Au cours des maladies cardiovasculaires (MCV), il peut se produire divers problèmes de santé, telle que l’insuffisance cardiaque ou encore l’HTA. Ces phénomènes se caractérisent, entre autres, par une augmentation de synthèse d’endotheline-1 (ET-1), un neuropeptide synthétisé par les cellules endothéliales ayant un effet vasoconstricteur sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Ainsi, la surexpression de ce vasopeptide, mène à terme, au maintien de l’HTA aggravée des sujets, précédée ou concomitante à l’athérosclérose ou à la resténose, cliniquement illustrées par une prolifération et une migration anormale des CMLV de la media vers l’intima des vaisseaux sanguins. Parallèlement, il a été observé que la protéine sirtuine-1 (Sirt-1), membre de la famille des protéines histones déacétylases (HDAC), présente des propriétés anti-athérosclérotiques par sa capacité d’atténuer la prolifération et la migration des CMLV. Des travaux récents ont aussi montré qu’au cours de l’HTA la protéine Sirt-1 est faiblement exprimée dans les CMLV. Son implication dans le développement des pathologies vasculaires semble apparente, mais des études demeurent nécessaires pour décrire son rôle exact dans la pathogenèse des MCV. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’observer la variation d’expression de Sirt-1 dans les CMLV, isolées de l’aorte ascendante de rat, en réponse à l’ET-1. On a remarqué qu’une heure de stimulation des CMLV avec l’ET-1 induit une diminution de l’expression de Sirt-1 via l’activation des récepteurs ETA. Ces résultats suggèrent que la capacité d’ET-1 à atténuer l’expression de Sirt-1 serait un éventuel mécanisme d’action avec des effets favorisant les MCV. / Cardiovascular diseases (CVD) are associated with several vascular dysfunctions such as heart failure and hypertension. These phenomena cause increased synthesis of endothelin-1 (ET-1), a neuropeptide, synthesized by endothelial cells which has vasoconstrictor action on vascular smooth muscle cells (VSMC). Overexpression of this vasopeptide leads eventually to hypertension (HTA). This usually happen after atherosclerosis or restenosis, leading to proliferation and migration of VSMC from media to intima. It was shown that during atherosclerosis, the protein sirtuin-1 (Sirt-1), a member of protein histone deacetylases (HDAC), has an anti-atherosclerotic effect due to its ability to diminish proliferation and migration of VSMC. It has also been observed that during hypertension, Sirt-1 was poorly expressed in VSMC. Its role in vascular pathophysiology remains sparsely studied, therefore it’s essential to explore it. In the present study we investigated the expression of Sirt-1 in VSMC isolated from the ascending aorta of rats, in response to ET-1 stimulation. We observed that Sirt-1 expression decreases after 1 hour of stimulation by ET-1 via ETA receptors. In summary, these results suggest that the ability of ET-1 to attenuate Sirt-1 expression in VSMC, may be a potential mechanism for promoting CVD.

