A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja. / Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-24T13:28:16Z No. of bitstreams: 1 2013_RenataVelozoTimbo.pdf: 2501758 bytes, checksum: 6ee87597dc68793f24d62de2a6d2af46 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-24T14:22:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RenataVelozoTimbo.pdf: 2501758 bytes, checksum: 6ee87597dc68793f24d62de2a6d2af46 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-24T14:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RenataVelozoTimbo.pdf: 2501758 bytes, checksum: 6ee87597dc68793f24d62de2a6d2af46 (MD5) / Atualmente a soja é uma das culturas mais importantes para o agronegócio nacional devido aos seus múltiplos usos, e tem na região Centro-Oeste a maior produção do país. Este trabalho de mestrado visou avaliar a resposta adaptativa bioquímica de duas variedades de soja sob herbivoria do percevejo-marrom (Euschistus heros), importante praga da cultura, através (i) da quantificação da atividade de determinadas enzimas do sistema antioxidante (guaiacol peroxidase, catalase, ascorbato peroxidase e lipoxigenase 3) e da (ii) identificação de enzimas envolvidas em vias metabólicas chaves através de análise proteômica. Duas variedades de soja, uma que é considerada resistente à herbivoria do percevejo (IAC-100), e outra susceptível (Silvânia) em estágio V3, foram expostas à herbivoria por 96 h, das quais as folhas foram coletadas em intervalos de 24 h. A variedade Silvânia foi a que apresentou significativa diferença na resposta antioxidante durante a herbivoria do percevejo-marrom. Exceto para a ascorbato peroxidase, todas as demais enzimas apresentaram atividade variada ao longo do tempo de herbivoria, evidenciando assim uma maior resposta ao estresse gerado pela herbivoria do percevejo-marrom. Adicionalmente, essa variedade apresentou, em média, 386 proteínas foliares totais, das quais 17 tiveram seu nível de expressão alterado quando em herbivoria. Dentre as proteínas com expressão diferenciada estão a CP4EPSPS (enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintase), a proteína rica em glicina do tipo 2b, e as chaperonas de 20 e 70 kDa. A variedade IAC-100 não apresentou modificações nas atividades das enzimas antioxidantes estudadas e apresentou em média 191 proteínas foliares totais, das quais 10 tiveram seu nível de expressão alterado em função da herbivoria - foram identificadas a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e a enzima rubisco. A interpretação da função das proteínas diferencialmente expressas, aliada aos resultados do sistema de defesa antioxidante, possibilitou compreender melhor os mecanismos bioquímicos de resistência/susceptibilidade nas duas variedades de soja, assim como dar maior embasamento à proposta de que a IAC-100 é mais resistente à herbivoria do percevejo-marrom. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Currently soy is one of the most important crops for agribusiness because of its multiple uses, and has in the Midwest the biggest production of the country. This master thesis was to evaluate the biochemical adaptive response of two soybean varieties under herbivory brown stink bug (Euschistus heros), an important pest of culture through (i) the quantification of the activity of certain enzymes of the antioxidant system (guaiacol peroxidase, catalase , ascorbate peroxidase and lipoxygenase 3) and (ii) identification of enzymes involved in key metabolic pathways through proteomic analysis. Two soybean varieties, one that is considered resistant to herbivory stink bug (IAC-100), and another capable (Silvânia) V3 stage were exposed to herbivory by 96 h, the leaves of which were collected at intervals of 24 h. The variety Silvânia showed the significant difference in antioxidant response during herbivory brown stink bug. Except for ascorbate peroxidase, all other enzymes showed activity varied over time from herbivory, thus revealing a greater stress response generated by herbivory of the brown stink bug. Additionally, the variety show, in average, 386 total leaf proteins, of which 17 had their expression level changed when herbivory. Among