Submitted by Claudemilson dos Santos (claudemilson.unesp@gmail.com) on 2018-05-04T19:29:04Z No. of bitstreams: 1 TESE CLAUDEMILSON 2018 PUBLICADA.pdf: 5622961 bytes, checksum: 79c0398762c5c1699e1955254be82faf (MD5) / Approved for entry into archive by Lucilene Cordeiro da Silva Messias null (lubiblio@bauru.unesp.br) on 2018-05-07T17:46:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_ c_ dr_bauru.pdf: 5611478 bytes, checksum: 24a4edf7aac9b1a4496e22587ac9e2e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T17:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_ c_ dr_bauru.pdf: 5611478 bytes, checksum: 24a4edf7aac9b1a4496e22587ac9e2e3 (MD5) Previous issue date: 2018-03-14 / Esta tese consiste num estudo que visou avaliar o impacto da aplicação da anamorfose no redesenho da sinalização de trânsito horizontal, cuja hipótese supõe que pode melhorar a percepção dos motoristas para essa categoria de sinalização de trânsito. Anamorfose é o nome que se dá para o desenho em perspectiva cônica cujo plano de projeção não é perpendicular à linha de visada. O plano de projeção pode se dividir em várias superfícies e formas, a imagem projetada se distorce até ficar irreconhecível; mas quando observado do ponto de vista pré-determinado, a imagem se forma novamente. Na sinalização de trânsito horizontal a anamorfose é utilizada para simular uma aparência tridimensional aos sinais de trânsito horizontais, denominada como Sinalização Horizontal Anamórfica (SHA). A base teórica, que se fundamentou nos princípios do design ergonômico e nas teorias da percepção e do comportamento humano; está expressa numa revisão que buscou compilar e discutir a relação entre as diversas áreas do conhecimento humano e o sistema de percepção visual no trânsito, e analisando-se o problema de pesquisa de diversos pontos de vista, buscando-se concordâncias, discordâncias e avanços nas ciências que estudam o comportamento humano. Para encontrar evidências que pudessem comprovar ou refutar a hipótese, foi realizado um experimento de desenvolvimento e aplicação de uma SHA em um trecho urbano simulado e comparou-se a taxa de percepção dos motoristas que por ela passaram com os que passaram por uma sinalização convencional. A sinalização horizontal utilizada para a pesquisa foi a legenda DEVAGAR, pois há estudos anteriores que detectaram índices de percepção muito baixos. Os resultados do teste revelou haver diferença significativa na taxa de percepção dos dois grupos. A discrepância entre os dois grupos pode significar que a SHA exerce algum efeito sobre a percepção visual do motorista. Os resultados revelaram que os motoristas que utilizarem o trecho contendo a SHA terão possibiidade maior de perceberem a sinalização do que os grupos que não continham a SHA, pois os testes estatísticos realizados comprovaram o aumento significativo de motoristas que perceberam a sinalização horizontal anamórfica em relação à sinalização convencional. / This thesis consists of a study that aimed to evaluate the impact of the application of anamorphosis on the redesign of horizontal traffic signs, whose hypothesis supposes that it can improve the perception of the drivers for this category of traffic signaling. Anamorphosis is the name given to the conical perspective drawing whose projection plane is not perpendicular to the line of sight. The projection plane can divide into several surfaces and shapes, the projected image distorts until it is unrecognizable; but when viewed from the predetermined point of view, the image is formed again. In horizontal traffic signaling the anamorphosis is used to simulate a three-dimensional appearance to the horizontal traffic signals, denominated Horizontal Anamorphic Signaling (SHA - from potuguese "Sinalização Horizontal Anamórfica). The theoretical basis, which was based on the principles of ergonomic design and theories of human perception and behavior; is expressed in a review that sought to compile and discuss the relationship between the various areas of human knowledge and the system of visual perception in traffic, and analyzing the research problem from different points of view, seeking concordances, disagreements and advances in sciences that study human behavior. To find evidence that could prove or disprove the hypothesis, an experiment was carried out to develop and apply an SHA in a simulated urban stretch, comparing the perception rate of the drivers that passed with those who passed through a conventional signaling. The horizontal signaling used for the research was the legend DEVAGAR, since there have been previous studies that detected very low indices of perception. The results of the test revealed that there was a significant difference in the perception rate of the two groups. The discrepancy between the two groups may mean that SHA has some effect on the driver's visual perception. The results showed that drivers using the SHA stretch will have a greater possibility of perceiving the signaling than the groups that did not contain SHA, since the statistical tests performed showed a significant increase in drivers who perceived the anamorphic horizontal signaling in relation to the conventional signaling.

