A oxidação do DNA por espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio molecular singlete [O2 (1Δg)] , pode estar relacionada ao aparecimento de mutações e ao desenvolvimento de doenças. O O2 (1Δg) pode ser gerado biologicamente por reação de fotossensibilização, pela reação de H2O2 e HOCl e pela decomposição de peróxidos orgânicos contendo hidrogênio alfa (α-ROOH), na presença de metais de transição (Fe2+, Cu2+) ou HOCl. A decomposição de α-ROOH, como hidroperóxidos de lipídeos ou proteínas na presença de metais de transição, pode gerar O2 (1Δg) via mecanismo de Russell. Neste mecanismo, a oxidação de α -ROOH gera radicais peroxila, que podem reagir entre si, formando um intermediário tetraóxido linear. Este intermediário tetraóxido linear pode decompor através de um mecanismo cíclico e produzir O2 (1Δg), um álcool e um composto carbonílico. Como a decomposição de α-ROOH pelo mecanismo de Russell pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) decidimos investigar se o α-hidroperóxido de timina, 5-(hidroperoximetil)uracil (5-HMPU), poderia gerar esta espécie reativa na presença de metais (Ce4+, Fe2+, Cu2+) e HOCl. Outro objetivo foi avaliar os efeitos oxidativos, em DNA plasmidial (pBR322), da decomposição de 5-HPMU na presença de Cu2+. A geração de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl foi demonstrada por meio do monitoramento da emissão de luz monomolecular de O2 (1Δg) na região do infravermelho próximo (IR-próximo, λ = 1270 nm) e bimolecular na região do visível (λ = 634 e 703 nm). A aquisição do espectro de emissão de O2 (1Δg) forneceu evidências inequívocas da geração desta espécie reativa na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl. Além disto, a formação de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Fe2+, Cu2+ ou HOCl foi demonstrada através da captação química de O2 (1Δg) utilizando 9,10- divinilsulfonatoantraceno (AVS) e detecção por HPLC/MS/MS do endoperóxido (AVSO2) formado. A detecção por HPLC/MS/MS dos produtos de decomposição de 5-HPMU, 5- (hidroximetil)uracila (5-HMU) e 5-formiluracila (5-FoU), reforçaram a hipótese de geração de O2 (1Δg) pelo mecanismo de Russell. A análise dos resultados da incubação de pBR322, 5-HPMU e crescente concentração de Cu2+ mostraram o aumento da forma circular aberta (OC), indicando a formação de quebra de fita simples do DNA, provavelmente proveniente da presença dos radicais peroxila e alcoxila de 5-HPMU. Já a utilização das enzimas de reparo FPG e NTH na incubação de pBR322, 5-HPMU e Cu2+ forneceu evidências da formação preferencial de purinas oxidadas, especialmente de 2’-desoxiguanosina (dGuo). O aumento significativo da forma OC na presença de FPG indicou a formação de 8-oxo-2’-desoxiguanosina, resultante da oxidação da dGuo por O2 (1Δg) e/ou pelos radicais derivados de 5-HPMU. Podemos concluir que 5-HPMU pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) . Além disto, a presença de 5-HPMU pode levar a propagação dos danos oxidativos no DNA, pois sua decomposição pode gerar radicais peroxila e alcoxila / Oxidation of DNA by singlet molecular oxygen O2 (1Δg) can be involved in the development of mutations and diseases. In vivo, O2 (1Δg) can be generated by photosensitization reaction, H2O2 and HOCl reaction and decomposition of organic hydroperoxides with α-hydrogen (α-ROOH) in the presence of metal ions (Fe2+, Cu2+) or HOCl. The α-ROOH decomposition, such as lipid or protein hydroperoxides in the presence of metal ions or HOCl can generate O2 (1Δg) by Russell mechanism. In this mechanism, the self-reaction of peroxyl radicals generates a linear tetraoxide intermediate that decomposes to O2 (1Δg) , an alcohol and an aldehyde. Therefore, the purpose of this work is to investigate if O2 (1Δg) can be generated by α-thymine hydroperoxide, 5- (hydroperoxymethyl)uracil (5-HPMU) in the presence of Ce4+, Fe2+, Cu2+ or HOCl. Another purpose is to study base modification and strand breaks formation in plasmid DNA (pBR322) by 5-HPMU decomposition in the presence of Cu2+. The generation of O2 (1Δg) in the reaction of 5- HPMU and Ce4+ or HOCl was monitored by monomol light emission in the near-infrared region (NIR, λ = 1270 nm) and dimol light emission in the visible region (λ = 634 e 703 nm). The generation of O2 (1Δg) during the reaction of 5-HPMU and Ce4+ or HOCl was confirmed by acquisition of the light emission spectrum in the NIR. Furthermore, the generation of O2 (1Δg) produced by 5-HPMU and Fe2+, Cu2+ or HOCl was also confirmed by chemical trapping using anthracene-9,10-divinylsulfonate (AVS) and HPLC/MS/MS detection of the corresponding endoperoxide (AVSO2). The detection by HPLC/MS/MS of 5-(hydroxymethyl)uracil (5-HMU) and 5-formyluracil (5-FoU), two 5-HPMU decomposition products, support the Russell mechanism. Plasmid results from pBR322, 5-HPMU and Cu2+ reaction showed formation of DNA open circular form (OC), probably produced by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. Additionally, the reaction of pBR322, 5-HPMU and Cu2+ following by Fpg and NTH enzyme treatment demonstrated evidences of purine modification, especially 2’-deoxyguanosine (dGuo). The use of FPG enzyme indicated the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, a dGuo oxidation product formed by O2 (1Δg) and/or 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. We can conclude that 5-HPMU can be a biological source of O2 (1Δg)] and 5-HPMU decomposition can lead to an enhancing of DNA oxidative damage by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals formation