the proteins with differential expression are CP4EPSPS (enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase), glycine-rich protein 2b-like, and chaperones 20 and 70 kDa. IAC-100 showed no changes in the activities of antioxidant enzymes studied and showed an average of 191 total leaf proteins, of which 10 had their expression level changed depending on herbivores - were identified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and the enzyme rubisco. The interpretation of the function of differentially expressed proteins, coupled with the results of the antioxidant defense system, enabled a better understanding of the biochemical mechanisms of resistance / susceptibility in two soybean varieties, as well as giving greater basis for the proposal that the IAC-100 is more resistant herbivory of the brown stink bug.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-02T16:30:42Z No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-21T14:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T14:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / A soja é a oleaginosa mais cultivada no mundo e possui um papel importantíssimo na alimentação humana. Além da importância direta na nutrição da população mundial, esse grão é também utilizado de diversas outras formas como, por exemplo, na produção de óleo, ração animal e biocombustíveis. Devido a esses aspectos a soja tornou-se muito importante na economia mundial e é o produto agrícola mais exportado no Brasil. Dentre os aspectos limitantes para a cultura estão as doenças, entre elas, a podridão vermelha da raiz (PVR) que é responsável por grandes perdas na produtividade da soja. Como agentes causais dessa doença são consideradas quatro espécies de Fusarium: F. brasiliense, F. cuneirostrum, F. tucumaniae e F. virguliforme. Através de uma coleção de isolados de Fusarium spp. oriundos de diversas regiões produtoras de soja no Brasil, foi desenvolvido esse projeto, que teve como objetivo verificar a variabilidade genética desses isolados, bem como a severidade causada pela PVR em cultivares de soja moderadamente resistente e suscetível a essa doença. Através dos testes de severidade ficou comprovado que todos isolados causaram danos significativos no sistema radicular das plântulas. Para avaliação da variabilidade genética dos isolados, foram realizados análises de polimorfismos de DNA amplificado ao acaso (RAPD). Onde se constatou uma grande diversidade genética entre os isolados e uma tendência clara de separação em dois grupos principais das duas espécies prevalecentes no Brasil, F. tucumaniae e F. brasilense. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Soybean is the crop most widely grown in the world and has an important role in human nutrition. Besides the direct importance in the nutrition of the world population, this grain is also used in many other ways, such as in oil production, animal feed and production of biofuels. Due to these factors, soybean became important in the global economy and is the most exported agricultural product in Brazil. The diseases are among the limiting factors on soybean production. One of these diseases is the sudden death syndrome (SDS) that is responsible for losses on crop yield. As causative agents of disease, four species of Fusarium are considered pathogens: F. brasiliense, F. cuneirostrum, F. tucumaniae and F. virguliforme. This work was conducted by studing a collection of Fusarium spp. from different soybean-producing regions in Brazil. The main objective of the research was to determine the genetic variability of these isolates as well as the severity caused by the SDS on cultivars moderately resistant and susceptible to the disease. The tests of disease severity, throughout artificial inoculation, have shown that all isolates caused significant damage in the seedling root system. To assess the genetic variability of isolates were carried out analysis of polymorphisms of DNA randomly amplified (RAPD). RAPD analysis demonstrated a great genetic diversity among the isolates and a clear tendency to split into two main species-groups, F. tucumaniae and F. brasilense, both species prevalent in Brazil.