Mitochondria are central players in cell metabolism, responsible for the vast majority of ATP production in most cells. Although originally thought to be passive organelles focused only in keeping cellular ATP at adequate levels, complex interplay between mitochondrial function and cell signaling has been largely recognized over the last decades. Not surprisingly, given their role, changes in nutritional status promoted by chronic interventions like caloric restriction or short-term situations like fasting in animals or nutrient deprivation in cultured cells are one of the main factors that can activate those signaling mechanisms. One particular way in which this mitochondria-cell crosstalk can occur is through mitochondrial Ca2+ handling, a process in which Ca2+ signals generated by the cell are able to translate into elevations in mitochondrial matrix [Ca2+] due to the presence of the mitochondrial Ca2+ uniporter in the organelle. While the impact of mitochondrial Ca2+ handling on cellular function has been widely studied, the conditions which can modulate the process of mitochondrial Ca2+ handling itself are still not well characterized. In this work, we sought to test the effects of different interventions linked to nutritional status on mitochondrial Ca2+ handling. We found that caloric restriction, physiological fasting and modulations of mitochondrial dynamics resulted in modulation of mitochondrial Ca2+ handling through changes in their maximal Ca2+ retention capacity or Ca2+ uptake rates. These changes were, measured by following mitochondrial Ca2+ uptake using different strategies, employing the fluorescent Ca2+ probe Ca2+ Green 5N for experiments in isolated mitochondria and permeabilized cells and the cytosolic probe Fura2-AM in intact cells. Caloric restriction resulted in higher calcium uptake and retention in liver mitochondria, protecting against pathological conditions of Ca2+ overload during ischemia/reperfusion. On the other hand, overnight and short term fasting resulted in lower mitochondrial Ca2+ retention and oxidative phosphorylation capacity in the liver. Modulating mitochondrial morpholoy in C2C12 myoblasts showed that more fragmented mitochondria were less capable of taking up Ca2+, while more fusioned mitochondria showed the opposite phenotype. This modulation in Ca2+ handling through changes in mitochondrial morphology interfered with the process of Store-Operated Ca2+ entry in the cells, showing that these modulations can have impacts in physiological contexts as well. Overall, this work both establishes novel mechanisms of modulation of mitochondrial Ca2+ handling and demonstrates their relevance both in pathology and normal cellular physiology. / Mitocôndrias possuem um papel central no metabolismo das células, sendo responsáveis pela maioria da produção de ATP na maioria dos tipos celulares. Embora originalmente se pensasse nas mitocôndrias como organelas estáticas, focadas somente em manter os níveis adequados de ATP na célula, a interação entre a função mitocondrial e a sinalização celular tem sido fortemente reconhecida nas ultimas décadas. Dado este papel, não é surpreendente que mudanças no estado nutricional, tanto crônicas como na restrição calórica quanto em situações como o jejum em animais e a privação de nutrientes em cultura de células foram demonstradas como sendo um dos principais fatores que podem ativar estes mecanismos de sinalização. Uma das formas em que esta interação entre a mitocôndria e a célula ocorre é através do manejo de Ca2+ mitocondrial, um processo em que sinais de Ca2+ gerados pela célula podem resultar em aumentos na [Ca2+] na matriz mitocondrial devido à presença do uniportador de Ca2+ mitocondrial na organelaEmbora o impacto do manejo de Ca2+ mitocondrial na função da célula tenha sido amplamente estudado, a regulação do processo de manejo de Ca2+ mitocondrial em si não é bem conhecida. Neste trabalho, nós nos propusemos a testar os efeitos de diferentes intervenções ligadas ao estado nutricional no manejo de Ca2+ mitocondrial e o possível impacto destas modulações nacapacidade de retenção e na taxa de captação de Ca2+ mitochondrial. As intervenções estudadas foram a restrição calórica, jejum e mudanças na dinâmica mitocondrial, e todas elas resultando em mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial, que foram medidos acompanhando a captação de Ca2+ em mitocôndrias isoladas ou células permeabilizadas utilizando a sonda Ca2+ Green 5N e em células intactas utilizando a sonda de Ca2+ citosólica Fura2-AM. Enquanto a restrição calórica resultou em uma maior capacidade de retenção de Ca2+ e em maiores taxas de captação, protegendo contra as condições patológicas de desregulação de Ca2+ observadas durante a isquemia/reperfusão, o jejum curto ou pela duração da noite resultou em uma diminuição na capacidade de retenção de Ca2+ e na oxidação fosforilativa mitocondriais. As mudanças observadas modulando a dinâmica mitocôndria (feitas utilizando-se mioblastos da linhagem C2C12) revelaram que mitocôndrias mais fragmentadas são menos capazes de captar Ca2+, enquanto mitocôndrias mais fusionadas possuem o fenótipo oposto. Essas mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial interferem com o processo de Store-Operated Ca2+ entry nestas células, demonstrando que essas modulações da captação de Ca2+ mitocondrial também podem ser relevantes em contextos fisiológicos. Em resumo, este trabalho ajudou a estabelecer novos mecanismos de modulação do manejo de Ca2+ mitocondrial que podem ser relevantes tanto em condições patológicas quanto na fisiologia normal das células.

