Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AcariziaES_DISSERT_com restrincao.pdf: 1340411 bytes, checksum: 77725d07cd1be6709e0cbb731be2b1e1 (MD5) Previous issue date: 2010-10-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Reactive oxygen species (ROS) are produced by aerobic metabolism and react with biomolecules, such as lipids, proteins and DNA. In high concentration, they lead to oxidative stress. Among ROS, singlet oxygen (1O2) is one of the main ROS involved in oxidative stress and is one of the most reactive forms of molecular oxygen. The exposure of some dyes, such as methylene blue (MB) to light (MB+VL), is able to generate 1O2 and it is the principle involved in photodynamic therapy (PDT). 1O2 e other ROS have caused toxic and carcinogenic effects and have been associated with ageing, neurodegenerative diseases and cancer. Oxidative DNA damage is mainly repaired by base excision repair (BER) pathway. However, recent studies have observed the involvement of nucleotide excision repair (NER) factors in the repair of this type of injury. One of these factors is the Xeroderma Pigmentosum Complementation Group A (XPA) protein, which acts with other proteins in DNA damage recognition and in the recruitment of other repair factors. Moreover, oxidative agents such as 1O2 can induce gene expression. In this context, this study aimed at evaluating the response of XPA-deficient cells after treatment with photosensitized MB. For this purpose, we analyzed the cell viability and occurrence of oxidative DNA damage in cells lines proficient and deficient in XPA after treatment with MB+VL, and evaluated the expression of this enzyme in proficient and complemented cells. Our results indicate an increased resistance to treatment of complemented cells and a higher level of oxidative damage in the deficient cell lines. Furthermore, the treatment was able to modulate the XPA expression up to 24 hours later. These results indicate a direct evidence for the involvement of NER enzymes in the repair of oxidative damage. Besides, a better understanding of the effects of PDT on the induction of gene expression could be provided / Esp?cies reativas de oxig?nio (ERO) s?o produzidas durante o metabolismo aer?bico e s?o capazes de reagir com diversas biomol?culas, como lip?dios, prote?nas e DNA. Dentre as ERO, o oxig?nio singlete (1O2) e conhecido como um dos principais agentes envolvidos no estresse oxidativo. A exposi??o de alguns pigmentos, como o azul de metileno (MB) a luz e capaz de gerar 1O2, sendo essa a base da terapia fotodin?mica (TFD). Quando em excesso, o 1O2 e outras ERRO mostram efeitos t?xicos e carcinog?nicos e est?o relacionados ao envelhecimento e a etiologia de varias doen?as, incluindo artrite, doen?as degenerativas e c?ncer. A principal via de reparo de danos oxidativos ao DNA e a via por excis?o de base (BER). No entanto, estudos recentes tem observado a atua??o de fatores da via de reparo por excisao de nucleotideo (NER) na corre??o desse tipo de les?o. Um dos fatores da via NER e a prote?na Xeroderma Pigmentoso do Grupo de complementa??o A (XPA), que atua em conjunto com outras prote?nas na etapa de localiza??o dos s?tios de danos e de recrutamento de outros fatores de reparo. Ainda, agentes oxidativos como o 1O2 sao capazes de induzir a express?o g?nica. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a resposta de c?lulas deficientes em XPA ao tratamento com MB fotossensibilizado. Para isso, foram analisadas a viabilidade celular e a ocorr?ncia de danos oxidativos em linhagens proficientes e deficientes em XPA, assim como a express?o dessa enzima em c?lulas proficientes e complementadas. Nossos resultados indicam um aumento da resist?ncia ao tratamento em c?lulas complementadas com XPA e um maior n?vel de danos oxidativos em linhagens deficientes nessa enzima. Alem disso, o tratamento foi respons?vel pela modula??o da express?o dessa enzima ate 24h depois. Esses resultados indicam uma evidencia direta da participa??o de enzimas do NER no reparo de danos oxidativos e contribui para um melhor entendimento sobre os efeitos da TFD na indu??o da express?o g?nica

A enzima mieloperoxidase (MPO), presente em leucócitos da linhagem granulocítica e monocítica, tem papel fundamental na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem fortes evidências que alguns produtos gerados a partir de reações catalisadas por mieloperoxidase (MPO) tenham papel na sinalização celular. Dentre estes produtos, chama atenção o oxigênio singlete (1O2). Em fagócitos, esta ERO poderia participar tanto do processo de morte de patógenos, quanto da sinalização de eventos da inflamação. O nosso grupo de pesquisa trabalha com a hipótese de que a localização da MPO, e consequentemente, os sítios de produção de 1O2 definem a função da enzima e do 1O2. O interesse particular no 1O2 deve-se também ao fato de que sua detecção não é trivial e relativamente pouco é conhecido sobre sua produção por sistemas biológicos se comparado a outras EROs. Neste estudo trabalhamos com a questão da localização de MPO em neutrófilos e monócitos humanos e com a detecção de 1O2 através da utilização de sondas específicas. Nos experimentos realizados avaliamos a