presente trabalho isolou (através de 3 etapas cromatográficas) e caracterizou uma nova toxina da peçonha de Ts, denominada Ts19 Frag-II. A nova toxina demonstrou possuir 49 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 5534,54012 Da. Classificada como ?-KTx, especula-se que a Ts19 Frag-II seja produzida a partir de uma modificação pós-transducional, denominada neste estudo de post-splitting, de um transcrito da Ts19. A caracterização funcional da Ts19 Frag-II foi realizada utilizando diferentes ensaios de atividade biológica. Uma extensa avaliação eletrofisiológica em canais iônicos (16 Kvs e 5 Navs) expressos em oócitos de X. leavis demonstrou que a toxina é capaz de bloquear seletivamente canais para potássio do tipo Kv1.2 (IC50 = 544 ± 32 nM). Ensaios in vivo (camundongos C57BL/6) de dor revelaram que a Ts19 Frag-II (2 e 4?g) não é capaz de induzir comportamento nociceptivo espontâneo ou mecânico em camundongos, tanto pela administração intraplantar quanto pela via intratecal. Ensaios in vivo (camundongos BALB/c) também demonstraram que a nova toxina (4 e 8?g) induz aumento dos níveis séricos de ureia, ALT, ?-globulina, IL-6, TNF-?, IL-17A e NO, além de diminuir a quantidade de ?-globulinas. Adicionalmente, utilizando ensaios in vitro de cultura celular de linfócitos T CD4+, demonstrou-se que a Ts19 Frag-II (2 ?g) foi capaz de diminuir a diferenciação de células Th17, assim como suprimir sua função (diminuiu a produção de IL-17 e IL-22). Assim, no presente estudo foi realizado o isolamento e a caracterização molecular e funcional de uma nova toxina de Ts, a qual apresentou atividade neurotóxica e pró-inflamatória, podendo contribuir significativamente para a gravidade do quadro de envenenamento ocasionado pelo escorpião Ts. Adicionalmente, sua seletividade para canais Kv1.2 faz com que Ts19 Frag-II possa ser utilizada como ferramenta de estudo deste canal iônico / The scorpion Tityus serrulatus (Ts) is responsible for most cases of scorpion envenomations in Brazil. Although its venom consist of many components, neurotoxins present major relevance because their specific interaction with voltage-gated sodium (Nav) or potassium (Kv) channels. So far, 20 neurotoxins have been described (Ts1 -> Ts20) in the Ts venom. However, omics analysis indicate that this number is much higher. Toxins that interact selectively with ion channels are used as pharmacological tools, as they allow the identification of specific channels and the determination of their physiological roles. Additionally, these toxins may be used for the development of new drugs for treating disorders related to ion channels. Considering the high biotechnology potential of this class of molecules, this study isolated (by 3 chromatographic steps) and characterized a new toxin from Ts venom, named Ts19 Frag-II. The novel toxin presented 49 amino acid residues and a molecular mass of 5534.54012 Da. Classified as ? - KTx, it is speculated that the Ts19 Frag-II is produced from a post- translational modification, referred in this study as post- splitting, a transcript of Ts19. The functional characterization of Ts19 Frag-II was performed using different biological assays. The extensive electrophysiological study on ion channels (16 Kvs and 5 Navs) expressed in oocytes of X. leavis showed that the toxin is able to selectively block the potassium channel Kv1.2 (IC50 = 544 ± 32 nM). In vivo assays (C57BL/6 mice) of nociception showed that Ts19 Frag-II (2 and 4?g) is not able to induce spontaneous or mechanical nociceptive behavior in mice, both by intraplantar as by intrathecal administration. In vivo assays (BALB/c mice) also demonstrated that the novel toxin (4 and 8?g) increased serum levels of urea, ALT, ?-globulin, IL-6, TNF-?, IL-17A and NO, besides decreasing ?-globulins. In addition, using in vitro assays of CD4+ T-lymphocyte cell culture, it was demonstrated that Ts19 Frag-II (2 ug) was able to decrease the differentiation of Th17 cells, as well as it suppresses Th17 function (decreased IL-17 and IL-22 production). Therefore, the present study isolated and performed the molecular and functional characterization of a new toxin from Ts, which presented neurotoxic and pro-inflammatory activity and could contribute significantly to the severity of the envenoming caused by the Ts scorpion. Moreover, based on its selectivity for Kv1.2 channels, this toxin could be used as a tool to study this type of ion channel