Botropasina (Bt) é uma toxina isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca, associada a processos inflamatórios. Neste contexto da inflamação como fator desencadeante da angiogênese, verificamos se a botropasina, uma metaloproteinase isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca, poderia modular diretamente as transições fenotípicas do processo angiogênico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os efeitos da Botropasina, domínios DC e peptídeos sintéticos derivados dos domínios DC (Ca II, Ca III e HCR), sobre os eventos da angiogênese como proliferação, migração, secreção de gelatinases, tubulogênese, e os mecanismos moleculares envolvidos no sistema in vitro nas células endoteliais HUVEC-CS. Nossos resultados mostram que tanto as proteínas Bt e DC, e o peptídeo HCR induzem os eventos angiogênicos de proliferação, migração, secreção de MPPs e formação de túbulos em matrigel, e estes são dependentes da dose. Os peptídeos Ca II e Ca III não induziram todas as características próprias da angiogênese. A migração observada tanto nos ensaios 2D, 3D, assim como na expressão do DLL4 e as fibras de estresse do citoesqueleto, sugerem que o tratamento com botropasina e o peptídeo HCR induzem o fenótipo migratório - tip cells nas células endoteliais. A ativação da via de sinalização de Erk via integrinas, seria o mecanismo de sinalização das proteínas Bt e DC, enquanto o peptídeo linear HCR teria um mecanismo de interação direta com receptores intracelulares. O tratamento com a Bt estimula a fosforilação das proteínas Akt, Fak e p38, envolvidas na migração, sobrevida e estresse celular, mas sem alterações na morfologia. A presença de proteínas inflamatórias como vimentina e calistatina nas formas secretada, indica que os tratamentos com as proteínas Bt e DC induzem uma resposta inflamatória nas células endotelias, promovendo os eventos da angiogênese, enquanto o peptídeo HCR se mostra como altamente mitogênico e sem efeitos inflamatórios. / Botrophasin (Bt) is a metalloproteinase isolated from Bothrops jararaca snake venom, an associated with inflammatory processes. In the context of inflammation as a triggering factor of angiogenesis, we tested if botropasin, could directly modulate the phenotypic transitions of the angiogenic process. The objective of this work was to characterize the effects of Botropasin, DC domains and synthetic peptides derived from the DC domains (Ca II, Ca III and HCR), on the events of angiogenesis such as proliferation, migration, gelatinases secretion, tubulogenesis, and molecular mechanisms involved in the in vitro system in HUVEC-CS endothelial cells. Our results show that both Bt, DC proteins, and the HCR peptide induce the angiogenic events of proliferation, migration, MPP secretion and matrigel tubule formation, and these are dose dependent. Ca II and Ca III peptides did not induce all the angiogenesis characteristics. The migration observed in both the 2D and 3D assays, as well as in the expression of DLL4 and cytoskeletal stress fibers, suggests that treatment with bothropasin and the HCR peptide induce the migratory phenotype - tip cells in the endothelial cells. Activation of the Erk signaling pathway via integrins would be the signaling mechanism for Bt and DC proteins, whereas the linear peptide HCR would have a mechanism of direct interaction with intracellular receptors. Treatment with Bt stimulates the phosphorylation of Akt, Fak and p38 proteins, involved in migration, survival and cell stress, but without changes in morphology. The presence of inflammatory proteins such as secreted vimentin and kallistatin indicates that the treatments with Bt and DC proteins induce an inflammatory response in the endothelial cells, promoting the angiogenesis events, whereas the HCR peptide shows to be highly mitogenic and without inflammatory effects.