produção de 1O2 pela utilização da sonda 9,10 difenilantraceno (DPA) e também empregando o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE) como captador de 1O2. Apesar da proposta de uso do DPA revestindo partículas a serem fagocitadas ter sido feita anteriormente (Garcia F., mestrado concluído em 2006) houve dificuldades na utilização desta técnica que foram reconsideradas neste trabalho. Com esta sonda também obtivemos imagens em microscopia confocal, através da fluorescência do DPA e perda desta fluorescência após reação com 1O2. As análises dos resultados com a microscopia confocal em neutrófilos confirmam que 1O2 está sendo realmente formado no fagolissosomo, quando as células são ativadas por partículas opsonizadas. Em monócitos também houve a possibilidade de utilizar DPA como sonda para 1O2. Neste caso observamos um decréscimo mais lento da fluorescência quando comparado com neutrófilos e também um apagamento mais difuso da sonda. Acreditamos que as diferenças observadas, na formação de 1O2, para neutrófilos e mononucleares em microscopia confocal podem ser devido a diferentes formas de compartimentalização da enzima nestes dois tipos celulares. É possível que isto tenha uma função biológica específica, uma vez que, 1O2 parece ser um importante sinalizador no processo inflamatório. Dado o interesse na detecção de 1O2 em células do sistema imune, também utilizamos uma nova sonda, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE). A detecção neste caso é feita pelo monitoramento de um endoperóxido por HPLC. Os resultados obtidos com essa nova sonda demonstram-se mais satisfatórios quando comparados ao DPA, permitindo uma melhor detecção da produção de 1O2 por fagócitos. / The enzyme myeloperoxidase (MPO), present in leukocytes of granulocytic and monocytic lineage, plays a fundamental role in the production of reactive oxygen species (ROS). There is strong evidence that some products generated from reactions catalyzed by myeloperoxidase (MPO) have a role in cell signaling. Among these products, calls attention singlet oxygen (1O2). In phagocytes, ROS could participate in this process both the death of pathogens, the signaling events of inflammation. Our research group works on the assumption that the location of the MPO, and consequently, the production sites to define the role of 1O2 and 1O2 enzyme. The particular interest in the 1O2 is also due to the fact that its detection is not trivial and relatively little is known about its production by biological systems compared to other ROS. In this study we worked with the question of localization of MPO in human neutrophils and monocytes and the detection of 1O2 by using specific probes. In the experiments we evaluated the production of 1O2 by use of a probe 9.10 difenilantraceno (DPA) and also using the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE) 1O2 as a pickup. Although the proposed use of the DPA coating particles to be phagocytized have been made previously (F. Garcia, MA completed in 2006) hove difficulties in using this technique have been reconsidered in this work. With this probe also obtained images in confocal microscopy, by fluorescence of DPA and loss of fluorescence after reaction with 1O2. The analysis of results with confocal microscopy confirmed that in neutrophils 1O2 is actually being formed in fagolissosomo, when cells are activated by opsonized particles. Monocytes were also able to use DPA as a probe to 1O2. In this case we observe a slower decrease in fluorescence when compared with neutrophils and also a more diffuse effacement of the probe. We believe that the observed differences in the formation of 1O2 for neutrophils and mononuclear cells in confocal microscopy may be due to different forms of compartmentalization of the enzyme in these two cell types. It is possible that this has a specific biological function, since, 1O2 seems to be an important sign in the inflammatory process. Given the interest in the detection of 1O2 cells of the immune system, also used a new probe, the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE). The detection in this case is made by an endoperoxide monitoring by HPLC. The results obtained with this new probe show is more satisfactory when compared to the DPA, allowing better detection of 1O2 production by phagocytes.

Neste trabalho estudou-se a desativação de estados singlete 1π,π* e 1n, π* através da supressão da fluorescência de antraceno e de uma série de aldeídos alifáticos. Existem alguns dados na literatura referentes à supressão da fluorescência de compostos carbonílicos alifáticos por aminas, olefinas e haletos de alquila . No caso específico da desativação de estados 1n, π* de aldeídos alifáticos, alguns autores sugeriram a possibilidade de existir mais de um mecanismo envolvido no processo de supressão. Assim, delimitamos, como um dos objetivos deste trabalho, o estudo da natureza das interações envolvidas na supressão da fluorescência de aldeídos alifáticos por haletos de alquila. Foi possível determinar uma constante de supressão aparente apenas para o sistema pentanal-iodeto de etila. Verificamos que esta aparente supressão podia ser explicada por um efeito de absorção competitiva, dependente