A ausência de XPC, uma proteína canonicamente envolvida em reparo de DNA por excisão de nucleotídeos, está associada a vários fenótipos característicos de disfunção mitocondrial como o desequilíbrio entre os complexos da cadeia transportadora de elétrons (CTE), redução no consumo de oxigênio, maior produção de peróxido de hidrogênio, e maior sensibilidade a agentes que causam estresse mitocondrial. Contudo, uma descrição mecanística da relação entre deficiência de XPC e disfunção mitocondrial ainda não está bem estabelecida. Aqui mostramos que a deficiência de XPC está associada ao aumento na expressão do supressor de tumor p53. Essa alteração é acompanhada pelo aumento da expressão de diversas proteínas que participam em importantes funções mitocondriais. A inibição de p53 reverte a superexpressão de algumas dessas proteínas. O tratamento com o inibidor do Complexo III da CTE antimicina A induz aumento da expressão de p53 de forma mais acentuada na linhagem Xpc-/-, enquanto o tratamento com o antioxidante N-acetilcisteína diminue a produção basal de H2O2, expressão de p53 e sensibilidade aumentada ao tratamento com antimicina A. Em conjunto, nossos resultados suportam a hipótese de que o aumento da produção de H2O2 em células Xpc-/- tem um papel causal na regulação da expressão de p53 e na disfunção mitocondrial / Although XPC has been initially implicated in the nucleotide excision DNA repair pathway, its deficiency is associated with mitochondrial dysfunction, including unbalanced electron transport chain (ETC) activity, lower oxygen consumption, increased hydrogen peroxide production, and greater sensitivity to mitochondrial stress. However, a mechanistic understanding of the role of XPC in regulating mitochondrial function is still not well established. Here we show that XPC deficiency is associated with increased expression of the tumor suppressor p53, which is accompanied by increased expression of several proteins that participate in important mitochondrial functions. Inhibition of p53 reverses the overexpression of some of these proteins. In addition, treatment with the ETC inhibitor antimycin A induces p53 expression more robustly in the Xpc-/- cells, while treatment with the antioxidant N-acetylcysteine decreases basal H2O2 production, p53 expression and sensitivity to antimycin A treatment. Together, our results support a model in which increased H2O2 production in Xpc-/- causes upregulation of p53 expression and mitochondrial dysfunction

Proteínas sinalizadoras membranares são amplamente usadas por bactérias para adequar seu metabolismo a estímulos ambientais. Elas possuem ainda um grande potencial de aplicação, como em técnicas para controle de infecções e o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, como biossensores. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos estruturais de transdução bacterianos. Em particular, pouco é descrito sobre proteínas sinalizadoras que possuem os domínios GGDEF e/ou EAL, responsáveis por desencadear a síntese, degradação ou captação da molécula c-di-GMP, um dos principais reguladores do metabolismo bacteriano. Por isso, esse estudo objetivou a caracterização de duas proteínas sinalizadoras transmembrana de Pseudomonas aeruginosa, codificadas nos genes PA0847 e PA3343 (HsbD), além de trazer análises por bioinformática de proteínas com domínios GGDEF e EAL consecutivos, comumente associados a membrana celular. É relatado que PA0847 e HsbD são ambas diguanilato ciclases (DGC), que impactam consideravelmente em fenótipos de P. aeruginosa, patógeno modelo de estudo e que infecta pacientes imunocomprometidos. Além disso, um estudo anterior mostrou a interação entre a porção citoplasmática de PA0847 e a região N-terminal de HsbD (HsbD-Nt), pela técnica de duplo híbrido. Nesse estudo, é mostrado que essa interação, associada à presença de um padrão conservado em HsbD-Nt, sugere a presença um sistema de controle específico de c-di-GMP. Ensaios in vitro de pulldown, termoforese e duplo híbrido, utilizando domínios isolados de PA0847, confirmaram a interação com HsbD-Nt e mostraram que a interação é dependente de todos os domínios de PA0847. Análises de massa molecular e de cinética enzimática mostraram que o HAMP eleva a atividade DGC e promove a formação de tetrâmeros. A presença de um transportador de sulfato compartilhando um operon com PA0847, associado a modelos computacionais da região periplasmática de PA0847, suportam o envolvimento de PA0847 na homeostase desse íon. Nesse estudo foram ainda identificados, por meio de análises de sequências, novos potenciais grupos de resíduos que estariam envolvidos na regulação de proteínas GGDEF-EAL. Análises adicionais de sequências e de estruturas indicaram também um mecanismo de dimerização alternativo para EALs, quando a região de dimerização está ausente. Estes resultados são inéditos e fornecem passos para uma melhor compreensão da sinalização bacteriana intermediada pelo c-di-GMP. / Membrane signaling protein are widely used by bacteria to adequate their metabolism of environmental cues. They present a great potential of applicability, such as techniques to control bacterial infections and development of biotecnological devices, for example in biosensors. However, little is known regarding the mechanisms of signal transduction in bacteria. In particular, about receptors that posses GGDEF and/or EAL domains, performing synthesis, degradation or recognition of c-di-GMP, which is one of the major bacteria metabolism regulators. For this reason, the present study aimed characterize two important transmembrane signaling proteins from Pseudomonas aeruginosa, coded in genes PA0847 and PA3343 (HsbD) and performed bioinformatic analysis of proteins with GGDEF and EAL in tandem, usually associated with membrane. Previous studies indicated that PA0847 and HsbD are both diguanylate cyclases (DGCs) that significantly impair phenotypes of P. aeruginosa, which is a model organism and common cause of infection in immunocompromised patients. In the present study we have shown that this interaction associated with the presence of a wellconserved pattern from HsbD-Nt, suggests the presence a system used for specific downregulation of c-di-GMP. Furthermore, using isolated domains of PA0847 in thermophoresis, pull down and two-hybrid confirmed the interaction and showed that the full PA0847 cytoplasmic is necessary to interaction with HsbD. Additional amalysis of molecular mass and enzyme kinetic showed that HAMP increases DGC activity, alters the co-purification patern of c-di-GMP and promotes tetramers formation in PA0847 soluble constructs. The presence of sulfate transporter in a common operon with PA0847, associated with computation model of periplasmatic region of PA0847 supports the relation of this protein in sulfate homeostasis. We also identified using new residues groups copled that are potential play roles in GGDEF-EAL proteins. We found by stuctural analisys alternative mechanisms of dimerization in EAL domais that do not posses dimerization site conserved. These results have not been presented elsewhere and provide insights into the bacterial signaling of c-di-GMP pathways.