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), acomete seres humanos em todo mundo, e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade dentre as doenças infecciosas. Nesse cenário, a TB ainda é vista como um grande desafio para a ciência e para medicina. Com o estudo de novos alvos moleculares para terapia e diagnóstico, por exemplo, a sinalização Notch tem sido descrita como uma via importante para a manutenção da resposta imunológica durante a infecção por Mtb. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da via Notch na modulação da resposta imune durante a infecção por Mtb em humanos. Neste trabalho foram incluidos 13 pacientes com tuberculose ativa e 13 indivíduos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e avaliadas quanto à expressão de receptores Notch 1 - 2 em células T e ligantes Notch, DLL1 - 4 em subpopulações de monócitos por citometria de fluxo e expressão de genes relacionados à via Notch e resposta imune. Além disso, o plasma foi utilizado para avaliar níveis de citocinas, CD14s e CD163s. Ainda, avaliamos a função celular dependente da ativação da via Notch durante a infecção de células mononucleares de sangue periférico de indivíduos saudáveis com Mtb H37Rv in vitro. Observamos que pacientes com TB ativa apresentaram aumento na expressão de DLL4 em monócitos intermediários e não-clássicos e diminuição na expressão de Notch 2 em células T CD8+. In vitro, observamos nas culturas de PBMCs, aumento da expressão de DLL4 em monócitos intermediários e Notch 2 em células T CD4+. A expressão do ligante DLL4 em monócitos intermediários e a expressão do Notch 1 em células T CD4+ em pacientes com TB ativa se correlacionaram positivamente com o grau de lesão pulmonar. Além disso, pacientes com quadros de lesão pulmonar moderado e avançado têm maior expressão de Notch 1 em células T CD4+ quando comparados a pacientes com grau mínimo de lesão pulmonar. Pacientes com TB ativa apresentam aumento significativo nos níveis plasmáticos de IL-6, IP- 10, CD14s e CD163s e diminuição nos níveis de IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? e RANTES. Os níveis plasmáticos de IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES e IL-10 se correlacionaram positivamente com o maior grau de lesão pulmonar.Além disso, demonstramos que os níveis de IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 e IL-2 se relacionam com maior expressão do receptor Notch 1 em células T CD4+ , enquanto níveis plasmáticos de IP-10, CD163s e de procalcitonina se correlacionam com maior expressão de Notch 1 em células T CD8+. Evidenciamos maior tendência na expressão de HES1 em pacientes com TB ativa e células infectadas in vitro, indicando que a via Notch está sendo ativada durante a infecção por Mtb. De forma interessante, in vitro as culturas de PBMCs tratadas com inibidor farmacológico da via Notch (GSI), reduziram a produção de IL-17A, IL-2 e IL-10 e aumentaram IL-8, enquanto o tratamento com anti-hDLL4 promoveu o aumento significativo nos níveis de TNF-? e atividade fagocítica de monócitos. Em conclusão, a expressão de receptores e ligantes Notch é alterada durante a TB, em especial o ligante DLL4 em subpopulações de monócitos. Além disso, a via Notch parece ser importante na modulação de respostas pró e anti-inflamatórias. Nesse trabalho, sugerimos que a expressão de Notch 1 em células T e DLL4 em subpopulações de monócitos estão associados com a gravidade da TB. Assim, a detecção desses constituintes da via Notch em PBMCs de pacientes com TB ativa são potenciais biomarcadores para avaliar a progressão da doença. / Tuberculosis (TB) is a bacterial infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affects humans worldwide, and is considered a major cause of morbidity and mortality among infectious diseases. In this scenario, TB is still seen as a major challenge for science and medicine. With the study of new molecular targets for therapy and diagnosis, for example, Notch signaling has been described as an important pathway for the maintenance of immune response during Mtb infection. Thus, the objective of this work was to evaluate the participation of the Notch pathway in the modulation of the immune response during Mtb infection in humans. In this study, 13 patients with active tuberculosis and 13 healthy individuals were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and evaluated for Notch 1 - 2 receptor expression in T cells and Notch, DLL1 - 4 ligands in monocyte subpopulations by flow cytometry and expression of Notch - pathway related genes and immune response. In addition, plasma was used to assess levels of cytokines, CD14s and CD163s. Furthermore, we evaluated the cellular function dependent on the activation of the Notch pathway during the infection of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects with Mtb H37Rv in vitro. We observed that patients with active TB had increased DLL4 expression in intermediate and nonclassic monocytes and decreased expression of Notch 2 in CD8+ T cells. In vitro, we observed in the cultures of PBMCs, increased expression of DLL4 in intermediate