Introdução: Escorpionismo é um problema de saúde no Brasil e em outras regiões do mundo. Em 2015, no Brasil, foram relatados 74.598 acidentes e 119 mortes. Neste estudo, foram descritos aspectos clínicos, epidemiológicos, laboratoriais e de vulnerabilidade nestes acidentes. Métodos: Trata-se de estudo clínico prospectivo e observacional conduzido no Hospital Municipal de Santarém (HMS), de Abril de 2008 a Janeiro de 2014. Os pacientes incluídos no estudo foram admitidos pelo autor e não representam o total de pacientes internados no HMS. Além disso, foi realizado estudo qualitativo com base teórica no conceito de vulnerabilidade que inclui as dimensões individual, social e programática. Resultados: Foram descritos 58 acidentes, presumivelmente, causados por T. obscurus na Amazônia Brasileira. A maioria dos acidentes ocorreu durante o trabalho, a maioria dos pacientes incluídos era do sexo masculino 39 (67,2%). Os principais locais de picada foram as extremidades (pés e mãos) com uma frequência de 51 (90%). Os pacientes relataram sensação de \"choques elétricos\" que podem durar horas. A grande maioria dos pacientes apresenta quadro clínico compatível com disfunção cerebelar aguda, que pode ter início minutos e durar até dois dias após a ocorrência do acidente. Apresentaram ataxia cerebelar, disdiadococinesia, dismetria, disartria, dislalia, naúseas e vômitos. Além disso, alguns pacientes, aprentaram mioclonias e fasciculações que também podem ser atribuídas à disfunção cerebelar aguda ou talvez à ação direta sobre o músculo esquelético. Seis pacientes apresentaram rabdomiólise e dois injúria renal aguda. O quadro clínico observado na maioria dos pacientes consiste, principalmente, em disfunção cerebelar aguda e manifestações neuromusculares anormais, que não foram descritos em qualquer outra região do mundo. Também foram realizadas 28 entrevistas quanti-qualitativas com pacientes vítimas de acidente escorpiônico, as quais foram submetidas à técnica de análise de discurso. Pacientes eram, em sua maioria, homens que moravam na área rural e que trabalhavam como agricultores e viviam em condições sócio demográficas desfavoráveis. Discussão: As manifestações apresentadas por esses pacientes são compatíveis com disfunção cerebelar aguda que pode ser explicada, provavelmente, porque algumas toxinas de T. obscurus (da região de Santarém), não só tem a capacidade de atravessar rapidamente, em poucos minutos, a barreira hemato-encefálica, mas também devem apresentar elevada afinidade por canais iônicos presentes nas membranas de células do cerebelo. As mioclonias e fasciculações podem ser atribuídas à disfunção muscular ou cerebelar. A vulnerabilidade individual e social foi evidenciada em vários aspectos: pouco conhecimento em relação ao comportamento de escorpiões e também às medidas preventivas, baixa escolaridade (incluindo analfabetismo), baixa qualificação profissional, trabalho informal, condições precárias de vida (falta de água encanada, energia elétrica, esgoto). Em relação à dimensão programática foi constatada dificuldade de acesso aos serviços de saúde e a falta de antiveneno no centro de referência. Portanto, o estudo destaca as particularidades do escorpionismo em Santarém e os aspectos mais importantes da vulnerabilidade destes pacientes / Introduction: Scorpionism is a health problem in Brazil and in another regions of the world. In 2015, in Brazil 74,598 accidents and 119 deaths were reported. In this study, were described clinical, epidemiologic, laboratory and vulnerability aspects of these unique scorpion accidents. Methods: A prospective and observational study was conducted in the MHS, from April, 2008 to January, 2014. Patients included in the study were admitted by the authors and do not represent the total number of hospitalized patients in the MHS. In addition, a qualitative study was conducted with the theoretical basis of the vulnerability concept, that includes individual, social and programmatic dimension. Results: We described 58 accidents presumably caused by T. obscurus in Brazilian Amazonia. Most patients were stung during work activities and the majority was male 39 (67.2%). The main sites of stung were the extremities (feet and hands), with a frequency of 51 (90%).Patients reported a sensation of \"electric shocks\" which could last hours. The vast majority of patients presented a clinical picture compatible with acute cerebellar