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) são proteínas integrais de membrana caracterizados por possuírem sete ?-helices transmembranares e por isso também são chamados de receptores 7TM. Esta superfamília de receptores medeia um grande numero de processos fisiológicos e é alvo para aproximadamente 40% de todas as drogas no mercado. O receptor de Bradicinina de tipo 2 (B2) é o principal mediador do sistema Calicreina-Cinina e é classicamente ativado pelo nonapeptídeo Bradicinina (BK). Trabalhos recentes descreveram agonistas para diferentes GPCRs, que podem ativar seletivamente (ou pelo menos preferencialmente) vias de sinalização dependentes de proteína G ou do acoplamento de ?-arrestina, sendo este fenômeno denominado agonismo tendencioso (do inglês \"biased agonism\"). Neste trabalho estão sendo desenhados e sintetizados uma serie de análogos com o objetivo de produzir novos ligantes com distintas propriedades bioquímicas e farmacológicas. Alguns destes análogos já sintetizados apresentaram características interessantes nos perfis de ativação. Estes análogos devem ser utilizados como modelos para a síntese e caracterização de novas gerações de análogos com potenciais propriedades de agonismo tendencioso. Nos acreditamos que o desenho de novos agonistas tendenciosos pode levar ao desenvolvimentos de uma nova geração de drogas, seletivas para ativação não somente de um subtipo de receptor, mas também de uma via de sinalização especifica / G-protein coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins characterized by bearing seven transmembrane ?-helices, and are therefore also known as 7TM receptors. This receptor superfamily mediates a large number of physiological processes and is subject to approximately 40% of all drugs on the market. The type 2 Bradykinin receptor (B2) is the primary mediator of the Kallikrein-Kinin System and is classically activated by the nonapeptide Bradykinin (BK). Recent studies have described different GPCRs agonists which can selectively activate (or at least preferably) dependent signaling pathways of G protein or ?-arrestin coupling, this phenomenon is called biased agonism. This work are based in design and synthesize a series of analogs with the goal of producing new ligands with different biochemical and pharmacological properties. Some of these synthesized analogs have presented interesting characteristics in activation profiles. These analogs should be used as templates for the synthesis and characterization of novel analogs with properties of biased agonism. We believe that the design of novel agonists can lead to development of a new generation of drugs, not only selective for activation of a receptor subtype but also a specific signaling pathway

A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu \"shifting\" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas. / Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.

