Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs cérébrales de trés sombre pronostic malgré leur traitement associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. Ils contiennent notamment une sous-population de cellules souches/initiatrices de GBM (GIC) impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs en étant capable de générer la majorité des cellules tumorales plus différenciées. Des études ont montré que les cellules tumorales pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GIC en réponse à des stress. Notre hypothèse est qu'une telle plasticité pourrait avoir lieu en réponse aux radiations ionisantes (RI) et participer à la récidive rapide de ces tumeurs après thérapie. En effet, j'ai montré que l'exposition de cultures primaires de cellules de GBM établies à partir de résection de patients à une dose infra-toxique et cliniquement relevante de RI potentialise à long terme la réacquisition de caractéristiques associées au phénotype des GIC (auto-renouvellement, expression de marqueurs souches et tumorigénicité). J'ai identifié au cours de ce processus (1) une surexpression de la protéine anti-apoptotique Survivine; dont l'inhibition pharmacologique bloque la plasticité radio-induite, (2) une reprogrammation métabolique précoce et (3) une enzyme impliquée dans l'acidification du pH extracellulaire, qui semble favoriser le processus de dédifférenciation radio-induite. A terme, le ciblage des mécanismes impliqués dans de ce processus adaptif aux RI pourrait contribuer à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour radiosensibiliser ces tumeurs. / Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a treatment associating surgical resection and radio-chemotherapy. Amongst these tumors, a subpopulation of radio/chemoresistant GBM stem-like/initiating cells (GIC) appears to be involved in the systematic GBM recurrence through the generation of more differenciated tumoral cells. Recent studies showed that tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a GIC phenotype in response to microenvironment stresses. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy. Indeed, I showed that the exposure of several primo-cultures of differentiated GBM cells isolated from patient resections to a subtoxic and clinically relevant IR dose potentiated the long-term reacquisition of GIC properties (self-renewal ability, expression of stemness markers and tumorigenicity). I also identified during this process (1) an up-regulation of the anti-apoptotic protein Survivin whose pharmacological down-regulation led to a blockade of the IR-induced plasticity, (2) the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and (3) an enzymatic target, which appears to be involved in extracellular acidification under IR and could also potentiate the long term dedifferentiation induced by IR. At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radio-sensitization of these brain tumors.

Contrairement aux mammifères adultes, l’amputation d’un membre de vertébrés capables de régénérer, est suivie de la formation d’une structure hautement proliférative et hétérogène : le blastème. Les conditions de formation de ce blastème sont encore mal connues. La sécrétion de facteurs par les cellules dérivées de la crête neurale CCN, seraient à l’origine de la prolifération du blastème. De plus, les macrophages sont recrutés sur le site d’amputation et participeraient à la régénération mais leurs mécanismes d’actions et interactions avec les CCN n’ont jamais été étudiés dans ce contexte. Mon projet de thèse avait pour but d’élucider ces mécanismes en s’appuyant sur deux modèles de régénération : la régénération de la nageoire chez la larve de zebrafish et le membre supérieur de l’embryon de souris au stade E10.5. Ces travaux ont permis :• Chez la larve de zebrafish : d’identifier deux sous-types de macrophages recrutés de manière séquentielle au cours de la régénération, de montrer que l’activation de la voie TNFa/TNFR1 par les macrophages était nécessaire à la prolifération du blastème, d’identifier une population de CCN foxd3+ dans la nageoire dont la présence est indispensable au recrutement et à la polarisation des macrophages ainsi qu’à la prolifération des cellules du blastème.• Chez l’embryon de souris : d’identifier un stade régénératif (E10.5) et non régénératif (E12.5), de montrer l’accumulation de CCN au niveau du site d’amputation au stade E10.5 et de démontrer le rôle de ces cellules dans le processus de régénération. / Unlike in adult mammals, in regenerative species, appendage amputation is followed by the formation of a highly proliferative and heterogeneous structure called the blastema. The required conditions for its formation are still not completely understood. Paracrine factors produced by neural crest derived cells (NCC) have been proposed to be responsible for blastemal cell proliferation. Moreover, macrophages are recruited to the wound site and could participate to the regeneration process. However, their exact functions and interactions with NCC during regeneration have never been investigated. My thesis project consisted in deciphering those mechanisms using two different models: zebrafish larva caudal fin regeneration and forelimb bud regeneration of the E10.5 mouse embryo. This work allowed us:• In zebrafish larva: to identify two subpopulations of macrophages, to highlight their roles during regeneration, to demonstrate the role of the TNFa/TNFR1 axis in the blastemal cell proliferation and to identify a new foxd3+ NCC population in the caudal fin, which is required for macrophage recruitment, polarization and for blastemal cell proliferation. •In mouse embryo: to identify a regenerative (E10.5) and non-regenerative (E12.5) stage of development, to demonstrate the accumulation of NCC at the wound site in E10.5 embryos and demonstrate the crucial role of NCC during epimorphic regeneration in mammals.