dysfunction, that started in minutes and could last up to two days after the accident. They presented cerebellar ataxia, dysdiadocokinesia, dysmetry, dysarthria, dyslalia, nausea and vomiting. Also, some patients presented myoclonus and fasciculation which can also be attributed to cerebellar dysfunction or perhaps the result of direct action on skeletal muscle. Six patients had developed rhabdomyolysis and two acute kidney injury. The clinical picture observed in most of our patients consisted mainly from an acute cerebellar dysfunction and abnormal neuromuscular manifestations which is not described in any other region of the world. Twenty-eight quantitative and qualitative interviews with scorpion sting victims. Each patient was submitted to discourse analysis technique. The majority patients were men who live in rural areas, small farmers with unfavorable socio-demographic conditions. Discussion: The manifestations presented by these patients are compatible with acute cerebellar dysfunction which could be explained probably because some toxins from T. obscurus from Santarém region, have not only the capacity to cross quickly, within minutes, the blood-brain and also must have high affinity for ionic channels present in some cerebellar cell membranes. Myoclonus and fasciculation can be attributed to cerebellar or muscle dysfunction. The individual and social vulnerability was demonstrated in several ways: little knowledge about the scorpion behavior and about the preventive measures, low education level (including illiteracy), low-skilled, informal work, precarious living conditions (lack of running water, electricity, basic sanitation). Regarding the programmatic dimension it was found difficult access to health services and lack of antivenom serum in the reference center. Therefore, the study highlights the particularities of scorpionism in Santarem and the most important aspects of vulnerability of these patients

O escorpião Tityus serrulatus é o responsável pelos acidentes mais graves no Brasil. Dentre os componentes já estudados de sua peçonha estão neurotoxinas capazes de interagir com canais iônicos, além de peptídeos biologicamente ativos também estarem presentes. Neste estudo foram isolados peptídeos da fração de baixa massa molecular da peçonha que interagiram com as oligopeptidases timet oligopeptidase (EP24.15) e neurolisina (EP24.16) através do emprego de substratos fluorescentes específicos como ferramentas. Usando espectrometria de massas, as sequências KEILG, FTR, YLPT e do análogo KELLG foram determinadas e posteriormente sintetizadas. In vitro, os peptídeos não foram substratos para enzimas já citadas, além de testes com a neprelisina e ECA. Em relação à inibição, os destaques ficam por conta de KELLG e KEILG, capazes de inibirem a EP 24.15 e de não inibirem a EP 24.16. Outro destaque foi o YLPT, apresentando um Ki de 0,94 mM perante a neprilisina. In vivo os peptídeos foram testados em relação à nocicepção, rolamento de leucócitos e reatividade vascular, onde se destacou o FTR, apresentando efeito antinociceptivo e o KEILG, capaz de aumentar o número de leucócitos, ressaltando a importância de pequenas moléculas na composição da peçonha. / The scorpion Tityus serrulatus is responsible for the most serious accidents in Brazil. Among the components already studied in its venom, neurotoxins are able to interact with ion channels, and peptides with biological activity are also present. In this study, peptides from low molecular weight fraction of the venom that interacted with the oligopeptidases thimet oligopeptidase (EP24.15) and neurolysin (EP24.16) were isolated using specific fluorescent substrates as a tool. Sequences from the peptides KEILG, FTR, YLPT and the analogue KELLG were determined by mass spectrometry and subsequently synthesized. In vitro, the peptides were not substrates for those enzymes, neither for neprilysin and ACE enzymes. Concerning inhibition, the highlights are the KELLG and KEILG, which were able to inhibit EP 24.15 but not EP 24.16. Another peptide thats worth to mention is YLPT, with a Ki of 0.94 mM for neprilysin. In vivo, the peptides were tested for nociception, rolling of leukocytes and vascular reactivity, being the FTR distinguished to be able to cause antinociceptive effect and KEILG to increase the number of leukocytes. These results emphasize the importance of small molecules in the scorpion venom constitution.