Esta dissertação de mestrado analisa a seta como símbolo gráfico universal da comunicação visual, reconhecido por diferentes povos em diversas épocas e culturas. A pesquisa apresenta a seta como transmissora de informações essenciais por meio de seus vários significados e funções facilitando as interações sociais no mundo contemporâneo, diminuindo as dificuldades geradas por especificidades linguísticas e auxiliando na possibilidade de uma rápida interpretação das mensagens comunicadas, ainda que dentro de limites culturais. O estudo mostra que este símbolo gráfico é utilizado desde os tempos mais remotos, nas pinturas rupestres, até os dias atuais, com usos distintos em vários campos do conhecimento. O objetivo da análise é identificar os significados mais notáveis do símbolo gráfico seta, além de sua função direcional básica e como eles se desenvolveram em três modalidades de aplicação: (1) a seta nos sistemas de sinalização, orientando e dirigindo o fluxo do tráfego humano e suas variantes nos pictogramas e na sinalização viária, algumas vezes com significados distintos como o de \"encontro\", \"indicação\" ou \"localização\"; (2) a seta nos sistemas de esquematização em várias áreas do conhecimento, da vida cotidiana às representações científicas, empregada com diferentes funções, dependendo da intenção da mensagem a ser transmitida, entre elas: \"ação\", \"causa-efeito\", \"foco\", \"geração\", \"identificação\", \"intensidade\", \"limite\", \"relação\", \"sequência\", \"tempo\", \"transferência\" e \"transformação\"; (3) a seta nos sistemas de identidades visuais, representando empresas ou produtos visualmente e de forma ordenada, com novos significados vindos de associações semânticas relacionadas às situações específicas de cada marca e aos setores de mercado aos quais elas pertencem, como por exemplo: \"cobertura\", \"satisfação\", \"simpatia\", \"saúde\", \"crescimento\", \"desenvolvimento\", \"rapidez\", \"centralização\", \"prazer\" e \"suavidade\". É uma pesquisa qualitativa que pretende, com a análise e a interpretação das variáveis dos fenômenos particulares a cada campo de estudo, entender de forma ampla, partes das dimensões semântica e pragmática do símbolo gráfico em questão. Este estudo aprofundado pretende contribuir para o melhor entendimento e utilização da seta por comunicadores e designers, com maior conhecimento e propriedade, permitindo sua aplicação mais clara e efetiva nos sistemas de sinalização de grandes espaços, de esquematização da informação visual e de identidades visuais. / This thesis analyzes the arrow as a universal graphic symbol in visual communication, one recognized by different people in different times and cultures. The research presents the arrow as a transmitter of critical information through its various meanings and functions, facilitating social interactions in the contemporary world, lessening the difficulties caused by linguistic specificities and assisting in the possibility of a rapid interpretation, though still within cultural limits, of the messages communicated. The study shows that this graphic symbol has been used since ancient times, from cave paintings to the present day, with different uses in various fields of knowledge. The goal of the analysis is to identify the most notable meanings of the arrow graphic symbol, besides its basic directional function, and how these meanings developed into three types of applications: (1) the arrow in signage systems, guiding and directing the flow of human traffic and its variants in pictograms and road signs, sometimes with different meanings like \"meeting\", \"indication\" or \"location\"; (2) the arrow in diagrams in various areas of knowledge, from everyday life to scientific representations, used with different functions, depending on the intent of the message to be transmitted, including: \"action\", \"cause and effect\", \"focus\", \"generation\", \"identification\", \"intensity\", \"boundary\", \"relationship\", \"sequence\", \"time\", \"transfer\" and \"transformation\"; (3) the arrow in corporate identity systems, representing companies or products visually and in an orderly fashion, with new meanings coming from semantic associations related to the specific circumstances of each brand and market sectors to which they belong, such as: \"covering\", \"satisfaction\", \"sympathy\", \"health\", \"growth\", \"development\", \"speed\", \"centralization\", \"pleasure\", and \"softness\". This qualitative research seeks, with analysis and interpretation of the variables of phenomena specific to each field of study, to broadly understand parts of the semantic and pragmatic dimensions of the graphic symbol in question. This is in-depth study which aims to contribute to a better understanding and use of the arrow by communicators and designers, with greater knowledge and propriety, allowing for its clearer and more effective application in signage systems in large spaces, diagrams of visual information, and corporate identities.