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja, entretanto, fatores bióticos e abióticos representam ameaças à cultura causando sérios danos, com significativo impacto econômico. Dentre os problemas fitossanitários destacam-se o percevejo-marrom Euschistus heros e a ferrugem asiática. Para o controle biológico do percevejo, o parasitóide Telenomus podisi tem sido referido como um dos agentes potenciais em programas de MIP. A temperatura média diária e a precipitação são fatores abióticos que afetam tanto à cultura da soja, quanto aos organismos a ela associados. Assim, o trabalho teve como objetivos: 1) determinar faixas de favorabilidade para o desenvolvimento de E. heros e T. podisi; 2) simular o número de gerações dos insetos e a severidade da ferrugem asiática em soja, em municípios do Rio Grande do Sul, em cenários históricos de clima, considerando o ciclo da cultivar, a data da semeadura e o momento de detecção da praga e da doença e 3) avaliar os impactos potenciais das mudanças climáticas sobre estes organismos por meio do mapeamento de risco em cenários de clima futuros projetados pelos modelos globais do IPCC (média de 15 modelos). O trabalho considerou duas abordagens de simulação do efeito do clima sobre o desenvolvimento destes organismos. Na primeira, simulou-se os efeitos da variabilidade climática anual com dados de séries históricas de clima sobre o desenvolvimento dos organismos, por meio da integração de modelos bioclimáticos e, de simulação da cultura, considerando-se a época de semeadura, o momento de detecção e o ciclo da cultivar. Na segunda abordagem os modelos bioclimáticos foram integrados a sistemas de informações geográficas com dados de clima futuro, gerando mapas de favorabilidade para ocorrência dos insetos e da severidade da doença. E. heros apresentou melhor desenvolvimento na temperatura de 26º a 28ºC; maior número de gerações na data de semeadura mais precoce, na cultivar de ciclo médio e no momento de detecção em R1, variando de duas a três gerações. A temperatura muito favorável ao desenvolvimento de T. podisi foi de 20º a 28ºC; o número de gerações variou de três a seis, sendo mais encontrado no plantio mais precoce. Para a ferrugem asiática, não houve tendência de variação significativa dos níveis de severidade em função dos parâmetros avaliados. Os cenários de clima projetados para o futuro indicam um aumento na área favorável ao estabelecimento de E. heros e T. podisi e na severidade da ferrugem asiática em relação ao clima atual, diretamente relacionados às potenciais mudanças nas condições médias de temperatura e precipitação conforme apontadas pelos cenários do IPCC. / Brazil is the second largest soybean producer, however, biotic and abiotic factors affect the crop, causing serious damage, with significant economic impact. Among these problems, Euschistus heros and asian soybean rust. For biological control of the insects, the parasitoid Telenomus podisi has been described as one of the potential agents in MIP programs. The daily average temperature and precipitation are both environmental factors that affect the soybean crop, and its associated organisms. Thus, the study aimed to: 1) determine ranges of favorability for the development of E. heros and T. podisi; 2) simulate the number of generations of insects and severity of asian soybean rust on soybeans in municipalities of Rio Grande do Sul, historical weather scenarios, given the cycle of the cultivar, sowing date and time of pest and disease detection and 3) assess the potential impacts of climate change on these organisms by mapping risk in future climate scenarios projected by the IPCC global models (average of 15 models). The study considered two approaches for simulating the effect of climate on the development of these organisms. It was simulated the variability of climate effects with data from annual time series of climate on the development of organisms through the integration of bioclimatic models and simulation of culture, considering the time of sowing, time of detection and the cultivation cycle. In the second approach bioclimatic models were integrated into geographic information systems with future climate data, generating maps of favorability for the occurrence of insects and disease severity. E. heros showed better development at 26º to 28ºC, high number of generations in the early sowing date, at medium maturity cultivar and time of detection in R1, ranging from two to three generations. The temperature most favorable to the development of T. podisi was 20º to 28º C, the number of generations ranged from three to six, the most found in the earlier planting. For asian soybean rust, no significant trend of variation in levels of severity depending on the parameters. The climate scenarios projected for the future indicate an increase in the area favored the establishment of E. heros and T. podisi and severity of asian soybean rust in relation to the current climate, directly related to potential changes in average conditions of temperature and precipitation as noted by the IPCC scenarios.