da concentração do supressor, no comprimento de onda de excitação (λ = 310 nm). Concluímos, também, que os dados de literatura referentes à supressão da fluorescência de cetonas por brometo de sec-butila podem ser explicados pelo tipo de purificação, inadequada, deste composto. Portanto, nossos resultados estão em das acordo com aqueles relatados para cetonas de estrutura análoga aos aldeídos estudados. De fato, concluímos que haletos de alquila não suprimem a fluorescência nem de alcanonas nem de aldeídos alifáticos. Estudou-se, também, a desativação de estados 1π,π* de compostos aromáticos. Embora este processo seja objeto de uma vasta gama de estudos, a natureza das interações envolvidas na estabilização do exciplex, proposto como intermediário na transferência de energia de vários processos endotérmicos, é objeto de alguma controvérsia. Neste trabalho, estudou-se a supressão de fluorescência de antraceno por sulfetos aromáticos derivados do tiofenol ou do tiocresol. As constantes experimentais de supressão foram calculadas através da equação de Stern-Volmer, utilizando-se as intensidades de fluorescência não-corrigidas. A ausência de correlação entre a cinética de supressão de fluorescência e os parâmetros de ressonância de excitação indica que este mecanismo não e o predominante na estabilização do exciplex. Por outro lado, estudando o efeito da temperatura, foi possível concluir que, a não ser para o derivado n-propílico do orto-tiocresol, não há ~ variação significativa do valor da constante de supressão, indicando que a magnitude da energia de ativação envolvida no processo de supressão é baixa. Ainda, verificamos que há correlação linear entre os parâmetros de Weller e as constantes de supressão, para todos os sulfetos, com exceção dos derivados n-propílicos que apresentam constantes de supressão maiores do que aquelas referentes a outros sulfetos de potencial de oxidação de mesma magnitude. o conjunto de dados pode ser explicado admitindo-se um processo de transferência de carga, onde o doador é o sulfeto e o aceptor é o antraceno e, no qual, a reversibilidade da formação do exciplex desempenhe um papel importante. / In this work fluorescence quenching of the 1π,π* states of anthracene and 1n, π* states of aliphatic aldehydes was studied. There are some literature data regarding fluorescence quenching of carbonyl aliphatic compounds by amines, olefins and alkylhalides. Specifically, for aliphatic aldehydes there is the possibility that quenching occurs by more than one path. We chose as one of the objectives of this work, to understand the nature of interactions in-the deactivation of singlet excited states of aliphatic aldehydes by alkylhalides. It was possible only to determine an apparent quenching rate constant for the pentanal-ethyliodide system. This apparent quenching is due to a competitive absorption effect, at the wavelength of excitation (310 nrn) ,which is proportional to the quencher concentration. We also verified that the reported fluorescence quenching of ketones by sec-butylbromide can be due to impurities present in the halide. The results obtained in the present work totally disagree with those reported for ketones with structure analogous to the aldehydes utilized. In fact, we conclude that alkylhalide do not quench the fluorescence of either alkanones or aliphatic aldehydes. We also studied the deactivation of1π,π* states of aromatic compounds. Although the literature contains several studies about fluorescence quenching of aromatic compounds, the nature of the binding energy of the excited complex is the object of some controversy. In this work, we studied fluorescence quenching of anthracene by aromatic sulphides derived from thiophenol or thiocresol. Quenching constants were calculated by means of the Stern-Volmer equation, employing uncorrected fluorescence intensities. The absence of correlation between fluorescence quenching kinetics and excitation resonance parameters indicates that this mechanism does not provide the maincontribution to exciplex stabilization. On the other hand, we found that, except for the n-propyl derivative of ortho-thiocresol, there was no significant variation of quenching rate constants with temperature, which indicates a low activation energy value for this processo We verified a linear correlation between fluorescence rate constants and Weller parameters except for n-propyl derivatives, whose rate constants are greater than sulphides of the same oxidation potential. The data obtained in this study can be explained assuming formation of a charge transfer complex between anthracene and the sulphide, the first being the acceptor and the,other being the charge donnor, in which case the reversibility of the exciplex formation step must play an important role.