Doenças da córnea estão entre as principais causas de cegueira e os mecanismos de lesão e reparação estão em grande parte concentradas no epitélio, porém os mediadores e alvos para possíveis intervenções terapêuticas são pouco conhecidos.Nas agressões ao epitélio da córnea, a ativação dos receptores vanilóides de potencial transitório 1 (TRPV1) leva a resposta inflamatória e cicatricial. O objetivo desse trabalho é identificar os mecanismos de sinalização e resposta do TRPV1 na córnea de animais experimentais. O cultivo de células epiteliais de córnea de ratos, a identificação de mediadores por western blot, medida do influxo de cálcio, resposta de citocinas medidas por ensaio quantitativo de PCR em tempo real (RNAm) e ELISA (proteína) após estímulos nocioceptivos ou inflamatórios; e a investigação histológica e imunohistoquimica em modelos animais, sejam ratos com diabetes mellitus (DM) por 8 semanas ou expostos a cloreto de benzalcônio a 0,2% (BAC) por 7 dias. Camundongos TRPV1-/- comparados aos controles C57 foram comparados sem estimulo, ou sob estimulo único com CAP a 1µM, BAC 0,2 % por 7 dias ou após queimadura alcalina com NaOH a 1M. Os resultados mostraram a presença de TRPV1 em epitélio de córnea em cultura primária, mostraram que essas células respondem com influxo de cálcio ao estímulo com o agonista Capsaicina a 1µM e aumento de TNF? e IL-1? (sendo máximo nas combinações CAP+CPZ e Win+CAP, respectivamente). Em ratos com DM e BAC ocorre a redução da expressão do RNAm de IL-1? (p=0,0269) na córnea, entre outras alterações. Os camundongos TRPV1-/- tem fenótipo físico e ocular normal, porém reduzida sensibilidade a CAP 1µM. O tratamento com BAC leva a diminuição da secreção lacrimal (p=0,0011) e de IL-1? e TNF? na glândula lacrimal (GL) de TRPV1-/- machos (p=0,0177, p=0,0245, respectivamente). A queimadura alcalina com NaOH 1M resultou em melhor cicatrização e maior espessura epitelial no grupo TRPV1-/-. Em ix conclusão, o TRPV1 está presente na córnea e atua em resposta a agressões externas. Situações adquiridas como DM e toxicidade por BAC, reconhecidas como neuropáticas diminuem a expressão de mediadores inflamatórios. A ausência genética e TRPV1 não altera o fenótipo, mas apresenta menor sensibilidade e melhor restauração da superfície ocular após queimadura alcalina / Corneal diseases are among the leading causes of blindness.Damage and repair mechanisms are largely concentrated in the epithelium, but the mediators and targets for possible therapeutic interventions are poorly understood. The aggressions to the corneal epithelium, the activation of vanilloid receptors transient potential 1 (TRPV1) leads to inflammatory and wound healing. The aim of this study is to identify the signaling mechanisms and TRPV1 response in the cornea of experimental animals.The culture of epithelial cells from rat cornea, to identify mediators by western blot analysis, measurement of calcium influx, cytokine response measured by PCR real time (mRNA) and ELISA (protein) nocioceptivos or after inflammatory stimuli; and the histological and immunohistochemical investigation in animal models are mice with diabetes mellitus (DM) for 8 weeks, and exposed to benzalkonium chloride at 0.2% (BAC) for 7 days. Mice TRPV1-/- compared to control C57 were compared with no stimulus, or under single stimulation with 1 µM Capsaicine (CAP), BAC 0.2% for 7 days or after the alkali burn with NaOH 1 M.The results showed the presence of TRPV1 in corneal epithelium in primary culture, showed that these cells respond to calcium influx the stimulus with capsaicin agonist 1?M and increase of TNF? and IL-1? (being maximum at the CAP + CPZ combinations and Win + CAP, respectively). In rats with DM and BAC occurs reducing the expression of IL-1? mRNA (p = 0.0269) in the cornea, among other changes. The TRPV1-/- mice have physical phenotype and normal ocular but low sensitivity to CAP 1?M. Treatment with BAC leads to decreased tear secretion (p = 0.0011) and IL-1? and TNF? in the lacrimal gland (GL) of TRPV1-/- mice (p = 0.0177, p = 0.0245, respectively) . The alkaline burn with NaOH 1M resulted in better healing and greater epithelial thickness in TRPV1-/- group .In conclusion, TRPV1 is present in the cornea and operates in response to external aggressions. Situations existing as DM and xi toxicity BAC recognized as neuropathic decrease the expression of inflammatory mediators. Genetic absence and TRPV1 does not alter the phenotype, but has lower sensitivity and better restoration of the ocular surface after alkaline burn

A leucemia linfoide aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica agressiva, caracterizada pela expansão clonal de progenitores linfoides e ativação exacerbada de vias de sinalização. A via de sinalização de IGF1R/IRS1 inicia-se pela ligação do ligante IGF1 ao seu receptor transmembrana IGF1R, e subsequente ativação de seu substrato IRS1, que transmite sinais mitogênicos e antiapoptóticos, principalmente através da modulação das vias de sinalização PI3K/AKT/mTOR e MAPK . Estas vias de sinalização desempenham uma importante função na proliferação, sobrevivência e migração de células de leucêmicas. Dessa forma, o objetivo do nosso trabalho foi investigar a participação da via de sinalização IGF1R/IRS1 na LLA. Linhagens celulares Jurkat, MOLT-4, Namalwa e Raji foram tratadas ou não com inibidor de IGF1R/IRS1-2, NT157, ou com inibidor de IGF1R/IR, OSI-906, e submetidas à avaliação da viabilidade celular, apoptose, proliferação, ciclo celular, migração e expressão/ativação gênica e proteica. Células mononucleares de pacientes com LLA e de doadores saudáveis foram submetidas aos ensaios de viabilidade e apoptose, após tratamento com NT157 e OSI-906. O efeito do NT157 in vivo foi avaliado utilizando modelo de xenotransplante de células CEM em camundongos NSG. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa e Comitê de Ética no Uso dos Animais da Instituição. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA e teste t de Student. O tratamento com NT157 reduziu a viabilidade e a proliferação, induziu apoptose e modulou o ciclo celular em todas as linhagens testadas (p<0,05). Similarmente, OSI- 906 reduziu a viabilidade e a proliferação, modulou o ciclo celular, porém não foi capaz de induzir apoptose nas linhagens de LLA (p<0,05). Os tratamentos com NT157 e com OSI-906 diminuíram significativamente a migração de Jurkat em fibronectina, porém não modularam a migração de Namalwa. Em um contexto molecular, a exposição ao NT157 resultou em inibição da fosforilação de proteínas da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR e modulou a expressão de 25 genes relacionados com a via de sinalização MAPK, dentre eles CDKN1A (p21), FOS e JUN (p<0,05). OSI-906modulou a ativação das proteínas da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR e a expressão gênica de p21, FOS e JUN, porém de uma forma diferente da modulação encontrada pelo tratamento com NT157 (p<0,05). Em células mononucleares de pacientes com LLA, NT157 induziu uma resposta heterogênea na viabilidade e induziu apoptose, e OSI-906 reduziu a viabilidade, porém não foi capaz de induzir apoptose nestes pacientes (p<0,05). Os tratamentos com NT157 e OSI-906 não apresentaram citotoxicidade em células de doadores saudáveis. Adicionalmente, o tratamento in vivo com veículo ou NT157 na dose de 50mg/kg/dia, via intraperitoneal, em modelos de xenotransplante com células CEM em camundongos NSG (n=5 para cada grupo) não apresentou efeitos antineoplásicos. Em conclusão, a inibição farmacológica de IGF1R/IRS1-2, por NT157, e de IGF1R/IR, por OSI-906, apresentaram efeitos antineoplásicos significativos em modelos de linhagens celulares e amostras primárias de pacientes com LLA. Os resultados dos estudos in vivo em modelos de xenotransplante indicam a necessidade de estudos de farmacocinética e farmacodinâmica para o NT157. Nossos resultados revelaram que NT157 exerce um efeito citotóxico nas células de LLA, enquanto que OSI-906 tem um efeito predominantemente citostático. Estes dados indicam que o inibidor de IGF1R/IRS1-2, NT157, obteve resultados antineoplásicos mais atrativos e a inibição direta de IRS1 pode ser um potencial alvo terapêutico em LLA. / Acute lymphoid leukemia (ALL) is an aggressive hematological neoplasm, characterized by clonal expansion of lymphoid progenitors and exacerbated activation of signaling pathways. The IGF1R/IRS1 signaling pathway initiated through binding of the ligand IGF1 to its transmembrane receptor IGF1R, and the subsequent activation of its substrate IRS1, which transmit mitogenic and antiapoptotic signals, mainly through the modulation of the PI3K/AKT/mTOR and MAPK signaling pathways. These signaling pathways play an important function in cell proliferation, survival and migration of leukemia cells. Therefore, the objective of our study was to investigate the participation of the IGF1R/IRS1 signaling pathway in ALL. Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji cell lines were treated or not with IGF1R/IRS1-2 inhibitor, NT157, or with IGF1R/IR inhibitor, OSI-906, and evaluated for cell viability, apoptosis, proliferation, cell cycle, migration, gene and protein expression/activation. Mononuclear cells from patients with ALL and from healthy donors were submitted to the viability and apoptosis assays, after treatment with NT157 and OSI-906. The NT157 effect in vivo was evaluated using CEM cell line xenograft model in NSG mice. The study was approved by the Research Ethics Committee and the Ethics Committee on the Use of Animals of the Institution. Statistical analysis was performed by ANOVA and Student t test. Treatment with NT157 reduced viability and proliferation, induced apoptosis, and modulated the cell cycle in all cell lines tested (p<0.05). Similarly, OSI-906 reduced viability and proliferation, modulated the cell cycle, but was not able to induce apoptosis in ALL cell lines (p<0.05). Treatments with NT157 and OSI-906 significantly decreased the migration of Jurkat in fibronectin, but did not modulate the Namalwa migration. In a molecular context, the NT157 exposure resulted in inhibition of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway protein phosphorylation and modulated the expression of 25 genes related to the MAPK signaling pathway, including CDKN1A (p21), FOS and JUN (p<0,05). OSI-906 modulated the activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway proteins and the p21, FOS and JUN geneexpression, but in a different way from the modulation found by treatment with NT157 (p<0.05). In mononuclear cells of patients with ALL, NT157 induced a heterogeneous response in viability and induced apoptosis, and OSI-906 reduced viability, but was not able to induce apoptosis in these patients (p<0.05). Treatments with NT157 and OSI- 906 did not show cytotoxicity in healthy donor cells. Additionally, in vivo treatment with vehicle or NT157 at the dose of 50 mg/kg/day, intraperitoneally, in xenotransplantation models with CEM cells in NSG mice (n=5 for each group) showed no antineoplastic effects. In conclusion, the pharmacological inhibition of IGF1R/IRS1- 2, by NT157, and IGF1R/IR, by OSI-906, showed significant antineoplastic effects in cell line models and in primary samples of patients with ALL. The results of in vivo studies in xenotransplantation models indicate the need for pharmacokinetic and pharmacodynamic studies for NT157. In conclusions, our results revealed that NT157 exerts a cytotoxic effect on ALL cell lines and primary ALL cells, whereas OSI-906 has a predominantly cytostatic effect. These data indicate that the IGF1R/IRS1-2 inhibitor, NT157, obtained more attractive antineoplastic results and the direct inhibition of IRS1 may be a potential therapeutic to target in ALL.