Introdução: Escorpionismo é um problema de saúde no Brasil e em outras regiões do mundo. Em 2015, no Brasil, foram relatados 74.598 acidentes e 119 mortes. Neste estudo, foram descritos aspectos clínicos, epidemiológicos, laboratoriais e de vulnerabilidade nestes acidentes. Métodos: Trata-se de estudo clínico prospectivo e observacional conduzido no Hospital Municipal de Santarém (HMS), de Abril de 2008 a Janeiro de 2014. Os pacientes incluídos no estudo foram admitidos pelo autor e não representam o total de pacientes internados no HMS. Além disso, foi realizado estudo qualitativo com base teórica no conceito de vulnerabilidade que inclui as dimensões individual, social e programática. Resultados: Foram descritos 58 acidentes, presumivelmente, causados por T. obscurus na Amazônia Brasileira. A maioria dos acidentes ocorreu durante o trabalho, a maioria dos pacientes incluídos era do sexo masculino 39 (67,2%). Os principais locais de picada foram as extremidades (pés e mãos) com uma frequência de 51 (90%). Os pacientes relataram sensação de \"choques elétricos\" que podem durar horas. A grande maioria dos pacientes apresenta quadro clínico compatível com disfunção cerebelar aguda, que pode ter início minutos e durar até dois dias após a ocorrência do acidente. Apresentaram ataxia cerebelar, disdiadococinesia, dismetria, disartria, dislalia, naúseas e vômitos. Além disso, alguns pacientes, aprentaram mioclonias e fasciculações que também podem ser atribuídas à disfunção cerebelar aguda ou talvez à ação direta sobre o músculo esquelético. Seis pacientes apresentaram rabdomiólise e dois injúria renal aguda. O quadro clínico observado na maioria dos pacientes consiste, principalmente, em disfunção cerebelar aguda e manifestações neuromusculares anormais, que não foram descritos em qualquer outra região do mundo. Também foram realizadas 28 entrevistas quanti-qualitativas com pacientes vítimas de acidente escorpiônico, as quais foram submetidas à técnica de análise de discurso. Pacientes eram, em sua maioria, homens que moravam na área rural e que trabalhavam como agricultores e viviam em condições sócio demográficas desfavoráveis. Discussão: As manifestações apresentadas por esses pacientes são compatíveis com disfunção cerebelar aguda que pode ser explicada, provavelmente, porque algumas toxinas de T. obscurus (da região de Santarém), não só tem a capacidade de atravessar rapidamente, em poucos minutos, a barreira hemato-encefálica, mas também devem apresentar elevada afinidade por canais iônicos presentes nas membranas de células do cerebelo. As mioclonias e fasciculações podem ser atribuídas à disfunção muscular ou cerebelar. A vulnerabilidade individual e social foi evidenciada em vários aspectos: pouco conhecimento em relação ao comportamento de escorpiões e também às medidas preventivas, baixa escolaridade (incluindo analfabetismo), baixa qualificação profissional, trabalho informal, condições precárias de vida (falta de água encanada, energia elétrica, esgoto). Em relação à dimensão programática foi constatada dificuldade de acesso aos serviços de saúde e a falta de antiveneno no centro de referência. Portanto, o estudo destaca as particularidades do escorpionismo em Santarém e os aspectos mais importantes da vulnerabilidade destes pacientes / Introduction: Scorpionism is a health problem in Brazil and in another regions of the world. In 2015, in Brazil 74,598 accidents and 119 deaths were reported. In this study, were described clinical, epidemiologic, laboratory and vulnerability aspects of these unique scorpion accidents. Methods: A prospective and observational study was conducted in the MHS, from April, 2008 to January, 2014. Patients included in the study were admitted by the authors and do not represent the total number of hospitalized patients in the MHS. In addition, a qualitative study was conducted with the theoretical basis of the vulnerability concept, that includes individual, social and programmatic dimension. Results: We described 58 accidents presumably caused by T. obscurus in Brazilian Amazonia. Most patients were stung during work activities and the majority was male 39 (67.2%). The main sites of stung were the extremities (feet and hands), with a frequency of 51 (90%).Patients reported a sensation of \"electric shocks\" which could last hours. The vast majority of patients presented a clinical picture compatible with acute cerebellar dysfunction, that started in minutes and could last up to two days after the accident. They presented cerebellar ataxia, dysdiadocokinesia, dysmetry, dysarthria, dyslalia, nausea and vomiting. Also, some patients presented myoclonus and fasciculation which can also be attributed to cerebellar dysfunction or perhaps the result of direct action on skeletal muscle. Six patients had developed rhabdomyolysis and two acute kidney injury. The clinical picture observed in most of our patients consisted mainly from an acute cerebellar dysfunction and abnormal neuromuscular manifestations which is not described in any other region of the world. Twenty-eight quantitative and qualitative interviews with scorpion sting victims. Each patient was submitted to discourse analysis technique. The majority patients were men who live in rural areas, small farmers with unfavorable socio-demographic conditions. Discussion: The manifestations presented by these patients are compatible with acute cerebellar dysfunction which could be explained probably because some toxins from T. obscurus from Santarém region, have not only the capacity to cross quickly, within minutes, the blood-brain and also must have high affinity for ionic channels present in some cerebellar cell membranes. Myoclonus and fasciculation can be attributed to cerebellar or muscle dysfunction. The individual and social vulnerability was demonstrated in several ways: little knowledge about the scorpion behavior and about the preventive measures, low education level (including illiteracy), low-skilled, informal work, precarious living conditions (lack of running water, electricity, basic sanitation). Regarding the programmatic dimension it was found difficult access to health services and lack of antivenom serum in the reference center. Therefore, the study highlights the particularities of scorpionism in Santarem and the most important aspects of vulnerability of these patients