Sirt3, une des sept sirtuines chez les mammifères, est une déacétylase mitochondriale NAD+-dépendante qui joue un rôle dans le contrôle des facteurs clés de plusieurs voies métaboliques. Sirt3 déacétyle et active un grand nombre d'enzymes mitochondriales impliquées dans l'activité de la chaîne respiratoire, la production d'ATP, le cycle de Krebs, ainsi que le cycle de l'urée. Parallèlement à son rôle dans le métabolisme énergétique, l'activité mitochondriale intervient également dans l'induction de l'apoptose ainsi que dans la régulation de la prolifération et la différenciation cellulaires. En particulier les travaux du laboratoire ont montré qu'il existe une véritable régulation de la différenciation myogénique par l'activité mitochondriale. Comme Sirt3 régule l'activité mitochondriale, nous nous sommes intéressés à étudier l'implication de cette sirtuine dans la différenciation des myoblastes. Dans une première partie, nous avons évalué l'expression endogène de Sirt3 au cours de la différenciation des myoblastes murins C2C12, puis étudié l'effet de son inhibition sur le processus de différenciation et sur l'activité mitochondriale. Nous avons montré que l'expression de Sirt3 endogène augmente après induction de la différenciation des C2C12. Une inhibition stable de l'expression de Sirt3 par interférence (Short hairpin Sirt3, shSirt3) entraîne : 1) un blocage de la différenciation terminale des C2C12 reflété par une chute significative de l'index de fusion ainsi que de l'expression des marqueurs myogéniques MyoD, Myogénine et troponine T ; 2) une diminution de l'activité mitochondriale reflétée par une altération de l'expression de PGC-1alpha, VDAC et citrate synthase, et une diminution des activités enzymatiques des complexes de la chaîne respiratoire et de la respiration maximale des myoblastes ; 3) une augmentation de la production de DROs. Ces résultats suggèrent un rôle important de Sirt3 dans la différenciation des myoblastes, en relation avec son influence sur l'activité mitochondriale.Dans une seconde partie, nous avons évalué l'importance de Sirt3 in vivo sur le développement et le métabolisme du tissu musculaire en étudiant le phénotype de souris surexprimant l'isoforme courte (MCK-SIRT3M3) ou l'isoforme longue (MCK-SIRT3M1) de Sirt3 spécifiquement dans le muscle squelettique. Nos premiers résultats obtenus à l'âge de 3 mois montrent que la capacité oxydative des souris MCK-SIRT3M1 est plus faible et celle des souris MCK-SIRT3M3 plus élevée par rapport aux souris sauvages. Les souris MCK-SIRT3M3 présentent une atrophie musculaire dès l'âge de trois mois alors que la capacité musculaire et l'activité mitochondriale dans les muscles de ces souris ne sont pas modifiées. Avec l'âge, le phénotype des souris surexprimant l'isoforme M3 dans le muscle est plus marqué : l'atrophie s'accentue, le nombre de mitochondries augmente, et l'expression de la myosine de type 1 augmente alors que l'expression des myosines de type II diminue. Ces données indiquent que l'isoforme courte de Sirt 3 aurait une influence dans le développement et le métabolisme du muscle squelettique de souris. / Sirt3, one of the seven mammalian sirtuins, is a mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)-dependent deacetylase, and has been shown to control multiple key metabolic pathways. Sirt3 deacetylates and activates a large number of mitochondrial enzymes implicated in the activity of respiratory chain and ATP production, TCA and Urea cycles. We have previously shown that mitochondrial activity is importantly involved in the regulation of myoblast differentiation. Since Sirt3 modulates mitochondrial activity, we have investigated its influence on myoblast differentiation. First, we have evaluated endogen Sirt3 expression during C2C12 myoblast differentiation and then we examined the effect of its inhibition on the differentiation processes and on mitochondrial activity. We have shown that Sirt3 protein expression increased after the induction of myoblast differentiation. A stable inhibition of Sirt3 expression, using short hairpin Sirt3 (shSirt3) in C2C12 myoblasts resulted in: 1) abrogation of terminal differentiation reflected by a sharp decrease of the fusion index and a significant decrease of Myogenin, MyoD and Troponin T protein expression; 2) a decrease in mitochondrial activity reflected by alterations in PGC1-alpha, VDAC and citrate synthase expression, and a decrease in respiratory chain complexes activity and myoblast maximal respiration, 3) an increase in ROS production. These data suggest that Sirt3 plays an important role in the regulation of myoblast differentiation through its influence on mitochondrial activity.In a second part, to investigate the role of Sirt3, in vivo, in myogenesis and in mitochondrial activity, we have studied the effect of Sirt3 isoforms (short and long, MCK-SIRT3M3 and MCK-SIRT3M1 respectively) overexpression exclusively in skeletal muscle tissue of transgenic mice. We show that basal metabolism is lower MCK-SIRT3M1 mice and higher in MCK-SIRT3M3 compared to WT mice at 3 months of age. In 3 month-old MCK-SIRT3M3 mice, skeletal muscle is atrophied while muscle capacity and mitochondrial activity are not altered. Skeletal muscle phenotype evolves with age, in MCK-SIRT3M3 mice : increase in muscle atrophy, mitochondrial content. These data suggest that Sirt3 short isoform plays an important role in skeletal muscle development and metabolism in mice.