monocytes and Notch 2 in CD4+ T cells. The expression of the DLL4 linker in intermediate monocytes and the expression of Notch 1 in CD4+ T cells in patients with active TB correlated positively with the degree of lung injury. In addition, patients with moderate and advanced lung injury have higher Notch 1 expression in CD4+ T cells when compared to patients with a minimal degree of lung injury. Patients with active TB showed a significant increase in plasma levels of IL-6, IP-10, CD14s and CD163s, and decreased levels of IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? and RANTES. The plasma levels of IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES and IL-10 correlated positively with the highest degree of lung injury. In addition, we demonstrated that levels of IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 and IL-2 are related to higher Notch 1 receptor expression in CD4+ T cells, whereas plasma levels of IP-10,CD163s and procalcitonin correlate with increased Notch 1 expression in CD8+ T cells. We have shown a greater trend in HES1 expression in patients with active TB and in vitro infected cells, indicating that the Notch pathway is being activated during Mtb infection. Interestingly, in vitro cultures of PBMCs treated with the Notch pharmacological inhibitor (GSI), reduced IL-17A, IL-2 and IL-10 production and increased IL-8, while anti-hDLL4 treatment promoted the significant increase in TNF-? levels and monocyte phagocytic activity. In conclusion, the expression of Notch receptors and ligands is altered during TB, especially the DLL4 linker in monocyte subpopulations. In addition, the Notch pathway appears to be important in modulating pro and anti-inflammatory responses. In this work, we suggest that Notch 1 expression in T cells and DLL4 in monocyte subpopulations is associated with TB severity. Thus, detection of these constituents of the Notch pathway in PBMCs of patients with active TB are potential biomarkers to assess disease progression.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é uma espécie de grande importância biotecnológica no que tange a degradação de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol em larga escala. Seu sistema de enzimas celulolíticas é muito eficiente, apesar de ser possuir poucas celulases, sugerindo que o controle dessas enzimas vai além da regulação transcricional. Assim, neste trabalho nós obtivemos o perfil fosfoproteômico de T. reesei cultivado em glicose e bagaço de cana-de-açúcar a partir de análise fosfoproteômica LC-MS/MS por spectral counting. A comparação entre os perfis de fosfoproteínas obtidos das linhagens parental QM6a de T. reesei e dos mutantes knockout para TMK1 e TMK2 permitiu a demonstração de que essas MAPK agem de maneira interconectada com outras vias de transdução de sinal na célula, especialmente a via de TOR e de AMPc-PKA, para regulação da produção de celulases. Além disso, também demonstramos a regulação da resposta a estresse celular por TMK2, e o papel da fosforilação no controle direto de enzimas CAZy. Nossos resultados mostram que a fosforilação desempenha papel importante na regulação dessas enzimas e de outras funções celulares no fungo após a transcrição de seus respectivos genes. O agrupamento desses dados permite melhor entendimento da via de sinalização mediada pelas MAPK TMK1 e TMK2 de T. reesei, e como as modificações pós-traducionais promovidas por elas afetam no sensing de nutrientes celulares e, por consequência, na produção de enzimas celulolíticas, de forma direta ou indireta. / The filamentous fungus Trichoderma reesei has great biotechnological importance in regards to the lignocellulosic biomass degradation for large-scale production of bioethanol. Its cellulolytic system is very efficient, despite being composed by only a few cellulases, which suggests that the control of these enzymes goes beyond their transcriptional regulation. Thus, in this study, we performed a spectral counting LC-MS/MS analysis and achieved the phosphoproteomic profile of T. reesei grown either in glucose or sugarcane bagasse as sole carbon source. The comparison between the phosphoproteins profiles obtained from the parental strain QM6a and the knockout mutants for TMK1 and TMK2 allowed us to demonstrate that these MAPK act in an interconnected manner with other signaling transduction pathways, especially the TOR and cAMP-PKA pathways, in order to regulate the cellulases production. Furthermore, we were also able to determine the regulation of cellular stress response by TMK2, and the role of phosphorylation in the direct control of CAZymes. Our results show that phosphorylation plays an important role on the control of these enzymes and other cellular functions in T. reesei after the transcription of their respective genes. Taken together, this data allows better comprehension of the signaling pathways mediated by TMK1 and TMK2 in T. reesei, and how the post-translational modification promoted by these MAPK might affect the nutrient sensing and, therefore, the production of the cellulolytic enzymes, either directly or indirectly.