O estudo do processo da peroxidação de lipídios tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido à implicação dos hidroperóxidos de lipídios (LOOH) em diversos processos patológicos. A decomposição destes LOOH é capaz de gerar subprodutos capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. No presente trabalho, utilizando hidroperóxidos de ácido linoléico isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 (LA18O18OH), fomos capazes de demonstrar que estas moléculas gerararam oxigênio singlete marcado [18(1O2)] em células em cultura. A detecção de tal espécie foi possível através da utilização de uma nova metodologia utilizando um derivado antracenico. Para este propósito foi utilizado o derivado de antraceno 3,3\'-(9,10-antracenodiil) bisacrilato (DADB), cujo produto especifico da reação com o 1O2 (o endoperóxido do DADB DADBO2) do pode ser facilmente detectado por HPLC-MS/MS. De forma a expandir a compreensão dos efeitos tóxicos desses LOOH, investigamos o efeito destes compostos gerados intracelularmente. Para tal, foi utilizado o Rosa bengala (RB), um fotosensibilizador que tem afinidade por espaços apolares como membranas e lisossomos. A fotosenssibilização deste composto foi capaz de induzir a morte celular, e esta morte estaria relacionada a uma maior formação de 1O2 e a um maior acumulo de peróxidos. Nestes estudos foi possível demonstrar que carotenóides e sistemas antioxidantes dependentes de glutationa foram capazes de proteger contra os efeitos tóxicos da fotosensibilização na presença de RB. Adicionalmente foram avaliados os efeitos da hemoglobina (Hb) e do hidroperóxido do ácido linoléico (LAOOH) em uma série de parâmetros toxicológicos, como citotoxicidade, estado redox, a peroxidação lipídica e dano ao DNA. Nós demonstramos que a pré-incubação das células com Hb e sua posterior exposição à LAOOH (Hb + LAOOH) levou a um aumento na morte celular, a oxidação do DCFH, formação de malonaldeído e fragmentação do DNA e que esses efeitos estavam relacionados com o grupo peróxido e ao heme presentes na Hb. Foi demonstrado que as células incubadas com LAOOH e Hb apresentaram um nível maior das lesões de DNA; 8-oxo-7,8-diidro-2 \'desoxiguanosina e 1,N2-etheno-2\'-desoxiguanosina. Além disso, as incubações com Hb levaram a um aumento nos níveis de ferro intracelular, e este alto nível de ferro correlacionada com a oxidação do DNA, avaliadas através da medida de sitios EndoIII e Fpg sensíveis. Nossos resultados comprovam que os LAOOHs apresentaram efeito citotóxico e genotóxico, mesmo em concentrações muito baixas, podendo contribuir para o desencadeamento de processos patologicos como o câncer e doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. / The study of the process of lipid peroxidation has increased in recent years, mainly due to the involvement of lipid hydroperoxide (LOOH) in a series of pathological processes. The decomposition of LOOH is able to generate products that can promote damage to biomolecules, including proteins and DNA. In the present work, using linoleic acid hydroperoxide isotopically labeled with 18O2 (LA18O18OH), we demonstrate that these molecules were able to generate labeled singlet oxygen [18(1O2)] in cultured cells. The detection of such species was possible using a new methodology using an anthracene derivative .For this purpose we used the anthracene derivative of 3,3\'-(9,10-antracendiil) bisacrilate (DADB), whose specific reaction product with 1O2 (DADB endoperoxide DADBO2) can be easily detected by HPLC-MS/MS. In order to expand the understanding of the toxic effects of LOOH, we investigated the effect of these compounds generated intracellularly. For this porpoise, we used Rose Bengal (RB), a photosensitizer that has affinity for apolar spaces such as membranes and lysosomes. The photosensitization of this compound was able to induce cell death, and this death was related to increased formation of 1O2 and a higher accumulation of peroxides. In these studies we have shown that carotenoids and glutathione-dependent antioxidant systems were capable of protecting against the toxic effects of photosensitization in the presence of RB. Additionally, we evaluated the effects of hemoglobin (Hb) and linoleic acid hydroperoxide (LAOOH) in a series of toxicological endpoints such as cytotoxicity, redox status, lipid peroxidation and DNA damage. We demonstrated that preincubation of cells with Hb and its subsequent exposure to LAOOH (Hb + LAOOH) led to an increase in cell death, DCFH oxidation, formation of malonaldehyde and DNA fragmentation, and that these effects were related to the peroxide and the heme group. It was demonstrated that cells incubated with LAOOH and Hb showed a higher level of the DNA lesions, 8-oxo-7,8-dihydro-2\'deoxyguanosine and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine. Furthermore, incubations with Hb led to an increase in intracellular iron levels, and this high level of iron correlates with the oxidation of DNA, measured as EndoIII and Fpg-sensitive sites. Our results show that the LOOHs showed cytotoxic and genotoxic, even at very low concentrations and may contribute to the onset of chronic malignancies like cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases.