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L'acétylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs). Elle intervient dans de multiples processus bologiques et physiopathologiques tels que, l’activité transcriptionnelle, l'apoptose, la régulation des voies métaboliques, les cancers, les maladies inflammatoires et cardiovasculaires. Face à l’importance de l’acétylation des protéines, il apparaît donc indispensable de bien comprendre les mécanismes qui y sont associés, et donc, de pouvoir identifier et quantifier les protéines acétylées à partir du protéome complet d’échantillons complexes tels que des extraits cellulaires ou tissulaires. La spectrométrie de masse est une technique de choix pour de telles études, car elle permet d’identifier les protéines et les sites d’acétylation, mais aussi de les quantifier en l’associant à des techniques de quantification (label free, SILAC, iTRAQ/TMT, AQUA). Malheureusement, ces méthodes ne ciblent pas particulièrement les acétylations et requièrent l’utilisation de techniques d’enrichissement ou de fractionnement qui ne sont dédiées qu’à certains types d’acetylation : les N-ter et K-acetylation. Aucun enrichissement n’est disponible pour les O- acétylations et ces méthodes d’enrichissement ne sont pas toujours compatibles avec les techniques de quantification citées ci-dessus. Pour améliorer la détection et la quantification des acétylations, nous proposons la méthode RAQIAT (Relatif Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag) qui se résume en trois grandes étapes: i) Le blocage des fonctions amines libres à l'aide de la di-méthylation réductrice, ceci empêchera ces dernières de réagir avec le réactif RAQIAT, ii) La désacétylation des lysines acétylées pour permettre une quantification sélective des acétylations, iii) Le marquage des amines primaires précédemment désacétylées dans l’étape 2 par le réactif RAQIAT pour permettre leurs identifications et quantifications. Ce manuscrit a porté en partie sur les deux premières étapes de la méthode RAQIAT.Dans la première étape, les échantillons de protéines de levure ont été digérés puis di-méthylés et fractionnés par OFFGEL en 24 fractions. Ensuite, chacune de ces 24 fractions OFFGEL a été soumise à un fractionnement nano-RPLC et analysée par MALDI TOF/TOF (4800 MALDI-TOF/TOF, Sciex). En parallèle, la même expérience a été réalisée, cette fois-ci sans di-méthylation. L'analyse des données a été réalisée en utilisant le logiciel Mascot comme moteur de recherche.L’efficacité de la réaction de di-méthylation démontrée, nous avons montré que sans réaliser la di-méthylation réductrice 164 sites acétylés ont pu été identifiés alors que 385 sites acétylés distincts ont été identifiés avec la di-méthylation réductrice. De plus, l'amélioration de la détection de l'acétylation en utilisant la méthode de di-méthylation a été observée pour chacune des différents types acétylations: N-ter, K- et O-acétylation.Dans la deuxième étape, nous avons présenté des résultats préliminaires de déacétylation par la sirtuine 1 en présence du peptide de la p53 (Ac-Arg-His-Lys-Lys-(Ac)-AMC) connu comme étant un substrat de cette enzyme. Nous avons observé la formation d’un peptide non acétylé, suggérant une déacétylation de ce peptide acétylé de p53. Cependant, la formation de cet ion étant très faible et l’ion acétylé étant fortement préservé, nous en avons conclu que l’efficacité de la déacétylation du peptide de p53 n’était pas suffisante pour l’intégrer à la méthode RAQIAT. / Protein acetylation is one of the most widespread post-translational modifications which is involved in many cellular physiologies and pathologies such as cancers. Regarding the important biological effect of protein acetylation and a non-negligible number of proteins bearing this PTM, several methods emerged last decade to investigate such PTM. But the detection of acetylations and their quantification are still limited and enrichment method allowing a better detection of acetylation target mostly one kind of acetylation (K-acetylation). To improve the detection of the three kind of acetylation (N-ter, K, and O-) and their quantification, we propose the RAQIAT method (Relative Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag), based on protein digestion followed by 3 steps : i) a protection of free primary amines at N-ter, lysine (i.e. primary amine not bearing PTM) based on a reductive di-methylation strategy ii) a deacetylation of acetylated