Phytochromes (PHYs) and plant hormones have been emerging as important regulators of fleshy fruit physiology and quality traits; however, the relevance of PHY-hormonal signaling crosstalk in controlling fruit development and metabolism remains elusive. This Thesis assesses the role of PHYs and their interplay with auxins, cytokinins and ethylene during the regulation of tomato (Solanum lycopersicum) fruit development and ripening, with a focus on the control of the plastid biogenesis, sugar metabolism and carotenoid accumulation. In Chapter I, we present evidence that the deficiency in PHY chromophore phytochromobilin (P&Phi;B) biosynthesis, which leads to a global deficiency in functional PHYs, represses fruit chloroplast biogenesis in immature fruits and inhibits fruit sugar accumulation by transcriptionally downregulating sink- and starch biosynthesis-related enzymes. Genetic and physiological evidence suggested the involvement of both auxins and cytokinins as mediators of the negative impact of P&Phi;B deficiency on fruit sink strength and chloroplast formation. During the ripening phase, P&Phi;B deficiency was shown to delay the rise in climacteric ethylene production, affecting the ripening initiation rather than its progression. PHY-hormonal signaling crosstalk was shown to be active not only in the more externally positioned fruit tissues (i.e., pericarp) but also in the most inner fruit regions (i.e., columella). We, therefore, concluded that the global deficiency in functional PHY drastically affects fruit sugar metabolism, chloroplast formation as well as the timing of ripening via an intricate interplay involving phytochromes, auxins, cytokinins and ethylene. In Chapter II, we employed fruit-specific RNAi-mediated silencing of PHY genes to shed light on the specific role played by fruit-localized PHYs and their downstream signaling cascades on tomato fruit physiology and quality traits. Data revealed that fruit-localized SlPHYB2 negatively regulates chlorophyll accumulation in immature fruits whereas SlPHYA positively influences the plastid division machinery. Both SlPHYA and SlPHYB2 were shown to play overlapping, yet distinct, roles in controlling fruit starch metabolism and carotenoid biosynthesis. Our data implicated cytokinin signaling-related proteins as mediators of the SlPHYA-dependent regulation of plastid division machinery, and specific AUXIN RESPONSE FACTORs as intermediates in the PHY-mediated regulation of fruit sugar and carotenoid metabolisms. We concluded that fruit-localized SlPHYA- and SlPHYB2-mediated light perception regulate fruit plastid biogenesis as well as sugar and carotenoid metabolisms via coordinated changes in key components of both auxin and cytokinin signaling cascades. Altogether, this study brings important insights into the combined action of PHYs and hormones in the control of fruit plastid biogenesis and highlights that the interplay between PHY-hormonal signaling cascades influences essential features of tomato fruit quality, such as the sugar and carotenoid accumulation / Fitocromos (PHYs) e fitormônios têm sido caracterizados como importantes reguladores da fisiologia e qualidade de frutos carnosos; todavia, a importância de interações entre a sinalização hormonal e dos PHYs no controle do desenvolvimento e metabolismo de frutos ainda permanece pouco elucidada. Este trabalho de Tese avaliou o papel dos PHYs e das suas interações com as auxinas, as citocininas e o etileno sobre a regulação do desenvolvimento e amadurecimento de frutos de tomateiro (Solanum lycopersicum), particularmente no que tange ao controle da biogênese plastidial e metabolismos de açúcares e de carotenoides. No Capítulo I são apresentadas evidências de que a deficiência na produção de fitocromobilina (P&Phi;B), a qual resulta numa deficiência global in PHYs funcionais, impacta negativamente a biogênese de cloroplastos em frutos imaturos e inibe o acúmulo de açúcares por meio da repressão transcricional de enzimas relacionadas a biossíntese de amido e força de dreno nos frutos. Evidências genéticas e fisiológicas indicaram o envolvimento tanto das auxinas quanto das citocininas como mediadoras do impacto negativo da deficiência de P&Phi;B sobre a força de dreno dos frutos bem como na formação de cloroplastos. Durante a fase de amadurecimento, a deficiência em P&Phi;B atrasou a produção climatérica de etileno, afetando o início do amadurecimento mas não a sua progressão. As interações entre PHYs e hormônios mostraram-se ativas não apenas nos tecidos posicionados mais externamente (i.e., pericarpo) mas também nas regiões mais internas do fruto (i.e., columela). Conclui-se, portanto, que a deficiência global em PHYs funcionais afeta drasticamente o metabolismo de açucares, formação de cloroplastos, bem como o tempo de amadurecimento através de uma interação complexa envolvendo fitocromos, auxinas, citocininas e etileno. No Capítulo II utilizamos o silenciamento fruto-específico de PHYs a fim de desvendar de que forma a fisiologia e parâmetros de qualidade do tomate seriam regulados por PHYs presentes no próprio fruto. Os dados obtidos revelaram que moléculas de SlPHYB2 presentes no próprio fruto regulam