Neste trabalho avaliamos a formação de oxigênio singlete in vitro em fagócitos, (células mononucleares e neutrófilos) isolados de sangue periférico humano, e eosinófilos, de lavado bronco alveolar de camundongos balb/c, ativados por estímulo partículado: zimosan opsonizado contendo o 9,10difenilantraceno (DPA) adsorvido como sonda captadora de 1O2. Por este método, a formação do 1O2 pode ser verificada pela formação do 9,10-difenilantraceno endoperóxido (DPAO2), que é detectado por HPLC. Observamos, que os fagócitos formam 1O2 e que esta formação parece ocorrer de forma diferenciada para os dois tipos celulares (neutrófilos e células mononucleares). Visando ampliar os estudos anteriores sobre o papel da melatonina (MLT) no processo inflamatório, foi testado seu efeito em fagócitos e a relação na produção de 1O2 destas células. Observamos que MLT inibe a formação de 1O2 totalmente no caso de neutrófilos e parcialmente no caso de células mononucleares e eosinófilos. Paralelamente, foi desenvolvida a síntese de um novo captador químico de 1O2, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE), cuja finalidade principal é o acúmulo no interior da célula, depois de sofrer hidrólise enzimática. Esta sonda, terá facil acesso ao interior das células em sua forma ester. Este novo captador de 1O2 foi testado em células mononucleares e neutrófilos estimulados de formas diferentes: via receptor independente e dependente. Os resultados demonstraram produção equivalente de 1O2 nestes fagócitos. / In this study, we evaluated the singlet oxygen (1O2) formation in vitro from phagocytes (neutrophils and mononuclear cells) isolated from human blood cells and eosinophils isolated from bronchoalveolar lavage fluid of mice balb/c activated, by opsonized zymosan. To determine whether singlet oxygen is produced by phagocytes, zymosan particles were coated with a specific chemical trap for 1O2, 9,10-diphenylanthracene (DPA). The production of 1O2 was followed using HPLC, to measure its product, 9,10-diphenylanthracene endoperoxide (DPAO2). We also noticed that the 1O2 production occurs at different levels of for two cell types, neutrophils and mononuclear cells. In order to broaden previous studies on the role of melatonin (MLT) in inflammatory processes, its effect was tested in phagocytes was tested in relation to 1O2 formation by these cells. We observed that MLT inhibits the 1O2 formation totallymt neutrophils and partiallym mononuclear cells and eosinophils. At the some time, it was also developed the synthesis of a new probe for 1O2, the 9,10-anthracene-bis-3-ethyl-propionate (ABEP), with the purpose to accumulate inside the cells, after its enzymatic hydrolysis. This probe presents easy acess to the inferior of the cells in its ester form. This new probe for trapping 1O2 was tested in mononuclear cells and neutrophils stimulated in two ways: via independent and dependent receptor. The results showed equivalent production of 1O2 for both cell types.

A oxidação de membranas lipídicas pode ser benéfica (p.ex. sinalização celular) ou prejudicial, sendo a permeabilização de membranas uma de suas consequências citotóxicas. A permeabilização fotoinduzida de membranas é parte essencial do mecanismo da terapia fotodinâmica (PDT), uma modalidade clínica em que fotossensibilizadores, luz e oxigênio são combinados para oxidar biomoléculas e consequentemente danificar células indesejadas. Neste trabalho, buscamos entender molecularmente quais fatores levam à permeabilização fotoinduzida de membranas. Enfatizamos os papéis do oxigênio, do status da membrana e de reações específicas do fotossensibilizador em contato com a membrana. Simulações de dinâmica molecular foram usadas para obter a distribuição de oxigênio em membranas em função da temperatura nas fases fluida ou gel. Procedimentos específicos de análise de cinéticas de luminescência de oxigênio singlete foram desenvolvidos para calcular tempos de vida de estado excitado triplete compatíveis com as variações da distribuição de oxigênio em membranas. Caracterizamos um derivado fluorogênico do α-tocoferol como uma sonda para oxigênio singlete em experimentos com lipossomos, possibilitando comparar qualitativamente os níveis de oxigênio singlete atingindo a membrana quando produzido por fotossensibilizadores hidrossolúveis ou lipossolúveis. Experimentos em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) nos permitiram comparar a ativação da sonda com o aumento de área superficial da membrana, e estimar a constante de velocidade da reação do oxigênio singlete com lipídeos insaturados como 6 x 104 M-1 s-1. Estreitando nosso foco para a permeabilização fotoinduzida de membranas, inicialmente caracterizamos quatro fotossensibilizadores fenotiazínicos em relação a suas interações com membranas e suas capacidades de promover o vazamento de uma sonda fluorescente. Fotossensibilizadores que se particionaram mais em membranas (e não os geradores de oxigênio singlete mais eficientes) danificaram a membrana de lipossomos mais eficientemente. A ligação à membrana também afetou