A soja (Glycine max) destaca-se pela importância econômica e pela capacidade de associação simbiótica com bactérias (Bradyrhizobium spp e Sinorhizobium spp) fixadoras do dinitrogênio. O benefício da fixação biológica do nitrogênio (FBN) é potencializado pela inoculação. Entretanto, a resposta à inoculação depende de fatores bióticos e abióticos, que variam de acordo com o sistema de manejo do solo. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a resposta à inoculação e reinoculação da soja, além da sobrevivência e a competitividade das estirpes de B. elkanii (SEMIA 587 e SEMIA 5019) e de B. japonicum (SEMIA 5079 e SEMIA 5080) em diferentes sistemas de manejo do solo. O experimento, com diferentes sistemas de manejo do solo, foi iniciado em 2000, a partir de campo nativo, sendo avaliado nos anos agrícolas de 2000/2001 e 2002/2003. Os tratamentos consistiram de adubação orgânica, mineral e adubação mineral com irrigação, todos utilizando sistemas de preparo plantio direto, plantio reduzido e plantio convencional, com ou sem inoculação. Foram avaliados o teor de nitrogênio mineral do solo, o número e a massa de nódulos, a massa e o nitrogênio total do tecido da parte aérea e a produção dos grãos, além da ocupação nodular pelas estirpes inoculadas, avaliadas por soroaglutinação. A inoculação avaliada promoveu um aumento médio na produção de grãos de 200 kg ha-1 em 2000/2001 e a reinoculação de 125 kg ha-1 na parcela irrigada em 2002/2003. Teores de nitrogênio mineral do solo acima de 12 mg kg-1 determinaram redução no número e massa de nódulos. As estirpes SEMIA 587 e 5019 apresentaram maior sobrevivência e competitividade. As SEMIA 5079 e 5080 demonstraram maior dependência da inoculação. Os dados obtidos mostram que a sobrevivência e competitividade das estirpes são características pouco influenciadas pelo sistema de manejo do solo.

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação. / Aiming the increase of plant resistance to fungal disease, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (chit1) coding a chitinase from Metarhizium anisopliae in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merril]. Co-transformation was the strategy elected, in order to obtain marker-free transgenic plants in the progeny of transformed plants. Co-transformation was performed via biolistic using somatic globular embryo clusters of MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars as target tissues. Plasmid pGusHyg, containg the reporter gusA gene and the selectable marker hpt gene, was co-delivered with the pMOG463chit1 plasmid containg the chit1 gene. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 387 and 380 histodifferentiated embryos were respectively obtained from MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars. Transgenic adult fertile plants were regenerated. To evaluate the co-transformation eficiency, DNA from histodifferentiated embryos and from regenerated fertile plants was submitted to molecular analysis. Data obtained allowed us to calculate co-transformation frequencies of 44% and 50% for MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. As far as we are concerned there is no studies utilizing soybean somatic embryos for cotransformation via biolistic.

Urease (EC 3.5.1.5) é uma metaloenzima dependente de níquel que catalisa a hidrólise da ureia à amônia e dióxido de carbono. A Soja (Glycine max) produz duas isoformas de urease: a urease ubíqua (uSBU) e a urease embrião-específica (eSBU). Nosso grupo demonstrou que eSBU apresenta propriedades biológicas independentes da sua atividade ureolítica, como ativação de plaquetas, atividade inseticida e inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos, estes últimos sugestivos de envolvimento das SBUs em mecanismos de defesa da planta. Outras ureases também estudadas pelo nosso grupo, são as de Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis). O Feijão-de-porco produz três isoformas de urease: Canatoxina, JBU e JBURE-II, que também apresentam atividades biológicas, não relacionadas à sua atividade enzimática. Dentre elas, a atividade inseticida tem sido a mais estudada. A toxicidade das ureases a insetos