Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 90-99).

Ce travail de thèse porte sur l’étude des régulations post-transcriptionnelles en réponse à la lumière chez A.thaliana. Nous avons étudié deux systèmes de réponse à la lumière, la régulation traductionnelle des antennes photosynthétiques (Lhc) et la régulation de la voie des anthocyanes par le RNA silencing permettant la photoprotection. Dans une première partie nôtre approche a permis de montrer que la lumière a un impact sur le niveau de traduction global. De plus nous avons pu mettre en évidence que certaines Lhc sont régulées de façon traductionnelles en réponse à la lumière. Cette régulation pourrait être une composante du signal rétrograde entre le chlorolaste et le noyau. En parrallèle dans une seconde partie nous avons caractérisé la voie TAS4 de RNA silencing chez les plantes. Cette voie est mise en place en réponse à la forte lumière et régule l’accumulation des anthocyanes. / This work concerned post-transcriptional regulations in response to light in Arabidopsis thaliana. We are interested in two light responsive systems, translational regulation of the photosynthetic antenna protein and the regulation of the anthocyanin pathway by RNA silencing.In a first part we have shown that light affects global translation level. Furthermore our data indicate that some Lhc proteins are regulated at translational level in response to light. It seems that transaltional regulation of Lhc is a part of retrograde signaling between chlroroplast and nuclear. In a second part we have characterized the TAS4 RNA silencing pathway in Arabidopsis. We show that TAS4 regulate the accumulation of anthocyanin pathway in respose to high light.

RNA silencing is a cellular mechanism of post-transcriptional gene regulation which is highly conserved among the plant and animal kingdoms of life, and plays a critical part of developmental biology, maintenance of homeostasis, and host-pathogen interactions. The pathway is engaged by small double-stranded (ds)RNA molecules (small RNAs), which effect sequence specific gene silencing by targeting complementary RNA sequences. There are several classes of small RNAs which engage the pathway. MicroRNAs (miRNAs) are expressed in the genome as endogenous regulators of gene expression. Short-interfering RNAs (siRNAs) are usually from exogenous sources such as viral-derived short-interfering RNAs, or synthetic siRNAs which are applied to cells or organisms to inhibit expression of specific genes. The p19 protein is a viral suppressor of RNA silencing (VSRS) endogenous to tombusviruses, which binds small RNA duplexes of any sequence with extremely high affinity. Because of its unique binding properties, recombinant p19 proteins are an excellent platform for tool development surrounding the RNA silencing pathway and are used extensively in novel applications for modulating the activity of small RNAs in living systems and for detecting small RNAs in biological samples. Herein we present work that has increased the breadth of p19’s utility as a biotechnology tool in three distinct realms. First, we present a chemical biology approach which combines p19 and small molecules for potent inhibition of the RNA silencing pathway in human cells. Secondly, we present the development of a novel fusion protein between p19 and a cell penetrating peptide (CPP), which functions as an siRNA delivery agent to allow gene knockdown in human cells. Thirdly, we have improved the utility of p19 for detecting and sequestering human miRNAs through rationally designing the binding surface; we describe mutations which dramatically enhance p19's affinity for human miRNA-122. The work presented here adds to the growing repertoire of engineered RNA binding proteins (RBPs) as tools for studying small RNA molecules and modulating their activity for applications in human therapeutics.