as vias de decaimento dos estados excitados triplete. Com esse estudo, selecionamos o fotossensibilizador hidrofílico azul de metileno (MB) e o fotossensibilizador mais hidrofóbico DO15 para as investigações subsequentes. Os efeitos de ambos os fotossensibilizadores em GUVs foram caracterizados e observamos que as cinéticas de permeabilização indicaram diferentes taxas de produção de lipídeos formadores de poros para MB e DO15, o que deve depender de interações específicas com a membrana. Para melhor compreender o papel de interações fotossensibilizador/membrana, caracterizamos a oxidação de lipídeos por ambos os fotossensibilizadores, em uma condição em que DO15 permeabilizava membranas 70 vezes mais eficientemente que MB. Observamos principalmente a formação de hidroperóxidos lipídicos para MB, enquanto que para DO15, além desses mesmos produtos, observamos a formação de álcoois, cetonas e aldeídos fosfolipídicos de cadeia truncada, esses últimos tendo sido relacionados a condições em que se observou a permeabilização de membranas. Embora já fosse sabido que aldeídos fosfolipídicos aumentam a permeabilidade da membrana, esse fenômeno nunca havia sido demonstrado para a formação de aldeídos in situ. A fotooxidação lipídica foi acompanhada por aumento do fotobranqueamento de DO15 e pela formação de radicais lipídicos oxigenados, indicando a ocorrência de reações diretas entre lipídeos e fotossensibilizadores. O mapeamento dos fatores que levam à permeabilização fotoinduzida em membranas, focando em reações e interações moleculares, é o maior produto desse trabalho / Oxidation of lipid membranes can be beneficial (e.g., cell signaling) or detrimental, with membrane permeabilization representing one of its cytotoxic outcomes. Photoinduced membrane permeabilization is key to the mechanism of photodynamic therapy (PDT), a clinical modality in which photosensitizers, light and oxygen are combined to oxidize biomolecules and consequently damage diseased cells. In this work, we aimed to understand at the molecular level which factors lead to photoinduced membrane permeabilization. We emphasized the roles of oxygen, membrane status and specific reactions of the photosensitizer in contact with the membrane. Molecular dynamics simulations were used to assess oxygen distribution in membranes as a function of temperature within membranes in gel or liquid phases. Special fitting procedures of singlet oxygen luminescence kinetics were devised to allow the calculation of triplet excited state lifetimes compatible with variable oxygen distributions in membranes. We characterized a fluorogenic α-tocopherol probe as a singlet oxygen trapping molecule in experiments with liposomes, and were able to qualitatively compare the amount of singlet oxygen molecules reaching the membrane after being generated by water soluble or membrane bound photosensitizers. Experiments performed in giant unilamellar vesicles (GUVs) allowed us to compare the activation of the probe with the observed membrane surface area increase and estimate the reaction rate of singlet oxygen with unsaturated lipids to be 6 x 104 M-1 s-1. We then narrowed our focus to photoinduced membrane permeabilization, initially characterizing four phenothiazinium photosensitizers with respect to their interactions with membranes and their capability to promote leakage of a fluorescent probe. Photosensitizers that bound to membranes to a larger extent (and not the most efficient singlet oxygen generators) were the most efficient ones to damage liposomal membranes. Membrane binding also affected triplet excited state deactivation pathways. From this study, we selected the hydrophilic photosensitizer methylene blue (MB) and the more hydrophobic photosensitizer DO15 for subsequent investigations. We characterized the effects of both photosensitizers in GUVs and observed that the kinetics of membrane permeabilization implied different rates of generation of pore-forming lipids for MB and DO15, which should depend on specific interactions with membranes. To further understand the role of photosensitizer/membrane interactions, we characterized the oxidized lipids formed by both photosensitizers in a condition in which the membrane permeabilization efficiency of DO15 was 70 times higher than that of MB. We observed mainly formation of lipid hydroperoxides by MB, while DO15 not only led to these same products, but also to alcohols, ketones and phospholipid truncated aldehydes, the latter being related to conditions in which membrane permeabilization was observed. Although aldehydes were already known to increase membrane permeability, this phenomenon had never before been demonstrated for aldehyde formation in situ. Lipid photooxidation was accompanied by increased photobleaching of DO15 and by formation of lipid oxygenated radicals, indicating the occurrence of direct reactions between lipids and photosensitizers. A roadmap of the factors leading to photoinduced membrane permeabilization focusing on molecular interactions and reactions is the major achievement of this work.