Major constituents of the venom of various animals are peptidogenic in nature. Marine snails belonging to the species Conus are venomous predators that use small, structurally constrained peptides present in their venom for prey capture and defense. It is known that ~500 Conus species are present in nature and the venom of each of these Conus species is a complex mixture of nearly 100 peptides accounting for > 50,000 peptides with little overlap among the different species. The peptides isolated from the venom of Conus species are commonly known as conotoxins or conopeptides. Some of the common targets of these peptides include the different ion channels like Na+, K+, and Ca2+, and receptor subtypes such as nicotinic acetylcholine and NMDA receptors. The ion channels and receptor subtypes were targeted by conopeptides with high degree of specificity and selectivity. The structural information on the peptides from cone snails can prove to be a valuable starting tool for the understanding of the function of different ion channels and hence in the design of neuropharmacologically active drugs. Conotoxins are disulfide-rich peptides and the number of disulfide generally ranges from two to five. Based on the arrangement of cysteines in their primary sequence, they are classified into different superfamilies. The signal sequences of the precursors belonging to a particular superfamily are highly conserved and hence the members within the same family have, in common, the unique disulfide arrangement and pharmacological activity. Conotoxins are classified into eleven superfamilies till date. In order to understand the underlying the principles involved in the action of these peptides on different ion channels, one needs to know the three-dimensional structures which, in potential, will help in the identification of the pharmacophores responsible for the observed pharmacological activity. With the aim of studying the structure-activity relationships found among the conotoxins, we have initiated a study on the peptides isolated from the marine snails found in the Indian coastal waters. This thesis is focused in the structural studies of the peptide toxins from marine cone snails and a terrestrial scorpion. The tool used for the structural studies of these peptide toxins is Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Chapter 1 provides an overview of the peptide toxins found among various animal species with more emphasis on conotoxins and scorpion toxins. In addition, the rationale behind the present study has also been explained. Chapter 2 describes the structure determination of two conopeptides isolated from Conus amadis, δ-Am2766 and Am2735, which are active on mammalian sodium channels. The structural aspects and comparison with other known conopeptides belonging to the same superfamily as that of these two peptides have also been described. Solution NMR studies of Ar1446 and Ar1248, two conopeptides isolated from the species Conus araneosus have also been studied using Homonuclear NMR methods. Ar1446 is a three disulfide-bonded peptide. Our studies have revealed that this peptide has a novel disulfide connectivity not previously observed in the M superfamily or any other superfamily of conotoxins. The structural features of Ar1446 will be described along with the NMR studies on two-disulfide bonded peptide, Ar1248, belonging to the A-superfamily of conotoxins. The main problem faced in the kind of study of peptides isolated from natural sources is the amount that can be isolated and purified to homogeneity. In order to obtain large quantities of peptides, we have successfully used Cytochrome b5 as fusion host to clone, over express and purify these peptides using recombinant methods. The use of recombinant methods has aided in the preparation of isotopically enriched peptides. The use of cyt b5 as fusion host for the large scale production of some of the peptides from Indian marine snails is described in Chapter 4. A novel pharmacologically active linear peptide, Mo1659 isolated from Conus monile, have been studied using Heteronuclear NMR methods. This peptide was cloned, over expressed and purified using Cytochrome b5 as a fusion host. Another linear peptide, Mo1692 (also from Conus monile), has been prepared using the same method and was studied using Homonuclear NMR methods. Both these peptides were liberated from the fusion host using cyanogen bromide cleavage and were subsequently purified using RP-HPLC. The results of the biosynthetic preparation and NMR studies of these two peptides have been described in Chapter 5. Chapter 6 describes the solution structure determination of a novel scorpion toxin characterized in the venom of the Indian red scorpion Buthus tamulus. The cloning, over expression, folding and purification of BTK-2 is described here. The structure and the function of this recombinantly produced BTK-2 will also be described.