envolve a liberação de um peptídeo interno tóxico, mediante à hidrólise por enzimas digestivas do inseto. Um peptídeo equivalente foi clonado em Escherichia coli e denominado Jaburetox. Este peptídeo apresenta um amplo espectro de ação contra insetos e toxicidade contra fungos. Nossos objetivos nessa tese foram estudar: 1) as propriedades biológicas da urease ubíqua de soja, fusionada à Glutationa S-Transferase (GST-uSBU), e 2) as propriedades estruturais do peptídeo Jaburetox. No capítulo 1 mostramos que a GST-uSBU é tóxica contra fungos filamentosos, interferindo no metabolismo secundário fúngico e na produção de pigmentos, e também foi tóxica a leveduras, induzindo mudanças morfológicas. A proteína de fusão apresentou ainda atividade inseticida e induziu agregação de plaquetas de coelho e de hemócitos de insetos. Os dados sugerem que GST-uSBU serve de modelo para o estudos futuros de propriedades biológicas de ureases de plantas. No captítulo 2, o peptídeo Jaburetox foi estabilizado em sua forma monomérica, com a utilização do agente redutor TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). O Jaburetox apresentou elevado raio hidrodinâmico, característico de uma proteína intrinsicamente desordenada. Estes dados foram confirmados através de análises de Dicroísmo Circular, de preditores de desordem (PONDR) e por Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura do peptídeo em solução foi elucidada, apresentando um motivo α-hélice na região N-terminal e duas estruturas do tipo volta, uma na região central e outra próxima da região C-terminal do peptídeo. O conhecimento da estrutura tridimensional do peptídeo será de grande importância para o entendimento do mecanismo de ação inseticida e fungitóxico do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Soybean (Glycine max) produces two urease isoforms: ubiquitous urease (uSBU) and the embryo-specific urease (eSBU). Our group demonstrated that eSBU displays biological properties independent of its ureolytic activity, such as platelets activation, insecticidal activity and inhibition of phytopathogenic fungi growth. These data suggested that soybean ureases could be involved in plant defense. Other ureases also studied by our group are jack bean (Canavalia ensiformis) ureases. Jack bean produces three isoforms of ureases, Canatoxin, JBU and JBURE-II, which also have biological properties unrelated to enzymatic activity. Among them, the insecticidal activity has been the most studied. The toxicity of ureases against insects involves hydrolysis by insect digestive enzymes and the release of a toxic internal peptide. An equivalent peptide was cloned in Escherichia coli and called Jaburetox. This peptide presents a broad spectrum of activity against insects and is also fungitoxic. In this thesis, our objectives were to study: 1) the biological properties of the soybean ubiquitous urease fused to Glutathione S- Transferase (GST-uSBU), and 2) the structural properties of the peptide Jaburetox. In chapter 1, we show that GST-uSBU is toxic against filamentous fungi, interfering on the fungal secondary metabolism, in the pigments production, and also affected yeasts, inducing morphological changes. GST-uSBU also displayed insecticidal activity and induced aggregation of rabbit platelets and insect hemocytes. Thus, this fusion protein could serve as model for future studies related to biological properties on plant ureases. In chapter 2, the peptide Jaburetox was stabilized in its monomeric form by using the reducing agent TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Jaburetox showed a large hydrodynamic radius, which is characteristic of an intrinsically disordered protein. These data were confirmed by Circular Dichroism analysis, disorder predictors (PONDR) and Nuclear Magnetic Resonance. The structure of the peptide in solution was elucidated, showing a α-helix motif in the N-terminal region and two turn-like structures, one located in the central region and another near the C-terminal of the peptide. The knowledge of Jaburetox’s three-dimensional structure is an important step towards the understanding of its insectidal and fungitoxic mode of action.