Os mastócitos são células multifuncionais do sistema imunológico que participam em diversos processos biológicos. As funções dos mastócitos estão diretamente relacionados com a sua ativação e, subsequente, liberação de mediadores químicos. Os eventos iniciais da ativação dos mastócitos e da transdução de sinais ocorrem em microdomínios lipídicos (lipid rafts) da membrana plasmática. Os gangliosídeos derivados do GD1b são constituintes dos lipid rafts de mastócitos de roedores. O intercruzamento destes gangliosídeos pelo mAb AA4, resulta na formação de agregados (caps) na superfície celular e promove uma ativação parcial dos mastócitos, sem que ocorra a desgranulação. A ativação é semelhante a observada quando os FcRIs são intercruzados por antígenos multivalentes ligados a IgEs, mas neste caso ocorre a desgranulação. O presente estudo tem como objetivo caracterizar o papel dos gangliosídeos derivados do GD1b na liberação de mediadores de mastócitos da linhagem RBL-2H3. O intercruzamento dos gangliosídeos derivados do GD1b resulta na ativação dos fatores de transcrição NFAT e NFB e esta ativação é mediada pela proteína quinase Syk. A ativação destes fatores de transcrição resulta na liberação de mediadores neo-sintetizados, tais como: TNF-, interleucina (IL)-4. Por outro lado, o intercruzamento dos gangliosídeos derivados de GD1b não induz a liberação dos mediadores neoformados como o leucotrieno B4 (LTB4) e o leucotrieno C4 (LTC4). A agregação dos gangliosídeos derivados do GD1b resulta na desorganização dos lipid rafts e na redistribuição de seus componentes, como demostrado pela análise proteômica. Estes dados mostraram proteínas capazes de desencadear uma ativação parcial dos mastócitos e proteínas reguladoras negativas da desgranulação estão up reguladas, enquanto que proteínas críticas para a transdução do sinal estão down reguladas. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os gangliosídeos derivados do GD1b desempenham papel crucial na integridade dos lipid rafts modulando a ativação e liberação de mediadores de mastócitos. / Mast cells are immunoregulatory cells that participate in diverse biological events. The action of mast cells is directly related to their activation and subsequent mediator release. Early signal transduction events occur in lipid rafts in the plasma membrane. GD1b-derived gangliosides are known constituents of lipid rafts in rodent mast cells. The cross-linking of these gangliosides by mAb AA4 results in a partial activation of mast cells similar to that observed when FcRIs are cross-linked, but does not result in the mast cell degranulation. With time, the gangliosides bound to mAb AA4 cap on the cell surface. The present study aims to characterize the role of the rodent mast cell specific gangliosides derived from GD1b in mediator release from RBL-2H3 mast cells. Cross-linking the GD1b-derived gangliosides activated the transcription factors NFAT and NFB and this activation was mediated by Syk. The activation of theses transcription factors by cross-linked GD1b-derived gangliosides results in the release of the neo-synthesized mediators TNF- and interleukin (IL)-4. However, cross-linking GD1b-derived gangliosides did not stimulate release of the newly formed mediators leukotriene B4 (LTB4) and leukotriene C4 (LTC4). Capping of GD1b-derived gangliosides disorganized lipid rafts and resulted in a redistribution of lipid raft components. Proteomic analysis showed that proteins that trigger mast cell activation and negative regulatory proteins of degranulation are up regulated, whereas proteins critical for signal transduction are down regulated in mast cells where the gangliosides are capped. The results of this work demonstrate that the mast cell-specific GD1b-derived gangliosides are crucial in maintaining the functional integrity of the lipid rafts and modulate cell activation and subsequent mediator release from mast cells.

A flagelina é um agonista natural do sensor TLR5 e do inflamassoma NAIP/NLRC4 que é responsável pela secreção de IL-1β e IL-18 e pela indução de morte celular necrótica, via ativação da caspase-1. Entretanto, nós observamos que a inserção da flagelina de B. subtilis no citosol celular por meio de vesículas lipídicas, induz um processo atípico de morte nos macrófagos peritoneais (PMs) deficientes em NLRC4, ASC e caspase-1/11. A morte dos PMs manteve seu resultado antimicrobiano, sendo acompanhada da liberação de IL-1α. A morte celular e a secreção das citocinas IL-1α e IL-1β, foi mediada por catepsinas lisossomais, sugerindo uma cooperação entre a via lisossomal e os inflamassomas nas respostas induzidas pela flagelina. Além disso, a flagelina de S. typhimurium foi capaz de induzir dano lisossomal e secreção de IL-1α e IL-1β mediada pelo eixo caspase-catepsinas, na ausência de carreadores, e estas citocinas tiveram um impacto na imunidade adaptativa induzida pela flagelina, no modelo de ativação de linfócitos T específicos por células dendríticas, in vitro. / Flagellin is a natural agonist of TLR5 and NAIP/NLRC4 inflammasome that is responsible for IL-1β and IL-18 secretion and for the induction of a necrotic cell death, both mediated by caspase-1. However, we observed that flagellin from B. subtilis inserted into lipid vesicles, induced an atypical cell death in peritoneal macrophages (PMs) in the absence of NLRC4, ASC and caspase-1/11. This inflammasome-independent cell death retained its antimicrobial outcome, being accompanied with IL-1α secretion. Importantly, cell death and caspase-1-dependent IL-1α and IL-1β secretion were regulated by lysosomal cathepsins, suggesting a cooperation between the inflammasome and lysosomal pathway in response to flagellin. We also observed that flagellin from S. typhimurium is able to induce lysosomal damage and IL-1α and IL-1β secretion by PMs in the absence of a carrier, through a caspase-catepsins-dependent manner, and that cytokines were important to the ability of flagellin in to induce adaptive immune response by antigen-specific T cells.