En aquest treball de tesi doctoral es descriu l'estructura gonadal, gametogènesi i cicle anual de Scorpaena porcus, S. scrofa i S. elongata per tal d'aprofundir en el coneixement dels diferents graus d'especialització dins l'oviparisme en peixos. Es pretén fer èmfasi en aquells trets inusuals que difereixen del què s'ha descrit fins ara per la majoria de les espècies ovípares de teleostis, i relacionar-los amb l'estratègia reproductiva de les espècies que els presentenEl mostreig s'ha dut a terme de forma intensiva entre l'any 2000 i 2002, tot i que s'ha continuat recol·lectant mostres fins a l'agost de 2004, amb més o menys freqüència segons la necessitat. En total s'han obtingut 258 exemplars de S. porcus, 119 de S. scrofa i 46 de S. elongata.S'ha pogut veure com S. porcus, S. scrofa i S. elongata són espècies ovípares ovulípares especialitzades, ja que la seva estructura ovàrica presenta tot una sèrie de trets molt particulars i poc comuns a la resta de peixos ovípars estudiats fins ara: posició central del raquis musculo-connectiu que es troba envoltat completament pel lumen i la paret ovàrica; presència de peduncles en oòcits en fase de creixement secundari; escassetat i mida petita dels alvèols corticals; poc gruix de la zona radiata; i secreció d'una massa gelatinosa que engloba els ous en el moment de la posta. Totes aquestes característiques també s'han observat en Scorpaena notata, suggerint que l'especialització de l'oviparisme ovulípar es dóna en tot el gènere Scorpaena.L'estructura testicular i l'espermatogènesi d'aquestes espècies també és força particular. Per una banda els testicles són del tipus lobular no-restringit, tot i que presenten algunes característiques com la ordenació parcial dels cists segons l'estadi de maduració de les cèl·lules germinals que contenen i l'absència de lumen central, que actualment només s'ha observat en testicles del tipus lobular restringit de les espècies de la sèrie Aterinomorpha. Per l'altre banda, l'espermatogènesi és del tipus semicística, és a dir, els cists s'obren abans d'acabar tot el procés i les cèl·lules germinals s'acaben de desenvolupar a la llum del lòbul fins a espermatozoides.La posta d'aquestes espècies és múltipla i constisteix en una massa gelatinosa d'ous pelàgica, que en el cas de S. porcus s'alliberen entre els mesos de juny i agost, i en S. scrofa, a partir del mes de juliol. S'ha relacionat la presència d'aquesta massa amb un aparellament mascle-femella, de manera que el mascle alliberaria l'esperma directament sobre la massa d'ous, assegurant així la fartilització total dels mateixos. / The present work describes gonadal structure, gametogenesis and annual cycle of Scorpaena porcus, S. scrofa and S. elongate, to go more deeply into the knowledge of different degree of oviparity specialization in fishes. We pretend to emphasize unusual features that diverge from those that have been described until now for oviparous teleosts.Sampling was performed intensively between years 2000 and 2002. However, collection of specimens was continued until August 2004 sporadically according to experimental needs. We obtained a total of 258 specimens of S. porcus, 119 of S. scrofa and 46 of S. elongata.S. porcus, S. scrofa and S. elongata are specialized ovuliparous species. The ovary showed many characteristics that are not typical for oviparous fishes: central ovarian stroma, pedunculate oocytes, scarcity and small size of cortical alveoli, thinness of the zona radiata, and a gelatinous matrix secreted during the maturation. All these features also were observed in Scorpaena notata suggesting that specialized ovuliparity probably occurs in the entire genus Scorpaena.Testicular structure and spermatogenesis are unusual too. On one hand, these three species have an unrestricted lobular testis. However, they present a partial arrangement of cists according to the stage of development of germinal cells, and they don't have central lumen, two features that currently have only been described for the restricted lobular testes of aterinomorph fishes. On the other hand, spermatogenesis is semicystic: cysts open before the end of spermatogenesis, which is then completed in the lobule lumen.These species are multiple spawning fishes, and they release a pelagic gelatinous mass of eggs. Spawning in S. porcus occurs between June and August, and in S. scrofa begins in July. The presence of the gelatinous mass of eggs has been related to a mating behaviour between male and female that guarantees the fertilization of the whole pond.

