Les cytochromes P450s (CYPs) sont des hémoprotéines intervenant dans la fonction de détoxication cellulaire. Le site actif des CYPs est enfoui dans la protéine, mais accessible aux ligands par des canaux. A l'aide d'une méthode récente basée sur la triangulation de Delaunay de la protéine, et implémentée dans le logiciel CCCPP, nous avons modélisé géométriquement ces canaux pour plusieurs isoformes humaines, dont le 3A4, présent au niveau du foie humain et responsable de la métabolisation d'un nombre important de médicaments, afin de constituer un filtre stérique destiné au criblage virtuel rapide de chimiothèques. Cette approche nous a permis d'obtenir des informations sur les mécanismes d'ouverture et de fermeture des canaux, permettant d'expliquer comment des ligands volumineux peuvent accéder au site actif. Ces résultats confirment et étendent ceux de la littérature, et peuvent contribuer à l'élaboration de médicaments nouveaux ou ayant moins d'effets secondaires. / The cytochromes P450s (CYPs) are hemoproteins involved in the cellular detoxification function. The CYPs active site is buried inside the protein, but it can be accessed by the ligands through channels. With a recent method based upon the Delaunay triangulation of the protein, and implemented in the CCCPP software, we modelized geometrically these channels for several human isoforms, including the 3A4, located in the human liver and responsible of the metabolization of an important number of drugs, in order to build a sterical filter devoted to high throughput virtual screening of chemical libraries. This approach let us to get information on mechanisms of opening and closing of the channels, allowing to explain how large ligands can access to the active site. These results are in agreement and extend those found in the literature, and can contribute to the design of new drugs or of drugs having less side effects.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La phase initiale (de quelque fractions de seconde à quelques minutes) de la polymérisation catalytique des oléfines est encore peu comprise. Elle est pourtant reconnue comme une étape cruciale pour contrôler la morphologie de la particule de polymère et pour garantir la performance optimale du catalyseur et une certaine stabilité thermique du procédé. Ce travail présente l'étude et l'optimisation d'un mini réacteur à lit fixe pour mener des polymérisations catalytiques en phase gaz avec des durées très faibles (minimum 0.1s) dans des conditions proches à celles utilisées industriellement. La possibilité de suivre la température du gaz et de récupérer les particules de polymère pour les caractériser permet de décrire d'une façon complète le comportement du catalyseur au début de la réaction. L'étude a été limitée à la polymérisation de l'éthylène (avec un catalyseur métallocène supporté sur silice) et l'attention a été particulièrement mise sur la relation entre transfert de chaleur de la particule et performance du catalyseur. Il a été montré que des températures trop élevées peuvent être responsable localement de la modification du comportement du site active et de l'altération des propriétés des polymères. Un choix adéquat des conditions de réaction permet de suivre indirectement l'évolution de la température des particules en mesurant celle de la phase gaz. Dans un deuxième temps différents métallocènes ont été utilisés pour étudier l'influence des conditions de réaction, de la préparation du catalyseur et des propriétés du support sur l'activité, les propriétés du polymère et la morphologie des particules au temps court. Une attention particulière a été portée sur l'évolution des sites actifs et sur la cristallisation des chaînes de polymère dans un support poreux en évolution. Une activité élevée a été mesurée dans les premières cinq secondes et les températures de fusion et cristallisation des polymères ont été utilisées comme sondes pour mesurer l'avancement de la fragmentation du support. Les résultats ainsi obtenus peuvent non seulement clarifier certains aspects clé du début de la polymérisation mais aussi être utilisés comme donnés de départ pour modéliser la particule en croissance et contribuer à réduire l'écart qui est actuellement présent entre comportement réel du catalyseur et prédictions des modèles / The early stages (from less than 1s to few minutes) of catalytic olefin polymerization are still fairly understood even if they are nowadays recognized to be crucial for the determination of the morphology of the polymer particle, the optimization of the whole catalyst performance and the thermal stability of the process. In this work we will present how we studied and optimized a specially conceived packed bed reactor to perform gas phase catalytic olefin polymerizations as short as 0.1s under industrially relevant conditions. The possibility to measure the reactor temperature and to recover unaltered the polymer particles allows to take a complete picture of the catalyst behavior at the reaction start-up. The study will be restrained to ethylene polymerization with silica supported metallocenes and special attention will be given to the relation between heat transfer from the growing particle and catalyst performance. It will be seen how particle temperature evolution can be followed indirectly by measuring the gas phase temperature .In the second part of this work different metallocene complexes will be used to study the