negativamente o acúmulo de clorofilas nos frutos imaturos, já as de SlPHYA influenciam positivamente a maquinaria de divisão plastidial, e tanto SlPHYA quanto SlPHYB2 desempenham papel sobrepostos, porém distintos, no controle do metabolismo de amido e acúmulo de carotenoides em frutos de tomateiro. Evidências sugerem que proteínas relacionadas à sinalização de citocininas atuariam como mediadoras do impacto de SlPHYA sobre a maquinaria de divisão plastidial, e que AUXIN RESPONSE FACTORs específicos seriam intermediários no controle dos PHYs sobre os metabolismos de açúcares e carotenoides. Conclui-se, dessa forma, que a percepção de luz mediada por moléculas de SlPHYA e SlPHYB2 presentes no próprio fruto regulam a biogênese plastidial e os metabolismos de açúcares e carotenoides por meio de alterações coordenadas em componentes chaves das cascatas de sinalização de auxinas e citocininas. Quando combinados, os dados obtidos neste estudo apresentam novidades importantes sobre a ação conjunta de PHYs e fitormônios no controle da biogênese plastidial e demonstram que a interação entre esses sinalizadores influencia características essenciais da qualidade de frutos de tomateiro, tais como o acúmulo de açúcares e de carotenoides

O câncer é a segunda doença com maior índice de mortalidade no Brasil e ainda é responsável por um elevado número de óbitos em todo o mundo. Durante a tumorigênese ocorrem diversas alterações no genoma, transcriptoma, proteoma, e interatoma que permitem o desenvolvimento da célula maligna. Alterações descritas na via de sinalização PI3K-Akt, tais como ganho de função da quinase PI3K ou perda de função da fosfatase PTEN, levam ao aumento de PIP3 com ativação constitutiva dos alvos downstream, como da quinase Akt. A regulação negativa da Akt pode ser realizada pela fosfatase PP2A, que é inibida pela proteína SET (ou inibidor 2 da PP2A). Existem diversos mecanismos que podem contribuir para a desregulação da sinalização celular e o aumento na quantidade de uma única proteína pode levar ao desequilíbrio no processo. Recentemente, nosso grupo identificou o aumento da proteína SET em diversas amostras de pacientes com carcinoma bucal, que foi associado à ativação da Akt. Sendo assim, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar os potenciais mecanismos de regulação da fosfatase PTEN pelas proteínas SET e PP2A e o papel de PTEN na predisposição ao carcinoma bucal. Para isso, através de vetores de expressão foi identificada dentre outras, a subunidade B56? da PP2A capaz de reduzir os níveis de PTEN fosforilado no resíduo de S380; a interação das proteínas PTEN e PP2A foi confirmada por co-imunoprecipitação (co-IP) e imunofluorescência; a atividade de PP2A e PTEN foram avaliadas frente a expressão de SET e regiões da SET na presença ou não de mutações sítio-específicas; e os níveis de expressão de PTEN foram relacionados ao acúmulo ou silenciamento (siRNA e shRNA) de SET em CECPs e no tratamento com agente hiperacetilante (TSA) e desmetilante (5aza-deoxicitidina). Também foi avaliado o papel de PTEN na expressão de BMAL1 in vitro e in vivo, utilizando animais geneticamente modificados com deleção de PTEN tecido-condicional ao epitélio. Os resultados obtidos sugerem a participação da SET em mecanismos de controle da expressão gênica de PTEN e a participação de PTEN no controle da expressão de BMAL. / Cancer is the second cause of death in Brazil and the oral cancer is among the most predominant cancers worldwide. During tumorigenesis several changes occur in the genome, transcriptome, proteome and interatoma leading to malignant cells development. Some of the more important modifications occur in the PI3K-Akt pathway, such as the loss of PTEN phosphatase function, which increase PIP3 and results in the constitutive activation of downstream targets, including the kinase Akt. PP2A is responsible for the negative regulation of Akt and is inhibited by SET (or Inhibitor 2 of PP2A). Many mechanisms can lead to deregulation of these signaling pathways and the increase in one protein can result in pathway loss of balance. Recently Leopoldino et.al. (2009) identified SET levels increased in oral cancer tissue samples, associate to Akt activation. The main objective of this project is evaluating how PP2A and SET regulate PTEN and its relation to cancer predisposition. For this, expression vectors were used to identify, among others, B56? subunit of PP2A reducing levels of p-PTEN S380; the interaction between PP2A and PTEN was confirmed by co-immunoprecipitation (co-IP) and immunofluorescence; PP2A and PTEN activity were evaluated against expression of SET and SET regions in the presence or not of site-specific mutations; and PTEN expression levels were related to the accumulation or silencing (siRNA and shRNA) of SET in CECPs and the treatment with agents for hyperacetylation (TSA) and demethylation (5-aza-deoxycytidine). The role of PTEN on BMAL1 expression was evaluated in vitro and in vivo, using transgenic animals with tissue-specific deletion of PTEN for epithelium. The results suggest the involvement of SET in control of PTEN gene expression and participation of PTEN in the control of BMAL expression.