Le PTGS (post-transcriptional gene silencing) est un mécanisme de défense qui cible les acides nucléiques invasifs d’origines endogènes (transposons) ou exogènes (pathogènes, transgènes). Des mutations dans les gènes JMJ14 et NAC52 ont été isolées lors d’un crible génétique visant à identifier des mutants déficients en PTGS. JMJ14 code une histone déméthylase ciblant la lysine 4 bi- ou tri-méthylée de l’histone H3, tandis que NAC52 code un facteur de transcription. Ces deux protéines forment un complexe qui régule la transcription de centaines de gènes endogènes. Toutefois, le rôle de ce complexe chromatinien dans l’expression des transgènes et surtout dans le PTGS reste incompris. JMJ14 interagit avec NAC52 mais aussi avec une protéine de type guanine exchange factor de la famille RCC1. Des mutations dans l’un ou l’autre des membres du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 réduisent la transcription des transgènes. JMJ14 se fixe au promoteur de façon indépendante de NAC52, tandis que NAC52 a besoin de JMJ14 pour se fixer à la région transcrite. Toutefois, JMJ14 et NAC52 ne semblent pas requis pour la transcription proprement dite. En effet, un niveau normal de transcription est restauré chez le double mutant jmj14 drm2, indiquant que le rôle du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 semble être d’empêcher la méthylation de novo du promoteur par DRM2.L’effet des mutations jmj14 et nac52 sur la transcription des transgènes ne peut expliquer leur effet sur certaines formes de PTGS. En effet, les mutations jmj14 et nac52 n’affectent pas le PTGS induit constitutivement. Par contre, elles empêchent la systémie du PTGS induit localement. Des mutations dans le gène SPCL45 codant une Serine Carboxy Peptidase-Like qui interagit avec NAC52, mais pas JMJ14, ont le même effet. En revanche, la mutation rcc1 n’affecte pas la systémie du PTGS, suggérant que c’est au sein d’un complexe JMJ14-NAC2-SPCL45 que JMJ14 et NAC52 contrôlent le PTGS systémique. Ce complexe pourrait agir directement sur la chromatine du transgène pour permettre d’enclencher le PTGS en réponse à la perception du signal systémique, ou indirectement en contrôlant l’expression d’un gène endogène codant une protéine régulant la systémie du PTGS. Afin de mieux comprendre le rôle de JMJ14 dans la systémie du PTGS, un crible génétique visant à isoler des suppresseurs de la mutation jmj14 a été réalisé. Seize mutants correspondants à sept gènes codant des protéines ayant un rapport avec la chromatine et une action antagoniste à JMJ14 ont été caractérisés. Les mutations dans ces sept gènes pourraient supprimer l’effet de jmj14 en augmentant la transcription du transgène cible et donc la quantité du signal systémique de PTGS. Un 17ème mutant pourrait quant à lui affecter qualitativement le signal systémique de PTGS ou la perception du signal dans les cellules qui le reçoivent. Le gène correspondant reste à identifier. / Post-transcriptional gene silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids from endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. Mutations in JMJ14 and NAC52 have been retrieved from a genetic screen aiming to identify PTGS deficient mutants. JMJ14 encodes an histone demethylase targeting the bi- or tri-methylated lysine 4 of histone H3, while NAC52 encodes a transcription factor. Both act in a complex that regulates the transcription of hundreds endogenous genes. However, the function of this chromatin complex in transgene expression and in PTGS is not known. JMJ14 interacts with NAC52 but also with a guanine exchange factor of the RCC1 family. Mutations in any member of the RCC1-JMJ14-NAC52 complex reduce transgene transcription. JMJ14 binds to the transgene promoter independently of NAC52, whereas NAC52 requires JMJ14 to bind on the transcribed region. However, JMJ14 and NAC52 do not seem to be required for transcription itself. Indeed, a wild-type level of transcription is restored in the jmj14 drm2 double mutant, suggesting that the complex RCC1-JMJ14-NAC52 prevents de novo DNA methylation of the promoter by DRM2. The effects of jmj14 and nac52 mutations on transgene transcription cannot explain their specific effect on some forms of PTGS. Indeed, jmj14 and nac52 do not affect constitutively-induced PTGS, but prevent the systemic spreading of locally-induced PTGS. Mutations in SCPL45, encoding a Serine-Carboxy Peptidase-Like that interacts with NAC52, but not JMJ14, have the same effect. In contrast, rcc1 does not affect the systemic PTGS, suggesting that a JMJ14-NAC52-SCPL45 complex is involved in the control of systemic PTGS. This complex could act directly on transgene chromatin to trigger PTGS in response to the PTGS signal, or indirectly by controlling the expression of an endogenous gene encoding a protein regulating systemic PTGS. To better understand the function of JMJ14 in systemic PTGS, a genetic screen aiming to identify suppressors of jmj14 have been performed. Sixteen mutants corresponding to seven genes encoding proteins related to chromatin and having an antagonist function to JMJ14, have been characterized. Mutations in theses seven genes could suppress jmj14 by increasing transgene transcription and consequently the quantity of the PTGS systemic signal. A seventeenth mutant could have a qualitative effect on the PTGS systemic signal or could affect the perception of this signal in recipient cells. The corresponding gene remains to identify.