Evidências apontam para o envolvimento da peroxidação lipídica em diversas patologias. Os hidroperóxidos de lipídios (LOOH) são os produtos primários da peroxidação lipídica e sua decomposição resulta em produtos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila. Esses radicais desempenham papel importante na propagação da peroxidação lipídica e também podem gerar oxigênio molecular singlete (1O2) por meio da combinação de dois radicais peroxila. Neste trabalho investigamos a possibilidade dos LOOH, em particular dos hidroperóxidos de ácido linoléico (LAOOH), de servirem como fonte 1O2 na presença de oxidantes de relevância biológica como metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. A formação de 1O2 foi claramente demonstrada na reação de LAOOH com esses oxidantes pelas detecções (i) da emissão bimolecular na região espectral do vermelho (λ>570 nm), (ii) da emissão monomolecular no infravermelho-próximo (λ=1270 nm), (iii) do espectro de emissão no infravermelho, e (iv) da intensificação e supressão da luminescência na presença de D2O e azida, respectivamente. Além disso, os mecanismos de reação foram estudados utilizando LAOOH marcados com oxigênio-18 (LA18O18OH) e captadores químicos específicos para 1O2 aliada à tecnica de detecção por HPLC acoplada à espectrometria de massa. Os resultados mostraram a formação de 1O2 marcado [18(1O2) ] na reação de LA18O18OH com os três oxidantes, revelando que os átomos de oxigênio do 1O2 são derivados do hidroperóxido. Em conjunto, as evidências obtidas levam à conclusão de que os LOOH podem servir como fontes potenciais de 1O2 em sistemas biológicos em situações onde haja a coexistência de LOOH e metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. / Evidences point to the involvement of lipid peroxidation in several diseases. Lipid hydroperoxides (LOOH) are the primary products of lipid peroxidation and their decomposition generates more reactive and toxic compounds, such as peroxyl radicals. These radicals play an important role in the propagation of lipid peroxidation and may also generate singlet molecular oxygen (1O2) by the combination of two peroxyl radicals. In this study we have investigated the possibility of LOOH, in particular linoleic acid hydroperoxide (LAOOH), to be a source of 1O2 in the presence of biologically relevant oxidants such as, metal ions, peroxynitrite or hypochlorous acid. The formation of 1O2 was clearly demonstrated in the reaction of LAOOH with all the three tested oxidants by detecting: (i) the dimol light emission in the red spectral region (λ>570 nm), (ii) the monomol light emission in the near-infrared region (λ=1270 nm), (iii) the infrared light emission spectrum, and (iv) the enhancing effect of deuterium oxide and the quenching effect of azide on light emission. Furthermore, the mechanism was studied using LAOOH labeled with 18-oxygen isotope (LA18O18OH) and specific 1O2 chemical traps in combination with HPLC coupled to mass spectrometry detection. The results have showed the formation of 18-oxygen labeled 1O2 [18(1O2) ] in the reaction of LA18O18OH with the three oxidants, indicating that oxygen atoms in 1O2 are derived from the hydroperoxide. Altogether, the obtained evidences lead to the conclusion that LOOH may serve as a potential source of 1O2 in biological systems, in situations where LOOH can interact with metals, peroxynitrite or hypochlorous acid.

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

As propriedades fotofísicas e fotoquímicas de cristal violeta (CV) foram investigadas em soluções isotrópicas e verificou-se que solventes com constante dielétrica pequena favorecem a formação do par iônico, já o aumento na viscosidade do meio restringe a movimentação rotacional dos anéis aromáticos, resultando em um aumento no tempo de vida de fluorescência e, portanto no rendimento quântico de fluorescência (Φf) (Oliveira 2002). Os experimentos com CV foram conduzidos em micelas reversas do tensoativo aniônico bis-2-etilhexil sulfoccinato de sódio (AOT) em isooctano. A localização interfacial do CV nas micelas reversas de AOT em valores da razão molar entre água e surfactante (W0)pequenos e grandes foram encontrados através da técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de próton e de carbono 13. Utilizando-se espectroscopia UV-Vis identificou-se que pares iônicos de contato estão presentes a valores pequenos de W0 e com o aumento do W0 pares iônicos separados por solventes são as espécies que predominam em solução. A comparação da eficiência de fotodegradação de CV em micelas reversas de AOT em função do W0 indicou que a fotoreatividade é maior em baixos valores de W0 . Este efeito deve estar relacionado à restrição da movimentação dos anéis aromáticos de CV devido ao ambiente restrito no qual este se localiza na micela reversa de OAT a W0 pequenos. A formação de intermediários reativos foi verificada através de Fotólise de Relâmpago a Laser e Emissão no infra-vermelho próximo, indicando a presença de espécies triplete, radical e oxigênio singlete com valor de rendimento quântico menor que 1%. Os produtos de fotólise foram identificados por técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Na presença de oxigênio, houve maior formação de cetona de Michler. Com baixa concentração de oxigênio, o produto observável foi leuco-CV. Destes estudos propomos o mecanismo de CV neste meio. Após os estudos com micelas reversas, células cancerosas HeLa foram empregadas para comparar fotoatividade do CV com o azul de metileno (MB). As proporções de CV e MB dentro das