Acidentes escorpiônicos podem evoluir com edema pulmonar de origem cardiogênica e não cardiogênica. O clearance de edema pulmonar está relacionado principalmente ao transporte ativo de sódio do espaço alveolar para o interstício. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do veneno de Tityus serrulatus e da dexametasona sobre a expressão dos transportadores de sódio e água e do TLR4 em pulmão de ratos. Foram utilizados ratos Wistar, divididos em três grupos: controle (salina); grupo Vn, que recebeu o veneno de T. serrulatus (3.8 mg/kg) por via intraperitoneal (ip), e o grupo Dx+Vn, que recebeu dexametasona (2.0 mg/kg) por via ip, uma hora antes da injeção do veneno. Os experimentos foram realizados uma hora após a injeção do veneno. Foram realizadas análise bioquímica e dosagens de citocinas no plasma. Nos pulmões foram estudados a expressão de -ENaC, Na+-K+- ATPase, NKCC1, AQP-5 e TRL4 através de western blotting, e a expressão do NF-kB e infiltração de células CD68+ (monócitos/macrófagos) e neutrófilos, através de imunoistoquímica. O veneno de T. serrulatus diminuiu a expressão pulmonar de -ENaC e AQP-5, enquanto aumentou a expressão do NKCC1. A dexametasona preveniu os efeitos do veneno sobre a expressão da -ENaC e NKCC1, mas não da AQP5. Não foi observada alteração da expressão da 1- Na+-K+-ATPase . A expressão do TLR4 foi maior nos animais envenenados que nos grupos Cont e Dx+Vn. O níveis plasmáticos de IL-6, IL-10 e TNF- estavam aumentados nos grupo Vn e Dx+Vn em relação ao controle. O infiltrado de células CD68+ foi maior no grupo Vn. A expressão de NF-kB e o infiltrado ne neutrófilos no tecido pulmonar foi semelhantes nos três grupos avaliados. Os resultados encontrados sugerem que o veneno de T. serrulatus tem efeito sobre as proteínas transportadoras de sódio em células do epitélio alveolar e também sobre a expressão do TLR4 em pulmão; a dexametasona pode regular essas ações / Scorpion envenomation can cause cardiogenic and noncardiogenic pulmonary edema. Pulmonary edema clearance is largely related to active Na+ transport out of the alveoli, rather than to reversal of Starling forces. Our objective was determine the effects of Tityus serrulatus venom and dexamethasone on the pulmonary expression of sodium and water transporters, and Toll-like receptor 4. Wistar rats were divided into groups and injected intraperitoneally: control (saline only); venom (T. serrulatus venom3.8 mg/kg body weight); and dexamethasone+venom (dexamethasone2.0 mg/kg body weight60 min before venom inoculation). At 60 min after venom inoculation, interleukin-6 and -10, together with tumor necrosis factor alpha, were analyzed in plasma. In lungs, we determined expression of the epithelial sodium channel alpha subunit; Na,K-ATPase alpha 1 subunit; Na-K-2Cl cotransporter, NKCC1; aquaporin 5; Toll-like receptor 4 (by Western blotting); and nuclear factor-kappa B. We determined CD68 and neutrophil counts by immunohistochemistry. In venom group lungs, the epithelial sodium channel alpha subunit and aquaporin 5 were markedly downregulated, whereas NKCC1 was elevated, although the Na,K-ATPase alpha 1 subunit was unaffected. Dexamethasone protected the epithelial sodium channel alpha subunit, NKCC1, and Toll-like receptor 4 but not aquaporin 5. Serum interleukin 6, interleukin 10, and tumor necrosis factor alpha were elevated in both groups, as was CD68 expression. Neutrophil counts and nuclear factor-kappa B expression were comparable across groups. Our data show that T. serrulatus venom alters sodium transport in alveolar epithelial cells and increases Toll-like receptor 4 expression. Dexamethasone appears to partially protect against those effects

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KarlaSRS_DISSERT.pdf: 1043219 bytes, checksum: 938627d329c6e5c7035c19c1680aa246 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In Brazil, several species of scorpions are known to cause accidents which can lead to death, which are mainly belonging to the genus Tityus. The scorpion Tityus serrulatus is the main responsible for more severe cases. Anti-scorpion serums are routinely produced by various institutions, despite their effectiveness, quality and action depends on how quickly treatment is started. Studies have been developed in the search for appropriate technologies to encapsulate and release recombinant or natives proteins capable of inducing antibody production. In this context, chitosan copolymer which can be obtained from the partial deacetylation of chitin or in some microorganisms and it is biocompatible and biodegradable has been widely used for this purpose. This study aimed to search for a system release from chitosan nanoparticles for peptide / protein of the venom of the scorpion T. serrulatus, able to provide a new model of immunization in animals, in order to obtain a potential novel polyclonal serum, anti-venom T. serrulatus. The chitosan nanoparticles were prepared by ionic gelation with polyanion tripolyphosphate (TPP). After standardizing the concentrations of TPP and chitosan was evaluated the efficiency of incorporation