A presente tese descreve o estudo cinético e mecanístico da desativação do estado singlete- e triplete-excitado de flavinas por esteróis (colesterol e ergosterol), vitamina D, coenzima Q10, vitamina K, ácidos graxos e metabólitos da cafeína. Através da análise de Stern-Volmer da supressão de fluorescência da riboflavina pelo colesterol, ergosterol, vitamina D, vitamina K, e pela coenzima Q10 observa-se que o estado singlete excitado da riboflavina é desativado com constante de velocidade superior ao limite da difusão. No entanto, a presença de colesterol, ergosterol, vitamina D, vitamina K e coenzima Q10 não afeta o tempo de vida do estado singlete excitado da riboflavina como demonstrado por experimentos de contagem de fótons resolvido no tempo sugerindo a formação de um complexo precursor [riboflavina...substrato]. O complexo 1:1 formado entre a riboflavina e a vitamina D apresenta Ka = 4 x 104 ± 3 mol⋅L-1 a 25 0C com ΔH0 = -36 ± 7 kJ⋅mol-1 e ΔS0 = -5 ± 3 J⋅mol-1 ⋅K-1. O complexo 1:1 entre a riboflavina e a vitamina K (vit K) e a riboflavina com a coenzima Q10 (CoQ10) apresentam Ka = 1 x 103 ± 1 mol⋅L-1 com ΔH0 = -110 ± 22 kJ⋅mol-1 e ΔS0 = 51 ± 9 J ⋅mol-1⋅K-1 para a vit K e Ka = 4 x 102 ± 1 mol⋅L-1, ΔH0 = -120 ± 27 kJ ⋅mol-1 e ΔS0 = 41 ± 7 J ⋅mol-1⋅K-1 para a CoQ10 a 25 0C. Para a desativação do estado triplete da riboflavina, foram obtidas constantes bimoleculares de velocidade variando de 1,4 x 108 L ⋅mol-1⋅s-1 (vit D) a 1,4 x 109 L ⋅mol-1⋅s-1 (CoQ10). Observa-se supressão da emissão de fluorescência da riboflavina na presença de metabolitos da cafeína, no entanto, sem alterar o tempo de vida do estado singlete excitado da riboflavina sugerindo a formação de um complexo precursor [riboflavina...substrato]. O complexo formado entre a riboflavina e os metabólitos da cafeína apresentam Ka = 295 ± 1 mol⋅L-1 com ΔH0 = -45 ± 8 kJ⋅mol-1 e ΔS0 = 12 ± 1 J⋅mol-1⋅K-1 para o ácido 1,7-dimetil úrico, Ka = 289 ± 1 mol⋅L-1 com ΔH0 = -38 ± 5 kJ ⋅mol-1 e ΔS0 = 9 ± 2 J ⋅mol-1⋅K-1 para o ácido 1-metil úrico e Ka = 275 ± 1 mol⋅L-1 com ΔH0 = 16 ± 3 kJ ⋅mol-1 e ΔS0 = 6 ± 1J ⋅mol-1⋅K-1 para a 1,7-dimetilxantina a 25 0C. Para a desativação do estado triplete da riboflavina, foram obtidas constantes de velocidade de 3kq = 4,2 x 108 L.mol-1.s-1 para a 1,7-dimetilxantina, 3kq = 1,0 x 108 L.mol-1.s-1 para o ácido 1,7-dimetil úrico e 3kq = 1,4 x 108 L.mol-1.s-1 para o ácido 1-metil úrico. Os ésteres metílicos (oleato de metila, ácido linoléico conjugado (CLA), linoleato de metila, linolenato de metila, araquidonato de metila, eicosapentanoato de metila, e docosahexanoato de metila) não desativam o estado singlete-excitado da riboflavina. Entretanto, os ésteres metílicos se mostraram reativos frente ao estado triplete da riboflavina com constantes de velocidades 3kq variando de 8,4 x 105 a 3,3 x 107 L⋅smol-1 ⋅s-1 com uma dependência linear do número de hidrogênios bis-alílicos com excessão do CLA. / The present thesis describes the kinetic and mechanistic studies of flavin singlet- and triplet-excited states deactivation by sterols (ergosterol and cholesterol), vitamin D, coenzyme Q10, vitamin K, fatty acids, and caffeine metabolites. From the Stern-Volmer analysis of the riboflavin fluorescence quenching by cholesterol, ergosterol, vitamin D, vitamin K and coenzyme Q10, it is noted that the singlet-excited state of riboflavin is deactivated with a rate constant exceeding the diffusion limit. However, the presence of cholesterol, ergosterol, vitamin D, vitamin K, coenzyme Q10 did not affect the lifetime of singlet-excited riboflavin as probed by single photon counting experiments suggesting the formation of a ground-state precursor complex [riboflavin ...substrate]. The 1:1 complex formed between riboflavin and vitamin D showed Ka = 4 x 104 ± 3 mol⋅L-1 a 25 0C with ΔH0 = -36 ± 7 kJ⋅mol-1 and ΔS0 = -5 ± 3 J⋅mol-1 ⋅K-1. The 1:1 complex formed between riboflavin and vitamin K (vit K) and riboflavin with coenzyme Q10 (CoQ10) showed Ka = 1 x 103 ± 1 mol⋅L-1 with ΔH0 = -110 ± 22 kJ⋅mol-1 and ΔS0 = 51 ± 9 J ⋅mol-1⋅K-1 for vit K e Ka =4 x 102 ± 1 mol⋅L-1, ΔH0 = -120 ± 27 kJ ⋅mol-1 and ΔS0 = 41 ± 7 J ⋅mol-1⋅K-1 for CoQ10 a 25 0C. For the deactivation of triplet riboflavin, bimolecular rate constants were found to vary from 1,4 x 108 L ⋅mol-1⋅s-1 (vit D) a 1,4 x 109 L ⋅mol-1⋅s-1 (CoQ10). The caffeine metabolites quench fluorescence emission of riboflavin however, without affecting the lifetime of the singlet-excited state, suggesting the formation of a ground state precursor complex [riboflavin ... substrate]. The complex formed between riboflavin and caffeine metabolites showed Ka = 295 ± 1 mol⋅L-1 with ΔH0 = -45 ± 8 kJ⋅mol-1 and ΔS0 = 12 ± 1 J⋅mol-1⋅K-1for 1,7-dimetyl uric acid, Ka = 289 ± 1 mol⋅L-1 with ΔH0 = -38 ± 5 kJ ⋅mol-1 and ΔS0 = 9 ± 2 J ⋅mol-1⋅K-1 for 1-methyl uric acid and Ka = 275 ± 1 mol⋅L-1 with ΔH0 = 16 ± 3 kJ ⋅mol-1 and ΔS0 = 6 ± 1J ⋅mol-1⋅K-1 for 1,7-dimethylxanthine at 25 0C. For the deactivation of triplet riboflavin, rate constant were obtained with 3kq = 4,2 x 108 L.mol-1.s-1 para a 1,7-dimethylxanthine, 3kq = 1,0 x 108 L.mol-1.s-1 for 1,7-dimethyl uric acid, and 3kq = 1,4 x 108 L.mol-1.s-1 for 1-methyl uric acid. The methyl esters (methyl oleate, conjugated linoleic acid (CLA), methyl linoleate, methyl linoleate, methyl arachidonate, methyl eicosapentanoate, and methyl docosahexanoate) did not quench the singlet-excited riboflavin. However, the methyl esters were shown to be reactive towards triplet riboflavin with rate constants ranging from 8,4 x 105 a 3,3 x 107 L⋅mol-1 ⋅s-1and depending linearly with the number of bis-allylic hydrogens with exception to CLA.