Na primeira parte desta tese, estudamos os princípios operacionais das decisões celulares mediadas pelo sistema de sinalização Notch. Este sistema tem papel importante nas decisões celulares que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e na formação de tumores. O circuito de sinalização é ativado quando o receptor Notch de uma célula interage com um dos ligantes - Delta ou Jagged - de uma célula vizinha. O circuito Notch-Delta forma um comutador intercelular, e duas células vizinhas tendem a adotar estados diferentes - Emissor (muito ligante e pouco receptor) e Recebedor (pouco ligante e muito receptor). Neste manuscrito, apresentamos uma nova abordagem teórica que integra ambos Delta e Jagged no circuito Notch. Mostramos que o circuito Notch-Delta-Jagged permite um novo estado - um híbrido Emissor/Recebedor (E/R) com concentrações intermediárias de receptores e ligantes, e portanto o circuito é age como uma chave de três vias. Em seguida, observamos que a taxa de produção de ambos os ligantes, assim como a modulação assimétrica da afinidade de ligação do Notch com seus ligantes mediada pela glicosiltransferase Fringe, afeta severamente o intervalo de existência dos estados e sua relativa estabilidade - altos níveis de Jagged, mas não de Fringe ou Delta, promovem o estado híbrido E/R e o processo de indução lateral. Nós elucidamos o papel de Jagged na determinação dos estados celulares e discutimos sua possível implicação no entendimento da comunicação entre tumor e estroma, que frequentemente envolve comunicação via interações Notch-Jagged. Posteriormente, avaliamos a interação entre Notch, inflamação e a população de Células Cancerígenas Estaminais (CCE). Mostramos que inflamação pode expandir a população de CCE por meio do aumento dos níveis de produção de Jagged que posteriormente ativa o sistema de sinalização Notch em células vizinhas não-CCE. Nossos resultados sugerem que a inibição da produção de Jagged atenua o efeito da expansão de CCE devido a inflamação, indicando que inflamação cresce a população de CCE via interações Notch-Jagged. Nossos resultados são consistentes com observações em câncer de mama do subtipo basal (triplo negativo), onde a perda de Fringe e a ativação constitutiva do eixo NF-kB - Jag1 promove a expansão da população de CCE. Nossa abordagem computacional pode ser adaptada para incluir circuitos adicionais tais como p53 e hipóxia, que afetam a plasticidade celular, proporcionando assim uma plataforma útil para a projeção de novas terapias. Na segunda parte desta tese, introduzimos um novo método para seleção de características: Suvrel. Este é um método variacional, inspirado em aprendizado de relevância, para determinar tensores métricos para definição de distâncias baseadas em similaridades, para utilização em métodos de classificação. Nós introduzimos uma nova metodologia na qual o tensor métrico pode ser calculado analiticamente. O preprocessamento das características por uma transformação linear utilizando o tensor métrico calculado via Suvrel melhora a eficiência dos classificadores. Testamos nosso método para conjuntos de dados públicos, utilizando os classificadores mais comumente utilizados. Nós também aplicamos esta metodologia no estudo da relação entre parâmetros estruturais globais e o sistema de classificação de função enzimática. Por último, introduzimos uma nova metodologia para a identificação de genes diferencialmente expressos utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA. Diferentemente das abordagens tradicionais, nossa metodologia evita passos intermediários de preprocessamento que são desnecessários e devido a isto não acumula erros destas análises, o que resulta em um método mais sensível e robusto. / In the first part of this thesis, we studied the operating principles of cell fate decisions mediated by Notch signaling pathway. This pathway have important role in cell fate determination during embryonic development, wound healing and tumorigenesis. Notch signaling is activated by binding of Notch receptor of one cell to either of its ligand- Delta or Jagged- of another cell. Notch-Delta circuit forms an intercellular toggle switch, and two neighboring cells tend to adopt different fates - Sender (high ligand, low receptor) and Receiver (low ligand, high receptor). Here, we present a new tractable theoretical framework that incorporates both Delta and Jagged in Notch signaling, and show that Notch-Delta-Jagged circuit enables an additional fate - hybrid Sender/Receiver (S/R) (medium ligand, medium receptor) and behaves as a three-way switch. Further, we found that production rates of both the ligands and the asymmetric modulation of binding affinity of Notch to its ligands by glycosyltransferase Fringe severely affects the parameter range of the existence of these states and their relative stability - high levels of Jagged, but not that of Fringe or Delta, promote hybrid S/R state and lateral induction. We elucidate the role of Jagged in cell fate determination and discuss its possible implications in understanding tumor-stroma crosstalk, which frequently entails Notch-Jagged communication. We further evaluate the interplay among Notch signaling, inflamation and Cancer Stem Cell population. We show that inflammation can expand the population of Cancer Stem Cells (CSCs) by increasing the levels of Jagged in cells that can further activate Notch signaling pathway in neighboring non-CSCs. Our results suggest that, inhibiting the production of Jagged dampens the effect of inflammation in expanding the CSC population, indicating that inflammatory signal function through Notch-Jagged signaling to increase CSCs. Our results are consistent with observations in basal-like breast cancer, where loss of Fringe and constitutive activation of NF-kB-Jag1 axis promotes CSC population. Our computational framework can be tailored to include additional signals such as p53 and hypoxia that affect this plasticity to gain stemness, thus providing a platform that can be useful in designing novel therapies. In the second part of the thesis, we introduce a new method for feature selection: Supervised Variational Relevance Learning (Suvrel). This is a variational method to determine metric tensors to define distance based similarity in pattern classification, inspired in relevance learning. We propose a new methodology where the metric tensor can be calculated analytically. Preprocessing the patterns by doing linear transformations using the metric tensor yields a dataset which can be more efficiently classified. We test our methods using publicly available datasets, for some standard classifiers. We also applied this methodology to study the relationship between global structural parameters and the Enzyme Commission hierarchy. Lastly, we propose a new methodology for identifying the differentially expressed genes using DNA microarray technology. Unlike traditional approaches, our methodology skips intermediate unnecessary preprocessing steps and therefore does not accumulate errors due to these analysis, resulting in a more sensitive and robust method.