influence of process conditions, catalyst preparation method and support properties on the evolution of reaction rate, and polymer MWD during the first reaction seconds. Special attention will be given to the active site evolution during the transient phase and it will be shown that temperature excursions can be responsible for a local variation in active site behavior thus altering the properties of the formed polymer. The last section will be dedicated to the study of the peculiar crystallization behavior of the polymer chains in an evolving inorganic support. It will be shown how the melting and crystallization temperatures of the polymers can be used as “sensors” to measure the degree of fragmentation of the support particle. The results obtained in this work allow to gain a deeper understanding of the key parameters for the polymerization start-up and can be used as input for single particle models thus allowing to reduce the gap actually present between real catalyst behavior and model predictions

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La détermination des structures tertiaires des protéines par rayons X a pour but de nous apporter des connaissances détaillées sur leur repliement et de comprendre la relation entre leur structure et leur fonction. Nous allons montrer par la présente étude comment la cristallographie jumelée à la mutagenèse dirigée peut être utilisée dans la détermination et la compréhension du mécanisme enzymatique de l'aldolase du muscle de lapin. Les différentes mutations générées visent des acides aminés qui sont, dans la plupart des cas, situés dans le site actif et qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique. Certains mutants de l'aldolase du muscle sont analysés par des méthodes cristallographiques, cinétiques, enzymatiques et d'échanges isotopiques. L'enzymologie nous a permis de déterminer les paramètres cinétiques de ces mutants, afin d'établir leur rôle dans la réaction enzymatique. L'étude structurale permet d'avoir une vision directe des types d'interactions au sein d'une enzyme. L'interprétation des données structurales associée aux données cinétiques permet d'analyser avec pertinence la fonction des résidus impliqués dans le mécanisme catalytique de l'aldolase du muscle de lapin. Dans le but de connaître l'implication de certains résidus dans le mécanisme catalytique, nous nous sommes focalisés sur l'étude structurale de plusieurs mutants. Les principaux intérêts de ce travail consistent à connaître si la perte d'activité est directement liée à la mutation ou à un changement global de la structure engendrée par celle-ci, à déterminer la structure mutante formant un complexe avec le substrat ou le produit de la réaction catalytique ainsi qu'a connaître le lien entre l'affinité pour le substrat et un acide aminé bien spécifique. La réponse à toutes ces questions nous a amenés à la résolution des structures cristallographiques de certains mutants. La cristallographie qui donne une vision directe des interactions entre les acides aminés est un puissant outil qui nous renseigne sur la nature et le mode d'action des résidus. Les résultats structuraux nous ont permis de tirer plusieurs conclusions sur la relation structure/fonction de cette enzyme et de déterminer la nature et le rôle des résidus impliqués dans la catalyse, ainsi que ceux impliqués dans sa conformation. Ces méthodes nous ont également permis de proposer un nouveau modèle du mécanisme enzymatique. Nous discuterons aussi des problèmes liés à la cristallisation des protéines et les méthodes récentes appliquées pour les contourner.

Ce travail a pour cadre l'étude de la récupération des métaux précieux complexes en solution grâce a du charbon actif. Il a permis de comprendre les mécanismes fondamentaux de l'adsorption dans un système modèle constitue d'une solution d'ion dicyanoaurate et de charbon actif. Les interactions entre cette solution et le solide ont été caractérisées par diverses techniques: la pHmétrie, la titrimétrie, la zetamétrie, la potentiométrie et la thermodésorption. Ces méthodes ont permis d'avoir des renseignements sur la nature des groupements fonctionnels à la surface du charbon, groupements constituant les sites responsables de l'adsorption des complexes. De même par une méthode de traitement originale gaz-liquide-solide, nous avons modifié la nature de ces sites et leur répartition à la surface du charbon, ce qui a permis d'améliorer la capacité d'adsorption du charbon. Cette modification dépend de la nature et de la pression du gaz utilise. L'étude thermodynamique a montré que l'adsorption de l'ion dicyanoaurate sur le charbon peut être représentée assez correctement par l'équation de Langmuir généralisée à plusieurs types de sites. L'adsorption s'effectue de façon plutôt localisée, avec interaction sur des sites d'énergie différente. La vitesse d'adsorption de l'ion dicyanoaurate sur le charbon actif a été étudiée en fonction de plusieurs paramètres physico-chimiques: la température, les conditions hydrodynamiques comme la vitesse d'agitation et le rapport solide/liquide, la concentration initiale en complexe, la nature des substances étrangères, et la nature du gaz en contact avec la solution. Le mécanisme d'adsorption se déroule en trois étapes. La réaction limitante est la diffusion à travers un film pendant le début de la réaction, puis la diffusion-adsorption dans la structure poreuse au voisinage de l'équilibre.