No presente trabalho são apresentadas a síntese e a caracterização estrutural, fotofísica, fotoquímica e fotobiológica de nanopartículas contendo os fotossensibilizadores (FS) Azul de Metileno (AM) e Tionina. AM e Tionina foram incorporados nas nanopartículas sil-AM e sil-Tio pelo processo sol-gel. Nas nanopartículas Cab-Tio, Tionina foi ligada à superfície de sílica CabOsil® através de ligação covalente com reagentes bifuncionais. Todas as nanopartículas mostraram-se esféricas e com de diâmetro médio na faixa de 30 a 60nm. A imobilização dos FS induziu a agregação destes em extensões diferentes para cada tipo de nanopartícula. Foi observado que a maior presença de dímeros de FS leva à menor eficiência de geração de 1O2. Constatou-se que as nanopartículas sofrem pouca influência do meio, uma vez que os FS a elas ligadas não sofreram redução química por NADPH, nem supressão do estado tripleto por íons ascorbato e a supressão de fluorescência por íon brometo foi diminuída. Foi testado também o efeito do recobrimento destas nanopartículas com lipídios dioleilfosfatidil colina (DOPC) e fosfatidilglicerol (PG) e com Polietileno glicol (PEG). A adsorção das nanopartículas sobre membranas miméticas foi reduzida após os recobrimentos, resultado que foi explicado pelas interações de carga superficial (potencial zeta) e pela força de hidratação. As nanopartículas sil-AM e Cab-Tio apresentaram fototoxicidades in vitro, 38% e 20% maiores que os respectivos FS livres. A modificação das nanopartículas de sil-AM com lipídios e com PEG diminuiu a fototoxicidade das mesmas e no caso do recobrimento com lipídios levou ao aumento da toxicidade no escuro. Imagens de microscopia confocal mostraram que as nanopartículas com e sem recobrimento de lipídios entram em células B16. No caso das nanopartículas recobertas, observou-se um perfil de distribuição difuso por todo o citoplasma e no caso de nanopartículas sem recobrimento, estas encontraram-se em poucas regiões vacuolares do citoplasma. O perfil de distribuição homogênea por todo o citoplasma no caso de nanopartículas recobertas com lipídios pode ser o responsável pelo aumento de toxicidade no escuro. Concluiu-se que a ligação dos FS em nanopartículas com diferentes graus de agregação pode ser uma estratégia para obtenção de sistemas com capacidade modulada de geração de 1O2 e com reduzida susceptibilidade às composições do meio. As atividades fototóxicas das nanopartículas contra células B16 mostraram que estas podem ser úteis em Terapia Fotodinâmica de Câncer / In this work we present the synthesis and the characterization (structural, photophysical, photochemical and photobiological) of nanoparticles with incorporated photosensitizers (PS) Methylene Blue (MB) and Thionin. MB and Thionin were incorporated in sil-MB and sil-Th nanoparticles through sol-gel process. In the case of Cab-Th nanoparticles Thionin was linked to the surface of CabOsil® nanoparticles through cross-linking reactions. All nanoparticles were spherical and presented average diameter in the range of 30 to 60nm. Different extension of PS aggregation was observed in each nanoparticle. It was characterized that the higher the proportion of dimers to monomers the smaller the efficiency of singlet oxygen (1O2) generation. It was shown that nanoparticles can protect PS from external interferences, since NADPH did not reduce them, neither were their triplet state quenched by ascorbate ions. Besides, fluorescence quenching by bromide ions was reduced compared to free PS. The effect of covering the nanoparticles with lipids, i.e., di-oleil phosphatidylcholine (DOPC) and phosphatidylglycerol (PG), and with Polyethylene glycol was also tested. The nanoparticle adsorption over membrane mimics was reduced, which was explained by the interaction among surface charges (zeta potential) and by hydration forces. Sil-MB and Cab-Th nanoparticles presented in vitro phototoxicity 38% and 20% higher than the respective free PS. It was observed that the nanoparticle coating with lipids and with PEG reduced their photoxicity. Nanoparticles coated with lipids showed higher toxicity in the dark. Confocal fluorescence images of B16 cells showed that nanoparticles with or without lipid coating enter the cells. In the case of lipid-coated nanoparticles a diffuse distribution profile was observed and in the case of nanoparticles without coating, they concentrated in specific vacuolar regions of the cytoplasm. The homogeneous cytoplasmic distribution profile of lipid-coated nanoparticles can explain the increased toxicity in the dark. It has been concluded that immobilization of PS with different aggregation degrees is a strategy to obtain systems in which the modulated efficiency of 1O2 generation is not affected by the external medium. Finally, based on the observed in vitro phototoxicity activity against B16 cells, these systems can be useful in Photodynamic Therapy of Cancer

O ozônio (O3) é um poderoso oxidante e quantidades significativas podem ser formadas em ambientes urbanos, como resultado de uma série de eventos fotoquímicos, sendo um risco para a saúde humana. Devido a sua reatividade química, o ozônio é capaz de promover modificações oxidativas em diversas biomoléculas, tais como, DNA, proteínas e lipídios. As reações do O3 com biomoléculas geram quantidades significativas de O2 (1Δg). Sendo assim, essas reações são caracterizadas pela transferência de um átomo de oxigênio do O3 ao substrato oxidado. Devido à regra de conservação do Spin, isto requer que o dioxigênio gerado nesta reação esteja no seu estado singlete. Neste específico mecanismo, a formação do hidrotrióxido tem sido frequentemente assumida como um importante intermediário da ozonização. Ainda, constatou-se o elevado potencial mutagênico do O3 sobre o DNA, levando, principalmente, à substituição de suas bases. A frequência das substituições das bases foi essencialmente localizada no par G: C\'s (75%), uma característica das espécies reativas de oxigênio, como o O2 (1Δg). No entanto, os mecanismos pelos quais O3 causa danos ao DNA ainda não foram completamente elucidados. No presente trabalho, as evidências espectroscópicas na geração do O2 (1Δg) foram obtidas através da emissão de luz bimolecular na região vermelha do espectro (λ = 634 nm) e através da emissão de luz monomolecular na região do infravermelho próximo (λ = 1270 nm ) durante a reação de O3 com dGuo e 8-oxodGuo. Além disso, desenvolveu-se uma metodologia para a geração de ozônio isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 a partir do 18O2 (3Σg-). Deste modo, as evidências da formação dos diastereoisômeros da spiroiminodihidantoina, tanto a isotopicamente