células são altas, incorporando 70% e 80% da concentração da solução de incubação, respectivamente. Com o aumento da concentração de MB, um favorecimento da formação de dímero foi identificada. Já CV não sofre agregação nas condições estudadas. Nenhum dos fotossensibilizadores estudados tem um efeito danoso sobre as células HeLa em concentrações abaixo de 10µM. Após irradiação, MB causou uma diminuição de cerca de duas vezes maior na taxa de sobrevivência celular comparado com CV. A formação de formação de oxigênio singlete após incorporação dos fotossensibilizadores foi investigada. Há formação de oxigênio singlete em células incubadas com MB, já com CV a geração de oxigênio singlete é pouco significativa sugerindo um mecanismo radicalar. O processo de morte celular foi estudado por citometria de fluxo e verificou-se que MB induz apoptose depois da irradiação em células HeLa. A absorção de luz por ambos fotossensibilizadores é similar, o que indica que a diminuição na sobrevivência não se deve à diferença de absorção luminosa. As diferenças de sobrevivência observadas com células incubadas com CV e MB e irradiadas foram relacionadas às diferenças das propriedades fotoquímicas destes fotossensibilizadores. A localização celular de CV e MB em células foram caracterizadas por microscopia de fluorescência. Verificou-se que ambos localizam-se em mitocôndrias. O aumento na concentração de CV não alterou o seu perfil de localização. Já para MB ao aumentar a concentração de MB, observa-se que o mesmo localiza-se além das mitocôndrias, em lisossomos. A comparação das propriedades fotoquímicas e de localização foram consideradas para explicar as diferenças de atividade fotodinâmica do CV e do MB em células HeLa / The photophysical and photochemical properties of crystal violet (CV) were investigated in isotropic solutions and it was found that solvents with small dielectric constants favor the formation of the ion pair and that the increase in viscosity of the medium restricts the rotational movement of the aromatic rings, resulting in an increase in fluorescent lifetime and therefore in the fluorescence quantum yield (Φf) (Oliveira 2002). CV experiments were conducted in reverse micelles of the anionic tensoactive sodium bis-2-ethylhexyl-sulfosuccinate (AOT) in isooctane. The interfacial localization of CV in the AOT reverse micelles at low and high values of molar ratio between water and surfactant (W0 was found through the proton and carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance techniques (NMR). Using UV-Vis spectroscopy, it was identified that contact ion pairs are present in low W0 values and with the increase in the W0 solvent separated ion pairs are the species that predominate in solution. The comparison of the photobleaching efficiency of CV in AOT reverse micelles as a function of W0indicated that the photoreactivity is high with low W0 values. This effect must be related to the restrict environment in which CV is located. The reactive intermediate formation was found through the Laser Flash Photolysis and Near Infra-Red Emission, indicating the presence of triplet, radical and singlet oxygen species with a yield quantum of less than 1%. The photolysis products were identified through the chromatographic and spectroscopic techniques. In the oxygen presence, there was high Michler ketone formation. With the low oxygen concentration, the observable product was leuco-CV. With these studies we hypothesized a mechanism of CV in these proposed media. After the reverse micelles studies, the HeLa cancerous cells were used, in order to compare the CV and methylene blue (MB) photoactivity. The CV and MB proportion inside the cell was high, reaching 70% and 80% of concentration of the incubation solution, respectively. With the increase of MB concentration, a favoring of dimmer formation was identified. CV does not suffer aggregation in the studied conditions. None of the studied photosensitizers has a damaging effect upon the HeLa cells in concentrations below 10µM. After irradiation, MB caused a decrease about twice higher in the cellular survival rate compared to CV. The singlet oxygen formation after the photosensitizer incorporation was investigated. There is a singlet oxygen formation in the cells incubated with MB, though with the CV the singlet oxygen generation is significantly low suggesting the radicalar mechanism. The cellular death process was studied by Fluorescence Activated Cell Sorting and MB-induced apoptosis was found after MB irradiation in HeLa cells. The light absorption by both photosensitizers is similar, which means that the survival decrease is not because of the light absorption difference. The survival differences observed with the cells incubated with CV and MB and irradiated were related to the differences in the photosensitizer photochemical properties. The cellular location of the CV and MB in cells were characterized by fluorescence microscopy. Both photosensitizers are located in mitochondrias. An increase in the CV concentration does not alter its local profile. However, with an increase in the MB concentration, MB was located not only in mitochondrias but also in lysosomes. The comparison of the photochemical and localization properties was considered in order to explain the differences in the photodynamic activity of CV and MB in HeLa cells

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