A sinalização retrógrada mitocondrial é uma via de comunicação entre a mitocôndria e o núcleo que regula a expressão de uma série de genes nucleares que codificam proteínas mitocondriais, em resposta a disfunções mitocondriais. Em Saccharomyces cerevisiae, a via depende de Rtg1p e Rtg3p, que juntos formam o fator de transcrição que regula a expressão gênica, e de Rtg2p, um ativador da via. Aqui, nós mostramos novos estudos direcionados à investigação do impacto da sinalização retrógrada RTG-dependente na fisiologia mitocondrial. Verificamos que mutantes incapazes de realizar sinalização retrógrada RTG-dependente apresentam consumo de oxigênio mais elevado e menor produção de peróxido de hidrogênio em fase estacionária quando comparados a células selvagens. Interessantemente, mutantes RTG são menos capazes de decompor peróxido de hidrogênio assim como manter-se viáveis quando desafiados com peróxido. Nossos resultados indicam que a sinalização por RTG está envolvida na indução hormética de defesas antioxidantes e de resistência a estresse, função ainda não descrita para este sistema. / Mitochondrial retrograde signaling is a communication pathway between the mitochondrion and the nucleus which regulates the expression of a subset of nuclear genes that codify mitochondrial proteins, mediating cell response to mitochondrial dysfunction. In Saccharomyces cerevisiae, the pathway depends on Rtg1p and Rtg3p, which together form the transcription factor that regulates gene expression, and Rtg2p, an activator of the pathway. Here, we provide novel studies aimed at assessing the functional impact of the lack of RTG-dependent signaling on mitochondrial activity. We show that mutants defective in RTG-dependent retrograde signaling present higher oxygen consumption and reduced hydrogen peroxide release in the stationary phase when compared to wild type cells. Interestingly, RTG mutants are less able to decompose hydrogen peroxide as well as maintain viability when challenged with hydrogen peroxide. Overall, our results indicate that RTG signaling is involved in the hormetic induction of antioxidant defenses and stress resistance, a function of this system not yet described.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.), por acumular sacarose em altas concentrações tem sido o foco de diversas pesquisas bioquímicas e fisiológicas. A relação entre a atividade fotossintética do tecido fonte da folha e o acúmulo de sacarose no órgão dreno, o colmo, ainda não é bem compreendida. Em estudos prévios observou-se que a atividade fotossintética declina durante a maturação do colmo em cultivares comerciais. As folhas de cana-de-açúcar aparentam possuir a capacidade de aumentar o fornecimento de açúcares para o colmo sob condições de aumento da demanda. E ainda, em plantas superiores, o açúcar tem um importante papel no controle do crescimento e desenvolvimento, no entanto, as vias de sinalização e seus correspondentes mecanismos moleculares e metabólicos, ainda estão sendo decifrados. Porém, as informações a respeito da regulação por açúcares são escassas em cana-de-açúcar. Assim, para compreender os mecanismos relacionados ao acúmulo de sacarose e os mecanismos metabólicos de sinalização de açúcares e análogos, realizou-se ensaios de sinalização exógena de açúcares, acompanhando as alterações do transcriptôma e metabolôma, de modo a relacionar essas informações para obtermos uma visão de biologia sistêmica. A partir deste estudo foi possível identificar relações entre a sinalização de açúcares e seus homólogos, o desenvolvimento da cana-de-açúcar e as diversas vias em que estes podem atuar, tais como; glicólise, transportadores de açúcares, genes sinalizadores, metabolismo de sacarose e trealose. No que se refere ao desenvolvimento da planta, notou-se diferenças temporais na maneira pela qual os açúcares são reconhecidos, podendo estar relacionado às alterações de papel da folha (dreno-fonte) ao longo do desenvolvimento. Observou-se uma sensibilidade maior aos 12 meses, do que aos 4 meses, tanto para a ação dos açúcares quanto para o efeito osmótico, em que houveram maiores alterações no perfil de expressão gênica e na quantidade de metabólitos diferenciais. No entanto, as respostas de alterações de expressão e concentração de metabólitos aparentam ser opostas. E ainda, a concentração ótima de açúcar para desencadear uma sinalização positiva, deve ser posteriormente investigada. / Sugarcane (Saccharum spp.), due the capacity of sucrose accumulation in high concentrations has been the focus in diverse biochemical and physiological studies. The relationship between leaf photosynthesis and sugar accumulation in the sink organ, the culm, is still not fully understood. In previous studies it has been observed that photosynthesis declines during culm maturation in commercial cultivars. Sugarcane leaves appears to posess the capacity to increase the sugars supply at the culm under increased conditions demand. In higher plants, sugar has