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La neurofibromatose type1 (maladie de Von-Rechlinghausen) est une affection autosomique dominante, causée par des mutations polymorphes du gène NF1, dont la protéine, la Neurofibromine, agit comme un suppresseur de tumeur en opérant une contrôle négatif des protéines de RAS. D’un point de vue embryologique, cette maladie affecte les dérivés de la crête neurale (CN), une structure embryonnaire pluripotente, capable de générer des dérivés variés tels que des neurones, des cellules gliales, périvascullaires, squelettiques et pigmentaires. Les cellules de la CN subsistent aussi chez l’adulte, à l’état de cellule souches, pouvant être impliqués dans des processus régénératifs. Toutefois, lorsque leur programme morphogénétique est altéré, elles peuvent générer des processus tumoraux, à l’origine de tumeurs multiples dans la peau, les nerfs (tumeurs bénignes et malignes des gaines nerveuses, neurofibromes,) et le cerveau (50% des cas de tumeurs cérébrales avec un tiers de gliomes des voies optique sont cancéreuses). La compréhension des mécanismes de cette maladie est limitée par la faible corrélation qui existe entre génotypes et phénotypes, à savoir l’adéquation entre la nature hautement polymorphe des anomalies génétiques et la diversité des manifestations cliniques. L’objectif de l’étude est d’analyser les conséquences de l’invalidation du gène NF1 sur le comportement des cellules de la CN (CCN), leur prolifération, leur capacité de migration et leur potentiel de différenciation, chez un modèle expérimental. De plus, nous tentons d’élucider l’impact des modulations épigénétiques de l‘activité du NF1.Nous avons développé un système qui permet l’inactivation totale du gène NF1 dans les cellules de la CN spécifiquement en utilisant des molécules d’ARN interférent (silencing) transfectées par éléctroporation bilatérale dans les CCN, au stade précoce de la neurulation, en utilisant l’embryon de poulet comme modèle expérimental. Suite à l’invalidation du gène NF1, nous avons obtenus des déficits multi-systémiques qui consistent principalement en des altérations de la gangliogénèse céphalique, avec des phénotypes gliomateux, mais aussi des défauts périvasculaires qui affectent tant les parois adventitielles des artères branchiales, que les péricytes des capillaire faciaux et cérébraux, associés des asymétries faciales et des formations néoplasiques intra-cérébrales. Précocement, nous montrons que ces déficits peuvent être corrélés aux altérations du comportement migratoire, prolifératif et apoptotiques des cellules de la CN.Parallèlement, nous avons cherché à déterminer l’implication des régulations épigénétiques sur l’activité de NF1. Nous nous sommes focalisé sur l’activité des Histones Désacétylases (HDAC), qui contrôlent la configuration chromatinienne. Il s’avère que les transcrits de la classe I de famille des HDACs, les HDAC1, 2 et 8, normalement accumulés dans les CCN au cours de leur migration et selon un patron d’expression spatial et temporal similaire à celui de NF1, présentent des variations significatives suite au silencing de NF1. Nous avons testé l’inactivation sélective de ces gènes; Ainsi, nous montrons que l’invalidation de HDAC8 seule, permet de reproduire les altérations des phénotypes vasculaires observés chez les embryons hypomorphes pour NF1. Qui suggère un rôle prépondérant de HDAC8 dans la régulation de la vasculogenèse et de la différentiation des CCN en péricytes. Qui pourrait être par l’activation ectopique des gènes Sox9 soutenant la transdifférenciaton pathologique des péricytes en processus gliomateux ou en calcifications intracérébrales. / The neurofibromatosis-type 1 (NF1) (Von Recklinghausen disease) is an autosomal disorder, which stems from misrgulation of Neurofibromin (NF1), a gene encoding a tumour-suppressor protein which acts as a negative regulator of RAS proteins. Mutations of NF1 are causally linked to many types of tumours located in skin, nerves, but also in the brain (intra- cerebral tumours and gliomas). NF1 patients have a high risk of developing both benign and malignant