Oxigênio molecular singlete [O2(1Δg)], uma espécie excitada, desempenha um papel importante em sistemas químicos e biológicos. É um poderoso eletrófilo, que reage com moléculas ricas em elétrons através de cicloadições [2+2], [4+2] e reações tipo ene. Ácidos graxos poliinsaturados, proteínas e DNA são alvos vulneráveis para o ataque de O2(1Δg). Os endoperóxidos de derivados de naftaleno são muito úteis e versáteis como fontes limpas de O2(1Δg), uma vez que são quase quimicamente inertes. Por outro lado, o desenvolvimento de novas fontes de O2(1Δg) ainda é uma tarefa desafiadora. Os derivados de naftaleno são capazes de armazenar O2(1Δg) por reação de cicloadiação [4+2] e liberá-lo em temperaturas amenas, o que os torna muito adequados para uso em estudos biológicos. A síntese destes compostos está baseada em modificações nos substituintes ligados nas posições 1 e 4 da estrutura do naftaleno. Na primeira parte deste trabalho, a síntese de três endoperóxidos derivados do naftaleno solúveis em água foi realizada. DHPNO2 e NDPO2 foram preparados de acordo com métodos similares descritos na literatura. A síntese de um novo endoperóxido dicatiônico derivado do naftaleno (NBTEO2) foi desenvolvida, contendo dois grupos de cloreto de amônio quaternário nas posições 1,4 do anel aromático. O intermediário chave na síntese dos três endoperóxidos é o BBMN, o qual foi preparado a partir da bromação radicalar do 1,4-dimetilnaftaleno. Nossos resultados têm indicado que este composto dicatiônico pode ser uma fonte química de O2(1Δg) em potencial, e pode ser explorado em estudos com mitocôndrias, onde o papel biológico de O2(1Δg) é investigado. A segunda parte deste trabalho foi dedicada a investigar a geração de O2(1Δg) através das reações entre hidroperóxidos de lipídeos (ácido oleico, linoleico e colesterol), hidroperóxidos orgânicos (cumeno e t-butila), bem como peróxido de hidrogênio com NO2+, utilizando o composto NO2BF4. Evidências da geração de O2(1Δg) foram obtidas através de medidas de emissão de luz na região do infravermelho próximo, no comprimento de onda de 1270 nm. Além disso, a prova inequívoca da presença de O2(1Δg) foi demonstrada através da caracterização espectral direta da emissão de luz no infravermelho próximo. O uso de azida de sódio como captador físico de O2(1Δg), juntamente com as medidas da quimiluminescência, contribuíram para identificar a geração desta espécie na reação entre hidroperóxidos de lipídeos e NO2BF4. Embora seja uma abordagem química, nossos resultados adicionaram informações importantes sobre a peroxidação lipídica, principalmente quando espécies reativas de nitrogênio estão envolvidas. O O2(1Δg) poderia ser gerado como um subproduto da peroxidação lipídica em condições onde espécies reativas de nitrogênio interagem com hidroperóxidos lipídicos. Isto pode contribuir para um melhor entendimento deste evento complexo com implicações fisiológicas ou fisiopatológicas. / Singlet molecular oxygen [O2(1Δg)], an excited species, plays an important role in chemical and biological systems. It is a powerfull electrophile, reacting with electron rich molecules through [2+2] cycloadditions, [4+2] cycloadditions and ene reactions. Polyunsaturated fatty acids, proteins and DNA are vulnerable targets for O2(1Δg) reaction. Naphthalene derivatives endoperoxides are very useful and versatile as a clean source of O2(1Δg), once they are almost chemically inert. On the other hand, developing new sources of O2(1Δg) are still a challenging task. Naphthalene derivatives are able to trap O2(1Δg) by [4+2] cycloaddition and release it in mild temperatures, which make them very suitable for biological studies. The synthesis of these compounds is based on modifications in substituents bonded in 1,4 positions of nafhthalene backbone. In the first part of present work, the synthesis of three water soluble naphthalene derivatives endoperoxides was performed. DHPNO2, NDPO2 were prepared according to similar methods described in the literature. A new di-cationic naphthalene derivative endoperoxide (NBTEO2) synthesis was developed, containing two quaternary ammonium chloride groups in 1,4-positions of aromatic ring. The key intermediate: for the synthesis of the three endoperoxides is the compound BBMN, which was prepared from radicalar bromination of 1,4-dimethylnaphthalene. Our results have indicated that this di-cationic compound can be a potential chemical source of O2(1Δg) and may be explored in mitochondrial studies where O2(1Δg) biological role is investigated. The second part of this work is dedicated to the investigation of generation of O2(1Δg) through reaction of lipid hydroperoxides (oleic acid, linoleic acids and cholesterol), organic hydroperoxides (cumene and t-butyl), as well as hydrogen peroxide with NO2+, using the compound NO2BF4. Evidences of generation of O2(1Δg) were obtained recording the monomol light emission measurement in near infrared region at wavelength of 1270 nm. Moreover, the proof of the presence of O2(1Δg) was unequivocally demonstrated by the direct spectral characterization of near-infrared light emission. The use of sodium azide as a physical quencher of O2(1Δg), associated to chemiluminescence measurements, contributed to identify the generation of this species in the reaction of lipid hydroperoxides and NO2BF4. Although, it is a chemical approach, our results add important information about lipid peroxidation, mainly when reactive species of nitrogen are involved. O2(1Δg) might be generate as a byproduct of lipid peroxidation, in conditions where reactive nitrogen species interact with lipid hydroperoxides. This might contribute to a better understand of this complex event and physiological or physiopathological implications