an important role controlling growth and development, however, the signaling networks and their molecular and metabolic components are still not fully understood. To understand the mechanisms related to sugar accumulation and the metabolic mechanisms of sugar signaling, exogenous sugar signaling assays were performed. Followed by transcriptomics and metabolomics analyzes using a systems biology approach. Through this study it was possible to identify the relationship between the sugars and homologues signaling, the sugarcane development and the diverse pathways where they can act, such as glicolysis, sugar transporters, signaling genes, sucrose and trehalose metabolism. At the plant development, it was possible to notice time differences on the way the sugars were recognized, what can be related to the changing leaf roles, (sink-source) through the development. Also a higher sensitivity at 12 months than 4 months, as for the sugar signaling action or as the osmotic effect was observed, which presented higher expression profile and metabolic amount alteration. However the gene expression and metabolic responses seems to be opposite. Still, an optimal sugar concentration to develop a positive signaling should be forward investigated.

Os simuladores de direção são ferramentas de pesquisa que permitem estudar o comportamento do condutor em diversos cenários de direção, de forma rápida, segura e econômica. Este estudo faz parte de um projeto de pesquisa que visa utilizar essas ferramentas na avaliação de projetos de sinalização, antes da sua implantação na rodovia. Em particular, o objetivo deste trabalho foi analisar como os condutores percebem a sinalização vertical dentro de um ambiente simulado de direção, apoiado no uso de um sistema de rastreio do olhar. O andamento da pesquisa abrangeu a montagem do simulador e do sistema de rastreio do olhar, a geração do ambiente simulado de direção, o experimento no simulador para medir a percepção da sinalização dentro do ambiente virtual, e por último, a análise e validação dos resultados. No experimento, 21 condutores dirigiram em um trecho de 10 quilômetros da rodovia BR-116 que possui 31 sinais de trânsito, para mensurar a distância de percepção, o número de fixações e o tempo de observação da sinalização, assim como a variação da velocidade após percepção da mesma. A percepção da sinalização dentro do ambiente virtual foi semelhante à reportada na literatura para estudos em estradas: em média, os condutores perceberam um de cada três sinais, o tempo de observação foi de 360 milissegundos, a distância de percepção foi de 100 metros e somente a percepção dos limites de velocidade foi relevante no comportamento dos condutores. Adicionalmente, obteve-se uma validade relativa entre as velocidades no simulador e as velocidades de operação medidas no trecho estudado. Nesse sentido, os resultados deste estudo sustentam a viabilidade e a validade do simulador de direção na avaliação de projetos de sinalização. Finalmente, como contribuição adicional, propuseram-se medidas para aprimorar a sinalização no trecho estudado e o realismo do simulador de direção. / Driving simulators are research tools that allow studying driver behavior on several driving scenarios, in a safely and cost-effective way. This study pertains to a research project whose goal is to use these tools in the assessment of road signage projects, before their implementation on roadway. In particular, the goal of this study was to analyze how drivers perceive road signs within a simulated driving environment, supported by an eye tracking system. The research development included the assembling of the driving simulator and the eye tracking system, the generation of the simulated environment, an experiment to measure the signaling perception within that environment, and finally, the analysis and validation of the results. In the experiment, twenty-one drivers drove over a ten-kilometer virtual segment of the BR-116 roadway, that has thirty-one traffic signs, in order to measure the number of eye fixations, the perception distance and the observation time over each sign, as well as, the speed change after its perception. The perception of the road signs within the virtual environment was similar to that reported in the literature for on-road studies: in average, the drivers perceived one-third of the traffic signs, the mean observation time was 360 milliseconds, the mean perception distance was 100 meters and only the speed limit signs perception was relevant on the drivers behavior. Furthermore, it was observed a relative validity between the driving simulator speeds and the actual operating speeds in the studied segment. In that sense, this study shows the feasibility and validity of using driving simulators to assess road signage projects. Finally, some countermeasures were proposed in order to enhance both the road signaling of the studied segment and the road signs perception within the simulated driving environment.