residues to obtain free primary amine corresponding to peptides previously acetylated iii) a RAQIAT labeling on the free primary amine obtained in the previous step to allow the enrichment of peptides previously acetylated and their quantifications. Herein, we present the investigation of the two first steps of RAQIAT method.In the first step, we evidenced that the reductive di-methylation strategy improved the detection of the three kind of acetylation: N-ter, K- and O- acetylations. Yeast protein samples were digested with trypsin prior di-methylation of resulting peptide mixture. Then, di-methylated peptide mixtures were fractionated by OFFGEL and reverse phase liquid chromatography followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis. Data analysis was performed by using Mascot as search engines.Our results showed that OFFGEL fractionation is a useful step to increase detection of acetylations. Moreover, we showed that our di-methylation treatment improved significantly detection of acetylation. Indeed, after di-methylation treatment, 385 unique acetylated sites were identified while 164 unique acetylated peptides were detected without di-methylation treatment. The improvement of acetylation detection using our di-methylation strategy is observed for each of acetylations: N-ter, K- and O-acetylations. Thus, this new proteomic method is promising to enhance N-ter, K- and O-acetylation detection.In the second step, we presented preliminary results of deacetylation by sirtuin 1 in the presence of p53 peptide (Ac-Arg-His-Lys-Lys- (Ac) –AMC. However, the low deacetylation efficiency of the p53 peptide observed, conclude that is not suitable to applicate into RAQIAT Method

Dans les pays industrialisés, les rétinopathies ischémiques proliférantes telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de cécité chez les individus en âge de travailler et la population pédiatrique. Ces pathologies sont caractérisées par une dégénérescence microvasculaire initiale suivie d’une hyper-vascularisaton compensatoire disproportionnée et pathologique. Les sirtuines constituent une importante famille de protéines impliquées dans le métabolisme et la réponse au stress. Plus particulièrement, sirtuine 3 (SIRT3) est une déacétylase mitochondriale primordiale qui agit au cœur du métabolisme énergétique et de l’activation de nombreuses voies métaboliques oxydatives. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’une déficience en SIRT3 diminue la sévérité des lésions vasculaires dans le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). En plus de stimuler l’angiogénèse, l’absence de SIRT3 est aussi associée à une augmentation de la glycolyse, possiblement en activant la famille de gènes 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). Nous suggérons que le manque de SIRT3 est impliqué dans l’effet Warburg et procure ainsi un avantage prolifératif et protecteur dans l’OIR. La présente étude propose SIRT3 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle dans la rétinopathie du prématuré, une maladie dont les complications désastreuses persistent tout au long de la vie. / Proliferative ischemic retinopathies such as proliferative diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity (ROP) are the leading causes of blindness in working age and pediatric populations in industrialized countries. These pathologies are characterized by an initial microvascular degeneration followed by a disproportionate compensatory but pathological hyper-vascularization mounted by the hypoxic and energy deficient retina in an attempt to reinstate metabolic equilibrium. Sirtuins are an important family of protein involved in metabolism and stress response. Sirtuin 3 (SIRT3) in particular is a major mitochondrial deacetylase central to energy metabolism and the regulation of many oxidative pathways. For the first time, our results show that a lack of SIRT3 decreases the severity of vascular lesions in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Deficiency in SIRT3 not only stimulates angiogenesis, but also increases glycolysis, possibly through indirect activation of the gene family 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). We suggest that a lack of SIRT3 is involved in the Warburg effect and therefore confers a proliferative advantage that is protective in OIR. The present study puts forward SIRT3 as a new potential therapeutic target for ROP, a disease leading to life-long vision complications.