A oxidação do DNA por espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio molecular singlete [O2 (1Δg)] , pode estar relacionada ao aparecimento de mutações e ao desenvolvimento de doenças. O O2 (1Δg) pode ser gerado biologicamente por reação de fotossensibilização, pela reação de H2O2 e HOCl e pela decomposição de peróxidos orgânicos contendo hidrogênio alfa (α-ROOH), na presença de metais de transição (Fe2+, Cu2+) ou HOCl. A decomposição de α-ROOH, como hidroperóxidos de lipídeos ou proteínas na presença de metais de transição, pode gerar O2 (1Δg) via mecanismo de Russell. Neste mecanismo, a oxidação de α -ROOH gera radicais peroxila, que podem reagir entre si, formando um intermediário tetraóxido linear. Este intermediário tetraóxido linear pode decompor através de um mecanismo cíclico e produzir O2 (1Δg), um álcool e um composto carbonílico. Como a decomposição de α-ROOH pelo mecanismo de Russell pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) decidimos investigar se o α-hidroperóxido de timina, 5-(hidroperoximetil)uracil (5-HMPU), poderia gerar esta espécie reativa na presença de metais (Ce4+, Fe2+, Cu2+) e HOCl. Outro objetivo foi avaliar os efeitos oxidativos, em DNA plasmidial (pBR322), da decomposição de 5-HPMU na presença de Cu2+. A geração de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl foi demonstrada por meio do monitoramento da emissão de luz monomolecular de O2 (1Δg) na região do infravermelho próximo (IR-próximo, λ = 1270 nm) e bimolecular na região do visível (λ = 634 e 703 nm). A aquisição do espectro de emissão de O2 (1Δg) forneceu evidências inequívocas da geração desta espécie reativa na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl. Além disto, a formação de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Fe2+, Cu2+ ou HOCl foi demonstrada através da captação química de O2 (1Δg) utilizando 9,10- divinilsulfonatoantraceno (AVS) e detecção por HPLC/MS/MS do endoperóxido (AVSO2) formado. A detecção por HPLC/MS/MS dos produtos de decomposição de 5-HPMU, 5- (hidroximetil)uracila (5-HMU) e 5-formiluracila (5-FoU), reforçaram a hipótese de geração de O2 (1Δg) pelo mecanismo de Russell. A análise dos resultados da incubação de pBR322, 5-HPMU e crescente concentração de Cu2+ mostraram o aumento da forma circular aberta (OC), indicando a formação de quebra de fita simples do DNA, provavelmente proveniente da presença dos radicais peroxila e alcoxila de 5-HPMU. Já a utilização das enzimas de reparo FPG e NTH na incubação de pBR322, 5-HPMU e Cu2+ forneceu evidências da formação preferencial de purinas oxidadas, especialmente de 2’-desoxiguanosina (dGuo). O aumento significativo da forma OC na presença de FPG indicou a formação de 8-oxo-2’-desoxiguanosina, resultante da oxidação da dGuo por O2 (1Δg) e/ou pelos radicais derivados de 5-HPMU. Podemos concluir que 5-HPMU pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) . Além disto, a presença de 5-HPMU pode levar a propagação dos danos oxidativos no DNA, pois sua decomposição pode gerar radicais peroxila e alcoxila / Oxidation of DNA by singlet molecular oxygen O2 (1Δg) can be involved in the development of mutations and diseases. In vivo, O2 (1Δg) can be generated by photosensitization reaction, H2O2 and HOCl reaction and decomposition of organic hydroperoxides with α-hydrogen (α-ROOH) in the presence of metal ions (Fe2+, Cu2+) or HOCl. The α-ROOH decomposition, such as lipid or protein hydroperoxides in the presence of metal ions or HOCl can generate O2 (1Δg) by Russell mechanism. In this mechanism, the self-reaction of peroxyl radicals generates a linear tetraoxide intermediate that decomposes to O2 (1Δg) , an alcohol and an aldehyde. Therefore, the purpose of this work is to investigate if O2 (1Δg) can be generated by α-thymine hydroperoxide, 5- (hydroperoxymethyl)uracil (5-HPMU) in the presence of Ce4+, Fe2+, Cu2+ or HOCl. Another purpose is to study base modification and strand breaks formation in plasmid DNA (pBR322) by 5-HPMU decomposition in the presence of Cu2+. The generation of O2 (1Δg) in the reaction of 5- HPMU and Ce4+ or HOCl was monitored by monomol light emission in the near-infrared region (NIR, λ = 1270 nm) and dimol light emission in the visible region (λ = 634 e 703 nm). The generation of O2 (1Δg) during the reaction of 5-HPMU and Ce4+ or HOCl was confirmed by acquisition of the light emission spectrum in the NIR. Furthermore, the generation of O2 (1Δg) produced by 5-HPMU and Fe2+, Cu2+ or HOCl was also confirmed by chemical trapping using anthracene-9,10-divinylsulfonate (AVS) and HPLC/MS/MS detection of the corresponding endoperoxide (AVSO2). The detection by HPLC/MS/MS of 5-(hydroxymethyl)uracil (5-HMU) and 5-formyluracil (5-FoU), two 5-HPMU decomposition products, support the Russell mechanism. Plasmid results from pBR322, 5-HPMU and Cu2+ reaction showed formation of DNA open circular form (OC), probably produced by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. Additionally, the reaction of pBR322, 5-HPMU and Cu2+ following by Fpg and NTH enzyme treatment demonstrated evidences of purine modification, especially 2’-deoxyguanosine (dGuo). The use of FPG enzyme indicated the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, a dGuo oxidation product formed by O2 (1Δg) and/or 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. We can conclude that 5-HPMU can be a biological source of O2 (1Δg)] and 5-HPMU decomposition can lead to an enhancing of DNA oxidative damage by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals formation