Les protéines à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM) utilisent un centre [Fe4S4] réduit pour initier le clivage réductive homolytique de la SAM et la formation d'une espèce hautement réactive - le radical 5'-déoxyadénosyl ou 5'-dA•. Dans la quasi-totalité de cas ce radical alkyl va arracher un atome d'hydrogène sur le substrat et déclencher ainsi sa conversion en produit. On trouve ces enzymes au niveau d'étapes clé de la synthèse de certaines vitamines, antibiotiques, précurseurs de l'ADN ou encore cofacteurs protéiques où elles sont souvent impliquées dans le clivage ou la formation des liaisons C-C, C-N, C-S ou encore C-P. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont été focalisés sur l'étude structurale et fonctionnelle de la protéine HydE ; une enzyme à radical SAM, qui intervient dans la biosynthèse du site actif organométallique de l'hydrogénase à [FeFe]. L'objectif principal était d'identifier le substrat de HydE et d'étudier les détails du fonctionnement d'une protéine à radical SAM. Nous avons réussi à identifier un groupe de molécules, dérivées de la cystéine, contentant un cycle thiazolidine avec un ou deux groupements carboxylates, qui ont une très bonne affinité pour le site actif de HydE. Certains de ces ligands se sont montrés d’être des substrats non physiologiques de l’enzyme. Grâce à ces substrats nous avons pu mettre en évidence un nouveau mécanisme d’attaque radicalaire dans les protéines à radical SAM. En effet, dans HydE nous avons observé une attaque directe du radical 5'-dA• sur l’atome soufre du thioéther appartenant au cycle thiazolidine. Cette réaction constitue un exemple pas comme les autres d’une insertion d’un atome de soufre (ou de sélénium) catalysée par une enzyme à radical SAM. Il s'agit également d'une première observation d'une réaction radicalaire dans les cristaux protéiques d'une enzyme à radical SAM et également un premier suivi en temps réel par la RMN du 13C et 1H de l'accumulation d'un des produits de la réaction catalysée par ces enzymes. Les résultats de calculs théoriques basés sur nos structures cristallographiques de haute résolution suggèrent que dans le cas de cette superfamille de protéines le radical 5'-dA• serait plutôt un état de transition et donc pas une espèce intermédiaire isolable. / Radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) proteins use a reduced [Fe4S4] cluster to initiate homolytic reductive cleavage of SAM, which leads to the formation of highly reactive 5'-deoxyadenosyl radical species or 5'-dA•. In almost all cases this alkyl radical will abstract a hydrogen atom from the substrate and thus trigger its conversion into product. These enzymes are found in key steps of the synthesis of certain vitamins, antibiotics, DNA precursors or protein cofactors. They are often involved in the cleavage or formation of C-C, C-N, C-S or C-P bonds. The present thesis work has been focused on the structural and functional study of HydE protein; a radical SAM enzyme, involved in the biosynthesis of the organometallic active site of [FeFe]-hydrogenase. The main goal was to identify the substrate of HydE and to study details of how radical SAM proteins control the highly oxidizing 5'-dA• species. We managed to identify a group of molecules, derived from cysteine, containing a thiazolidine ring with one or two carboxylate groups, which have a very good affinity for the active site of HydE. We have demonstrated some of these ligands are non-physiological substrates of the enzyme. With these substrates we could highlight a new radical attack mechanism in radical SAM proteins. Indeed, in HydE we observed a direct attack on the 5'-dA • radical on the sulfur atom of the thioether belonging to the thiazolidine ring. This is an unprecedented reaction that contrasts with sulfur (or selenium) atom insertion reactions catalysed by some radical SAM enzymes. This is also the first observation of a radical reaction in the protein crystal of a radical SAM enzyme and also the first real-time monitoring by 1H- & 13C-NMR spectroscopy of the accumulation of products of the reaction catalysed by these enzymes. Theoretical calculations based on our high-resolution crystal structures suggest that in the case of this protein superfamily the 5'-dA• radical, which triggers the reaction in radical SAM enzymes, is a transition state and therefore not an isolable intermediate species.

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie. / The Neurospora VS ribozyme catalyzes the cleavage and the ligation of a specific phosphodiester bond, which is essential for its replication cycle. It is formed of six helical regions (I to VI) that are divided in two domains: the substrate (SLI) and the catalytic domain (stems II-VI). The latter contains two three-way junctions that allow recognition of the stem-loop substrate in a specific manner. This unique mode of substrate recognition could be exploited to target folded RNAs for diverse applications. Even though the VS ribozyme has been extensively characterized biochemically, no high-resolution structure of the complete ribozyme has been published yet and this limits our mechanistic understanding. A divide-and-conquer approach was previously initiated to study the structure of the important subdomains of the VS ribozyme by nuclear magnetic resonance (NMR), but this approach needs to be completed. In this thesis, the structures of the A730 loop, the III-IV-V junction and the II-III-VI junction were determined by heteronuclear NMR spectroscopy. Moreover, a unique NMR approach was developed for localizing divalent metal ions, whereas several isotope-labeling strategies were implemented to facilitate the study or large RNA molecules. The NMR structures of the A730 loop and the two three-way junctions reveal that these subdomains are well defined, that they are formed by several recurrent structural elements (U-turn and S-turn motifs, base triples and coaxial stacking) and that they contain several metal-binding sites. Interestingly, structural similarities were identified between the VS and hairpin ribozymes, which allowed the modeling of the VS ribozyme active site. In summary, these studies significantly contribute to a better understanding of the global architecture of the VS ribozyme. In addition, they will allow the construction of a high-resolution model of the complete VS ribozyme and facilitate future engineering studies.