O etileno (Et) é um fitormônio importante na chamada resposta tripla em plântulas, compreendendo a inibição do alongamento caulinar, o espessamento do caule e o hábito de crescimento horizontal (perda da sensibilidade gravitrópica), além de participar na indução da abscisão foliar e na resposta à estresse. Estudos sobre a resposta da soja aos mais diversos tipos de estresse têm emergido dentre a comunidade científica brasileira, uma vez que esta cultura é de grande importância econômica ao país. Tendo em vista o papel descrito das respostas desencadeadas por etileno em diversas espécies vegetais, este trabalho descreveu in silico a rota de biossíntese deste fitormônio e da sinalização por ele mediada em soja, utilizando recursos disponibilizados por banco de dados públicos e pelo Projeto GENOSOJA (Consórcio Brasileiro do Genoma da Soja), que disponibilizou dados moleculares relacionados à genômica, transcriptômica e proteômica desta leguminosa sob diversas condições de estresse. Com auxílio de ferramentas de bioinformática foram identificados 502 genes em soja, divididos em três grupos: (i) biossíntese de etileno, (ii) transdução de sinal por ele mediada e (iii) fatores de transcrição da superfamília AP2/ER. Análises posteriores possibilitaram a avaliação da possível ortologia das proteínas de soja identificadas por experimentos in silico de BBH (Best Bidirectional Hit), mostrando uma maior proximidade filogenética com Arabidopsis thaliana. A associação destes dados propiciou a elaboração de modelos in silico da biossíntese de etileno e da sinalização por ele mediada em soja, onde foram identificados elementos conservados principalmente com A. thaliana. Além disso, a análise do banco de dados fornecido pelo Projeto GENOSOJA possibilitou identificar em transcriptomas de raízes e folhas de cultivares de soja cultivadas em sistema hidropônico e submetidas à déficit hídrico a expressão diferencial de cerca de 24,00 % dos genes caracterizados. A regulação transcricional destes genes foi estudada pela análise de seus possíveis promotores, onde foram identificadas in silico 29 famílias de elementos cis-atuantes importantes na regulação mediada por etileno e em possíveis interconecções com a sinalização mediada por outros fitormônios, como ácido jasmônico, ácido abscísico, auxinas e brassinoesteróides. Estes dados, associados com a avaliação dos níveis de ACC livre e produção de etileno, possibilitaram melhor compreensão em nível molecular da importância deste fitormônio em soja nas condições analisadas e a sua possível participação em respostas desta commodity à seca. / The ethylene (Et) is the phytohormone known for the seedlings triple response, comprising the inhibition of shoot elongation, the stem thickness and the habit of horizontal growth (loss of gravitropic sensitivity). Ethylene also participates in the induction of leaf abscission and in response to stress. Studies about soybean response to various types of stress have emerged among the Brazilian scientific community since this crop is extremely relevant to the country. Considering the described role triggered by ethylene responses in several plant species, this work described in silico the biosynthesis and signaling pathways mediated by this gas in soybean, using resources provided by public databases and GENOSOJA (Brazilian Soybean Genome Consortium) project. The study expanded the molecular data related to genomics, transcriptomics and proteomics known of this plant under several stress conditions. With the aid of bioinformatics tools, we identified 502 genes in soybean, divided into three groups: (i) ethylene biosynthesis, (ii) signal transduction mediated by this gas, and (iii) AP2/ERF transcriptional factors superfamily. Subsequent analyzes of BBH (Best Bidirectional Hit) experiments enabled the evaluation of the possible protein orthology encoded by these genes, showing phylogenetic proximity with Arabidopsis thaliana. The combination of these data propitiated the development of soybean ethylene biosynthesis and signaling in silico models, which were identified preserved elements mainly with A. thaliana. Furthermore, GENOSOJA database analysis allowed to identify the differential expression of 24, 00% of these genes in soybean transcriptomes, as the crop was initially grown in hydroponic system and then submitted to water deficit. In addition, the transcriptional regulation of these genes was studied by analyzing its putative promoters, in which were identified, in silico, 29 families of cis-acting elements. These elements are important for ethylene-mediated regulation and its possible interconnections with other signaling pathways mediated by other plant hormones, such as jasmonic acid, abscisic acid, auxin and brassinosteroids. Thereby, this study, combined with assessing the abundance of free ACC and ethylene production, allowed a better understanding of ethylene importance at a molecular level in this crop, and its possible participation in responses to drought.

A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja. / Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.