marcada no 18O quanto a não marcada, juntamente com a 8-oxodGuo, imidazolona e oxazolona, foram detectados como produtos de oxidação das reações com 18O3. Para tal observação, análises foram realizadas por HPLC acoplado ao espectrômetro de massas. Ademais, a detecção do 18O2 (1Δg) durante a decomposição do 18O3 foi obtida por captação química do O2 (1Δg) pelo derivado de antraceno, EAS, detectando o endoperóxido corresponde com a adição de dois átomos de 18O na posição 9,10 do antraceno. Além disso, mais uma evidência da presença do O2 (1Δg) foi inequivocamente demonstrada pela caracterização do espectro de emissão no infravermelho próximo. / Ozone (O3) is a potent oxidant and significant amounts can be formed in urban environments as a result of a series of complex photochemical events. It is a threat for human health. Due its chemical reactivity towards biological targets, ozone is able to promote oxidative modification in several biomolecules, such as DNA, proteins and lipids. Reactions of O3 with biomolecules are able to generate in high yields of singlet molecular oxygen [O2 (1Δg)]. The transfer of one oxygen atom from O3 to the oxidized substrate characterizes these reactions. Spin conservation rules require that the dioxygen generated in this reaction has to be in its singlet state. In this specific mechanism, hydrotrioxide has often been assumed as important intermediates in the ozonization process. In addition, ozone has been established as a powerful mutagenic agent, and the most observed mutation is in G:C transversion. This kind of transversion is typical in reactions involving DNA and reactive oxygen species, such as O2 (1Δg). However, the mechanisms by which O3 causes DNA damage have not yet been fully elucidated. In the present research, spectroscopic evidence for the generation of O2 (1Δg) was obtained by measuring the dimol light emission in the red spectral region (λ = 634 nm) and the monomol light emission in the near-infrared region (λ=1270 nm). Both measuements were done during interaction of O3 with dGuo and 8-oxodGuo. In addition, a system was built to produce isotopically labeled ozone with 18O. Thefore, in the same system that 8-oxodGuo, imidazolone and oxazolone, 18O-labeled and unlabeled diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides were detected as the oxidation products with 18O3. In that case, analyses by HPLC coupled to mass spectrometry were performed. Moreover, in the O3 decomposition the formation of 18O-labeled O2 (1Δg) from 18O-labeled ozone was obtained by chemical trapping of O2 (1Δg) with EAS anthracene derivative and detected the corresponding 18O-labeled EAS endoperoxide. More evidence of the presence of O2 (1Δg) was unequivocally demonstrated by the direct characterization of the near-infrared light emission spectrum.

As proteínas são consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido à abundância em sistemas biológicos e às altas constantes de reações com estas espécies. Adicionalmente, têmse demonstrado que o triptofano (W) é um aminoácido extremamente susceptível a oxidação, inclusive pelo oxigênio singlete (1O2). A reação do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reação tem atraído mais atenção, uma vez que produtos de oxidação do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) têm sido associados com algumas condições patológicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formação de agregados covalentes da superóxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrófica. Entretanto, há poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reações, com estudos de estabilidade, identificação de subprodutos e propostas mecanísticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidação do triptofano pelo 1O2, através da análise e caracterização de produtos de oxidação gerados. Com este intuito, dois hidroperóxidos de triptofano isômeros (WOOH cis e trans, em relação ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por análises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidação do W pelo 1O2. Estes hidroperóxidos demonstraram ser relativamente estáveis às temperaturas ambiente e fisiológica, decompondo lentamente para os alcoóis correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das soluções contendo os WOOH leva a decomposição quimiluminescente dos WOOH à FMK. Utilizando hidroperóxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possível confirmar que a FMK formada durante esta decomposição era marcada com dois átomos de oxigênio. Este resultado demonstra que os dois átomos da FMK são derivados do grupamento hidroperóxido. Em adição, estas reações são quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermediário dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescência da decomposição dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescência da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espécie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisoméricas também foram caracterizadas como produtos de oxidação do triptofano pelo 102; uma possível via radicalar foi excluída. Em suma, este estudo contribuiu na elucidação das bases químicas envolvidas na oxidação do triptofano por 102, através da caracterização dos produtos formados e da investigação detalhada dos mecanismos de decomposição destes produtos. / Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

O presente estudo teve por objetivo desenvolver metodologias para imobilização de sondas moleculares fluorescentes em matrizes de sílica de tamanho controlado, bem como estudar a interação das sondas livres e imobilizadas com oxigênio e ferro. A classe de fluoróforos escolhida foi a das porfirinas, que apresentam baixa solubilidade em água e têm seu uso limitado, apesar de apresentarem pelo menos duas propriedades interessantes: (i) interagem com oxigênio formando oxigênio singlete, sendo candidatas a drogas para terapia fotodinâmica, e (ii) têm sua fluorescência suprimida ao complexarem metais, podendo atuar como sondas fluorescentes. A imobilização de porfirinas em esferas de sílica de tamanho inferior a 100 nm foi realizada através de um processo sol-gel ou pelo uso de microemulsões. O método sol-gel exigiu a modificação prévia da molécula da porfirina com reagente organosilano e resultou em esferas na faixa de 70 nm. O método da microemulsão dispensou a modificação da porfirina e resultou em esferas na faixa de 30 nm, muito estáveis em água. Os fluoróforos imobilizados preservaram suas propriedades óticas e a sua capacidade de gerar oxigênio singlete. Os estudos envolvendo a detecção de oxigênio singlete foram realizados pelo método físico direto, a partir do