tumours. The diversity of deficits and the nature of cellular lineages attribute all these tumoral manifestations to deregulation of neural crest cell (NC) derivatives. The NC is a multipotent stem cell population that contributes to a variety of cell types in vertebrate embryo, which include skeletogenic, glial, pigment cells as well as pericytes. In order to understand the pathologic process of this disease, it is essential to analyze the molecular mechanisms involved in the survival, proliferation and differentiation of NC.Our objectives are therefore to gain insights into the molecular cascade responsible for the diversity of NC derivatives at cephalic level. We opt for a drastic approach consisting in eradicating NF1 activity from NC at the beginning of their migration. In our experimental model, we can analyze developmental interactions of NC and the epigenetic regulation of the NF1 gene, at their level. Espically class1 Histone deacetylases (HDAC) family of molecules. So we have developed a system which allows complete inactivation of the NF1 gene in NC specifically using interfering RNA molecules (silencing) transfected by electroporation in the bilateral NC, during the early stage of neurulation, using the chick embryo as an experimental model.We show that HDAC8 inactivation can reproduce the alterations of vascular phenotypes observed in NF1 hypomorphic embryos. Suggesting an important role of HDAC8 in regulating vasculogenesis and differentiation of pericytes NC. That could be by ectopic activation of Sox9 gene supporting the pathological transdifférenciaton pericytes in gliomateux process or intracerebral calcifications.

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Chez les plantes, le RNA silencing (RNAi) est le principal mécanisme de défense antivirale. Il est opéré par de petites molécules d’ARN (siRNA), de 21-22nt de long, générées à partir de l’ARN viral par DCL4 et DCL2, respectivement. Ces siRNA confèrent la séquence-spécificité des réactions de défense intracellulaire et peuvent se déplacer à longue distance pour immuniser les cellules saines. En conséquence, les virus ont développé des protéines (VSRs) capables de supprimer ces deux aspects du RNAi. Au cours de cette thèse, j’ai pu démontrer in vivo que la protéine P15 du Peanut clump virus (PCV) est capable de séquestrer les siRNA de 21 et 22nt et qu’elle bloque le mouvement de ces derniers plus efficacement que ceux de 21nt. Pour compenser cette faiblesse, au cours de l’infection par le PCV, P15 est transportée à l’intérieur des peroxisomes en association avec les siRNA qu’elle séquestre. Le confinement des siRNA mobiles de 21nt à l’intérieur de ces organelles conduit à une inhibition du RNAi systémique et stimule fortement la propagation du PCV à travers la plante. Ces travaux définissent une nouvelle stratégie de pathogénèse virale au cours de laquelle une organelle est utilisé pour neutraliser des molécules de défense produites par l’hôte. / In plants, RNA interference (RNAi) is the main antiviral defense mechanism. It is initiated through the processing of viral RNA into 21-22nt long siRNA by DCL4 and DCL2, respectively. These siRNA can mediate sequence-specific local defense reactions (cell-autonomous RNAi) or move to distant tissues to prime defenses in naive cells (systemic RNAi). Consequently, viruses have evolved proteins (VSRs) to suppress both aspects of RNAi. In this in vivo study, I show that P15, the VSR of Peanut clump virus (PCV), binds and sequesters both 21nt and 22nt siRNA. Importantly, it stops the movement of 22nt siRNA more efficiently than 21nt siRNA. During infection, P15 is shuttled into peroxisomes, and is able to « piggyback » siRNA into these organelles. By confining mobile DCL4-dependent antiviral 21nt siRNA within peroxisomes, P15 is able to shut down systemic RNAi and strongly promote PCV movement. This work describes a novel pathogenic strategy in which an organelle is used to neutralize host defensive molecules.

published_or_final_version / abstract / Biochemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / toc / Botany / Master / Master of Philosophy