A inoculação de rizóbios em espécies leguminosas já é bastante conhecida e levou o Brasil a um avanço na produção de soja. Para garantir a qualidade desses produtos inoculantes é necessário o desenvolvimento de metodologias específicas. A detecção das estirpes constantes na embalagem no produto comercial e em solo e planta inoculada é uma forma de fiscalizar a qualidade do produto. Para tanto os objetivos deste trabalho foram detectar a presença das estirpes de bradirrizóbios recomendadas para a cultura da soja SEMIA 5079 e 5080 (Bradyrizobium japonicum) e SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii), que devem estar presentes nas formulações de inoculante comerciais, usando-se a técnica de REP- PCR. Detectar a presença destas estirpes em nódulos de plantas de soja inoculadas e em solo de área cultivada. Foi instalado um experimento com soja em vasos, na casa de vegetação. A soja foi inoculada com as estirpes de Bradyrhizobium e com inoculantes comerciais. Os nódulos foram utilizados para a extração de DNA. Também foi realizada extração de DNA de amostras de solo cultivado com soja e de nódulos de soja coletados do campo e de estirpes puras e produto inoculante. As extrações foram realizadas com os Kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) e Power Soil. Após foi realizada a amplificação do DNA genômico utilizando-se a técnica de REP - PCR com o primer iniciador BOX A1 e com o primer ERIC 1 e ERIC2. O perfil de bandas da amplificação do DNA genômico da mistura de estirpes pela PCR com os oligonucleotideos iniciadores ERIC e BOX A possibilitou a diferenciação de produtos contendo misturas de estirpes diferentes. Nas condições deste trabalho, a técnica de amplificação pela PCR com BOXA1 ou ERIC do DNA de nódulos de plantas inoculadas não se mostra adequada para a identificação das estirpes de rizóbios que induziram a formação destes nódulos em plantas de soja cultivada em casa de vegetação.Não ocorreu a amplificação do DNA extraído de amostras de solo cultivado com soja pela reação em cadeia da polimerase com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A e ERIC. A amplificação pela PCR com BOXA1 do DNA extraído de nódulos de plantas cultivadas a campo apresenta baixa similaridade com os obtidos das amostras de produtos inoculantes comerciais utilizados e não permite a identificação da mistura de estirpes que foram inoculadas nas plantas. / Inoculation of rhizobia in legume species is very well known and led Brazil to advance in soybean production. To ensure the quality of these inoculant products is necessary to develop specific methodologies. The detection of strains contained in packaging of the commercial product and in soil and plant inoculated is a way to monitor the quality of the product. Therefore the objectives of this study were to detect the presence of “bradirrizóbios” strains recommended for soybean SEMIA 5079 and 5080 (Bradyrizobium japonicum) and SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii) that must be present in the formulations of commercial inoculant, by using the technique of REP-PCR. To detect the presence of these strains in inoculated nodules of soybean plants into soil and cultivated area, an experiment was set up with soybeans in pots in a greenhouse. Soybeans were inoculated with the strains of Bradyrhizobium and commercial inoculants. The nodules were used for DNA extraction. Additionally it was carried out DNA extraction from soil cultivated with soybeans and soybean nodules collected from the field and pure strains and inoculant product. The extractions were performed with the following kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) and Power Soil. Afterwards was performed the amplification of the genomic DNA using the technique of REP - PCR primer with the starting primer A1 and with the primer ERIC1 and ERIC2. The profile of the bands’ amplification of the genomic DNA from the mixture of strains by PCR with primer ERIC and BOX A allowed to differentiate products containing mixtures of different strains. In this study conditions, the technique of PCR amplification with the BOXA 1 or ERIC of DNA from nodules of inoculated plants, is inadequate for the identification of strains of rhizobia, which induced the formation of nodules on soybean plants grown in greenhouse. It was not observed amplification of DNA extracted from soil samples cultivated with soybeans by PCR with primer BOX A and ERIC. Amplification by PCR with BOXA 1 of the DNA extracted from plants’ nodules grown in a field has low similarity with the product samples obtained from commercial inoculants used and it does not allow the identification of the mixture of strains that were inoculated in the plants.