of bovine serum albumin (BSA) and scorpion venom, showed particle size compatible with the intended purpose. The particles showed adequate size around 200nm. The crosslinking was confirmed by absorption spectroscopy in the infrared. After verified the high encapsulation efficiency (EE) for acid bicincon?nico method (BCA) protein assay and the particle size distribution, the success of the technique was proven and the potential for in vivo application of nanoparticles. The experimental animals were vaccinated and the antibodies measured by ELISA / No Brasil, diversas esp?cies de escorpi?es s?o conhecidas por provocar acidentes que podem levar ao ?bito, sendo estas pertencentes principalmente ao g?nero Tityus. O escorpi?o Tityus serrulatus ? o principal respons?vel pelos casos de maior gravidade. Soros anti-escorpi?nicos s?o produzidos rotineiramente por diversas institui??es, e, apesar da sua efic?cia, a a??o depende da qualidade e da rapidez com que ? iniciado o tratamento. V?rios estudos t?m sido desenvolvidos na busca de tecnologias adaptadas para encapsular e liberar prote?nas nativas e/ou recombinantes capazes de induzir a produ??o de anticorpos. Neste contexto, a quitosana um copol?mero que pode ser obtida a partir da desacetila??o parcial da quitina ou em alguns microrganismos e por ser biocompat?vel e biodegrad?vel tem sido amplamente utilizada para esta finalidade. O presente trabalho teve como objetivo a busca de um sistema de libera??o a partir de nanopart?culas de quitosana para pept?deos/prote?nas do veneno do escorpi?o T. serrulatus, capaz de proporcionar um novo modelo de imuniza??o em animais, com a finalidade para potencial obten??o de um soro policlonal in?dito, anti-veneno de T. serrulatus. As nanopart?culas de quitosana foram preparadas por gelifica??o i?nica com tripolifosfato poliani?nico (TPP). Ap?s padronizar as concentra??es de TPP e de quitosana, foi avaliado a efici?ncia de incorpora??o de Albumina Soro Bovina (BSA) e o veneno do escorpi?o, apresentaram tamanho de part?cula compat?vel com a finalidade pretendida. As part?culas apresentaram tamanho adequado em torno de 200nm. A reticula??o foi comprovada por espectroscopia de absor??o na regi?o do infravermelho (IV). Ap?s verificar a alta efici?ncia de encapsula??o (EE) pelo m?todo do ?cido bicincon?nico (BCA) de dosagem de prote?na e a distribui??o do tamanho de part?culas, foi comprovado o sucesso da t?cnica e o potencial para aplica??o in vivo das nanopart?culas. Os animais experimentais foram vacinados e os anticorpos dosados pela t?cnica de ELISA

Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1

O escorpião Tityus serrulatus é o responsável pelos acidentes mais graves no Brasil. Dentre os componentes já estudados de sua peçonha estão neurotoxinas capazes de interagir com canais iônicos, além de peptídeos biologicamente ativos também estarem presentes. Neste estudo foram isolados peptídeos da fração de baixa massa molecular da peçonha que interagiram com as oligopeptidases timet oligopeptidase (EP24.15) e neurolisina (EP24.16) através do emprego de substratos fluorescentes específicos como ferramentas. Usando espectrometria de massas, as sequências KEILG, FTR, YLPT e do análogo KELLG foram determinadas e posteriormente sintetizadas. In vitro, os peptídeos não foram substratos para enzimas já citadas, além de testes com a neprelisina e ECA. Em relação à inibição, os destaques ficam por conta de KELLG e KEILG, capazes de inibirem a EP 24.15 e de não inibirem a EP 24.16. Outro destaque foi o YLPT, apresentando um Ki de 0,94 mM perante a neprilisina. In vivo os peptídeos foram testados em relação à nocicepção, rolamento de leucócitos e reatividade vascular, onde se destacou o FTR, apresentando efeito antinociceptivo e o KEILG, capaz de aumentar o número de leucócitos, ressaltando a importância de pequenas moléculas na composição da peçonha. / The scorpion Tityus serrulatus is responsible for the most serious accidents in Brazil. Among the components already studied in its venom, neurotoxins are able to interact with ion channels, and peptides with biological activity are also present. In this study, peptides from low molecular weight fraction of the venom that interacted with the oligopeptidases thimet oligopeptidase (EP24.15) and neurolysin (EP24.16) were isolated using specific fluorescent substrates as a tool. Sequences from the peptides KEILG, FTR, YLPT and the analogue KELLG were determined by mass spectrometry and subsequently synthesized. In vitro, the peptides were not substrates for those enzymes, neither for neprilysin and ACE enzymes. Concerning inhibition, the highlights are the KELLG and KEILG, which were able to inhibit EP 24.15 but not EP 24.16. Another peptide thats worth to mention is YLPT, with a Ki of 0.94 mM for neprilysin. In vivo, the peptides were tested for nociception, rolling of leukocytes and vascular reactivity, being the FTR distinguished to be able to cause antinociceptive effect and KEILG to increase the number of leukocytes. These results emphasize the importance of small molecules in the scorpion venom constitution.