registro da fosforescência característica no infravermelho-próximo, e pelo método químico indireto usando a sonda 1,3difenilisobenzofurano. O tempo de vida do oxigênio singlete obtido quando uma suspensão, em acetonitrila, de esferas de sílica carregadas com porfirinas foi excitada em 532 nm foi de 52 &#181;s e está de acordo com o valor determinado para uma solução padrão contendo azul de metileno sob as mesmas condições. As porfirinas imobilizadas em sílica apresentaram eficiência de geração de oxigênio singlete similar ou até superior ao rendimento quântico das porfirinas livres. Após estudos concluiu-se que a elevada geração de oxigênio singlete pode ser atribuída a mudanças no equilíbrio monômero-dímero após a imobilização das porfirinas na matriz de sílica. O emprego das porfirinas imobilizadas em esferas de sílica como sondas fluorescentes para detecção de ferro também foi investigado. Estudos da interação da hematoporfirina IX livre e imobilizada com ferro apresentaram sítios de forte e fraca interação de acordo com a faixa de concentração de ferro utilizada. A supressão da fluorescência da Hp IX livre e imobilizada em sílica obedece a um comportamento linear na faixa de concentração de ferro de 0 a 60 &#181;M. Portanto, a imobilização de porfirinas em nanoesferas de sílica permitiu a dispersão de porfirinas insolúveis em água e manteve as moléculas acessíveis ao oxigênio molecular e aos íons ferro, preservando suas propriedades e ampliando a possibilidade de aplicações. / The present study is focused on developing methodologies for the immobilization of fluorescent molecular probes in size controlled silica matrixes, and studying the interactions of free and entrapped molecules with molecular oxygen and iron. This study was based on porphyrins, a class of compounds with low solubility in water and limited use, but with at least two very interesting properties: (i) interaction with molecular oxygen to yield singlet oxygen, potential drug for use in photodynamic therapy; and (ii) fluorescence quenching by metal ions, potential fluorescent probe. The immobilization of porphyrins in silica spheres of size < 100 nm was achieved by the sol-gel or microemulsion approach. The sol-gel method required the modification of porphyrin molecules with an organosilane reagent and resulted in spheres of about 70 nm. The microemulsion method did not require the modification of porphyrin molecules and resulted in spheres of about 30 nm, very stable in aqueous solution. The immobilized porphyrins preserved their optical properties and the capacity to generate singlet oxygen. Singlet oxygen was detected by a direct method from its characteristic phosphorescence decay curve at near-infrared and by a chemical method using 1,3-diphenylisobenzofuran to trap singlet oxygen. The lifetime of singlet oxygen, when a suspension of porphyrin-loaded silica spheres in acetonitrile was excited at 532 nm, was determined as 52 &#181;s, which is in good agreement with the value determined for a standard methylene blue solution under the same conditions. The porphyrin-loaded silica spheres have an efficiency of singlet oxygen generation similar or even higher than the quantum yield of free porphyrins. This high efficiency of singlet oxygen generation was attributed to changes on the monomer-dimer equilibrium after photosentisizer immobilization in the silica matrix. The use of the immobilized porphyrins as fluorescent probes for iron sensing was also investigated. The interaction of free and silica immobilized hematoporphyrin IX with iron resulted in sites of strong and weak interaction according to the concentration range. The fluorescence quenching of Hp IX, free and immobilized in silica spheres follows a linear correlation with the iron concentration from 0 to 60&#181;M. In conclusion, the immobilization of porphyrins in silica nanoespheres allowed the dispersion of insoluble porphyrins in water, while preserving the accessibility to molecular oxygen and metal ions and broadening the scope of applications.

Peroxinitrito é um potente agente oxidante, nitrante e nucleofilico formado in vivo pela reação difusional do radical ânion superóxido com óxido nítrico, cuja produção exacerbada em situações de estresse oxidativo e nitrosativo pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas sub-celulares. Por outro lado, vários compostos carbonílicos reativos tais como acroleína e compostos &#945;-dicarbonílicos são descritos como citotóxicos e genotóxicos, pois reagem com biomoléculas aminadas resultando em perda de funções nativas, situação esta denominada de \"estresse carbonílico\". Dentre os metabólitos &#945;-dicarbonílicos, altamente suscetíveis a adições nucleofílicas, destacam-se o biacetilo, derivado do metabolismo hepático de etanol e contaminante de alimentos, e metilglioxal e glioxal, ambos catabólitos de glicose, proteínas e lipídios acumulados em doenças relacionadas ao envelhecimento. Neste trabalho, observou-se que, em tampão fosfato normalmente aerado de pH próximo à neutralidade, (i) estes três compostos sofrem adição nucleofílica de peroxinitrito com constantes de velocidade de segunda ordem uma a três ordens de grandeza acima dos valores relatados para compostos monocarbonílicos (k2 &#8776; 4-100 M-1s-1); (ii) os sistemas biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito consomem o oxigênio dissolvido com produção de acetato ou acetato e formiato, respectivamente, via radical acetila capaz de acetilar histidina, lisina e 2\'-desoxiguanosina se adicionados à mistura reacional; e (iii) o sistema glioxal/peroxinitrito gera sucessivamente radical formila e radical formilhidroperoxila, cujo desproporcionamento a formiato e gás carbônico é acompanhado da emissão de luz no infra-vermelho próximo (&#955;max = 1270 nm), atribuída a oxigênio molecular no estado singlete (O21&#916;g) (Reação de Russell). Estes estudos evidenciam que a reação de metabólitos &#945;-dicarbonílicos com peroxinitrito gera radicais livres e embasam a hipótese de que possam contribuir para a acetilação radicalar, não-enzimática intracelular, de proteínas (epigenética) e DNA, portanto potencialmente implicadas na fisiologia e patologia do envelhecimento e desordens metabólicas, nas quais a participação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e compostos carbonílicos foi relatada. Deve-se ainda notar que a descoberta de acetilação radicalar de biomoléculas por metabólitos &#945;-dicarbonilicos e peroxinitrito prepara o caminho para a identificação de novas reações químicas de biomoléculas, não catalisadas por enzimas, que possam eventualmente revelar novos biomarcadores teciduais em doenças adquiridas e inatas. / Peroxynitrite is a strong biological oxidant, nitrating and nucleophilic agent, formed by the diffusion-controlled reaction of the superoxide anion radical with nitric oxide, whose exacerbated production in oxidative and nitrosative stress leads to chemical damage to biomolecules and sub-cellular structures. On the other hand, various reactive carbonyl compounds like acrolein and &#945;-dicarbonyls are reportedly cytotoxic and genotoxic for their ability to react with amino biomolecules resulting in loss of native functions, a situation named \"carbonyl stress\". Among very reactive &#945;-dicarbonyls highly prone to nucleophilic additions, we highlight biacetyl, a hepatic alcohol metabolite and food contaminant, and methylglyoxal and glyoxal, both catabolites of glucose, proteins and lipids that accumulate in ageing-related disorders. Here, we report that, in normally aerated phosphate buffer near the physiological pH, (i) these three dicarbonyls undergo nucleophilic addition of peroxynitrite whose second order rate constants are one to three orders of magnitude than those documented for monocarbonyls (k2 &#8776; 4-100 M-1s-1); (ii) the biacetyl or methylglyoxal/peroxynitrite systems consume the dissolved oxygen yielding the acetate anion or acetate plus formate anion, respectively, from acetyl radical intermediate which was found to acetylate added histidine, lysine and 2\'-deoxyguanosine; and (iii) the glyoxal/peroxynitrite system ultimately generate formyl radical and formylperoxyl radical, whose dismutation to formate and carbonic oxide is accompanied by near infrared monomol emission (&#955;max = 1270 nm) characteristic of singlet molecular oxygen (O21&#916;g) (Russell reaction). Our studies strongly attest that the reaction of &#945;-dicarbonyls with peroxynitrite release free radicals that can potentially contribute for the radical, non-enzymatic acetylation of proteins (epigenetics) and DNA bases possibly implicated in the ageing physiopathology and metabolic disorders, where participation of reactive oxygen, nitrogen and carbonyl species is well recognized. Also noteworthy is that our findings may pave the way to the discovery of novel biochemical reactions whose products can eventually be useful as biomarkers of acquired and innate maladies.

A síntese, aspectos estruturais, fotoquímica, fotofísica, atividade farmacológica e a fotoatividade citotóxica in vitro do complexo [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = ftalocianina) são descritas neste trabalho. O efeito biológico do complexo de rutênio foi estudado na presença e ausência de irradiação luminosa na janela terapêutica (600 - 850 nm), sob linhagem de células B16F10. Comparativamente, a atividade citotóxica de [Ru(NO)(ONO)pc] foi muito maior que [Rupc], sob diferentes níveis de potência do laser, sugerindo a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, após irradiação luminosa, pode ser um importante mecanismo pelo qual o complexo nitrosilo de rutênio apresenta maior atividade biológica, na linhagem de célula estudada. Após a ativação por irradiação luminosa, o complexo [Ru(NO)(ONO)pc] apresentou diminuição da viabilidade celular na linhagem B16/F10, com eficácia dependente da potência do laser. O encapsulamento de [Ru(NO)(ONO)pc] em lipossoma aumentou em cerca de 25 % a atividade citotóxica do complexo nitrosilo, quando comparado com o mesmo, porém em solução de PBS. Esta eficácia foi diretamente proporcional à quantidade de rutênio no interior da célula, cuja concentração foi determinada por espectrometria de massa ICP-MS, evidenciando maior eficácia no mecanismo de transporte do complexo nitrosilo para o interior da célula. A atividade fotocitotóxica foi atribuída principalmente aos fenômenos de apoptose, cujo o mecanismo foi derivado da análise por citometria de fluxo. O mecanismo de liberação de NO dá-se por processo redutimétrico do complexo [Ru(NO)(ONO)pc], haja vista que a vasodilatação estudada é dependente do NO, liberado do complexo nitrosilo, e independente da irradiação luminosa. Aliás, concentração da ordem de 1,0 x 10-7 M do complexo de rutênio em PBS ocasionou 100 % de vasodilatação, cuja concentração é semelhante ao do nitroprussiato de sódio, medicamento utilizado em clínica médica com severas restrições. Em princípio, a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, oriundo da irradiação luminosa na janela terapêutica, do complexo nitrosilo de rutênio, pode constituir-se num poderoso mecanismo para aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica, uma portentosa terapia clínica que encontra limitação dependente do tamanho da área cancerígena bem como da vascularização desta área. / The synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical, farmacological studies and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = phthalocyanine) are described in this work. Its biological effect was studied in the presence and absence of therapeutic window light irradiation (600 - 850 nm) in B16/F10 cell line by means nitric oxide and singlet oxygen production. At comparable light irradiation potency levels [Ru(NO)(ONO)pc] was more effective than [Rupc] suggesting nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation may be an important mechanism by which the nitrosyl ruthenium complex exhibits more biological activity in cells. Following visible light activation, the [Ru(NO)(ONO)pc] complex showed an increased potency with photoinduced dose modifications in the B16/F10 cells. The liposome containing [Ru(NO)(ONO)pc] complex was over 25 % more active than the corresponding ruthenium complex in PBS solution. It was directly proportional to the amount of ruthenium inside the cell obtained by ICP-mass spectrometry evidencing the cross membrane barrier providing phenomenal increase of [Ru(NO)(ONO)pc] complex concentration inside the cell. The photocytotoxic activity was mainly attributed to the apoptosis phenomena by flux cytometry analysis. The mechanism of NO release occurs by reductimetric process of [Ru(NO)(ONO)pc] complex, considering the vasodilation studies, which vasorelaxation showed dependence on NO concentration and independence on light irradiation. Moreover, concentration of 1.0 x 10-7 M of the ruthenium complex in PBS caused 100% vasodilation, which is similar to the concentration of sodium nitroprusside, a drug used in medical clinic with severe restrictions. Furthermore, the nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation of the nitrosyl ruthenium complex produced two radicals capable to improve photodynamic therapy, a clinical therapy which efficiency is actually limited by the cancer area and vascularization