Les Chondrichtyens sont des espèces d’intérêt de par leur position phylogénétique à la base des Vertébrés. Au cours de cette thèse réalisée sur un petit requin, la petite roussette, l’étude des protéines Nanos, essentielles pour le maintien de la lignée germinale chez les Ostéichtyens, a mis en évidence la présence de deux protéines Nanos1 (1A et 1B) chez les Chondrichtyens, résultant d’une duplication du gène en amont des Gnathostomes. Chaque paralogue a révélé des profils d’expression spécifiques suggérant une spécification génique. De plus, la niche des spermatogonies souches (SSCs) a été mieux caractérisée et de nouveaux marqueurs de pluripotence tels que SSEA4 et Sox2 ont été détectés dans les SSCs potentielles chez cette espèce. Une culture primaire enrichie en spermatogonies de la zone germinative a montré une hétérogénéité d’expression des facteurs de SSC analysés (GFRα1, SSEA4, POU2, Nanos1A, Nanos1B, c-Kit), suggérant une hétérogénéité des cellules souches et/ou des progéniteurs. Afin de valider le caractère souche de ces cellules en culture, un test fonctionnel de transplantation a été initié. Le développement de cette technologie, pour la première fois chez un Chondrichtyen, ouvre de nouvelles perspectives en termes de préservation de ces espèces. Enfin, la recherche de facteurs à potentiel thérapeutique au niveau testiculaire chez la petite roussette a permis l’identification d’un peptide capable de réguler la glycémie et l’insulinémie de souris présentant un diabète de type 2, mais son mode d’action reste à explorer. L’ensemble des résultats confirme l’intérêt de la petite roussette pour l’étude évolutive de la niche germinale, essentielle au maintien de la gamétogenèse, et la recherche de molécules à potentiel thérapeutique. / Chondrichthyes are species of interest because of their phylogenetic position at the base of the Vertebrates. In this thesis, based on a small shark, the small spotted dogfish, the study of Nanos proteins, essential for the maintenance of the germ line in Osteichthyes, showed the presence of two Nanos1 proteins (1A and 1B) in Chondrichthyes, resulting from a gene duplication upstream of the Gnathostomata. Each paralog revealed specific expression profiles suggesting a gene specification. In addition, the spermatogonial stem cells (SSCs) niche was better characterized and new pluripotency markers such as SSEA4 and Sox2 were detected in potential SSCs in this species. A primary culture of the germinative zone enriched in spermatogonia showed a heterogeneity of expression of the analysed SSC factors (GFRα1, SSEA4, POU2, Nanos1A, Nanos1B, c-Kit), suggesting heterogeneity of stem cells and / or progenitors. In order to validate the stemness potential of these cells in culture, a functional transplantation test was initiated. The development of this technology, for the first time in a Chondrichthyes, opens new perspectives in terms of preservation of these species. Finally, the search of potential therapeutic factors in the dogfish testis led to the identification of a peptide able to regulate blood glucose and insulin levels in mice presenting type 2 diabetes, but its mode of action remains to be explored. All the results confirm the interest of the small spotted dogfish for the evolutionary study of the germinal niche, essential to the maintenance of gametogenesis, and the search for molecules with therapeutic potential.

Les cellules souches du tissu adipeux (ASC pour Adipose-derived Stem Cells) constituentaujourd’hui une source de cellules souches particulièrement prometteuses dans le domaine dela thérapie cellulaire. Considérée comme une alternative sérieuse aux cellules souches de lamoëlle osseuse, cette source de cellules souches multipotentes fait depuis quelques annéesl’objet de nombreuses recherches et essais cliniques dans le domaine des thérapiesrégénératrices. La compréhension des mécanismes moléculaires et l’identification derégulateurs associés à la différenciation des cellules souches permettent de mieux comprendrel’implication de ces cellules dans l’homéostasie et la réparation tissulaire. Ceci représente unenjeu considérable dans le développement de stratégies thérapeutiques pour de nombreusesmaladies humaines.De précédentes études ont démontré que les récepteurs aux nucléotides P2Y jouent un rôleprécoce dans le devenir adipogénique et ostéogénique des cellules souches mésenchymateuseshumaines de la moëlle osseuse et du follicule dentaire. L’implication des récepteurs P2Y a étépeu étudiée dans les processus de différenciation des ASC. Ceci nous a amené à investiguer lerôle potentiel des récepteurs P2Y4 et P2Y2 dans la voie de différenciation adipocytaire et dansla voie de différenciation endothéliale.Dans un premier temps, nous avons étudié l’impact de la perte du récepteur P2Y4 dans leprocessus de différenciation adipogénique des celles souches du tissu adipeux cardiaque(cASC) et dans la formation du tissu adipeux cardiaque (TAC). Nous avons montré une forteexpression du récepteur P2Y4 tout au long du processus de différenciation des cASC enadipocytes matures. Ces premiers résultats ont été corrélé à une précédente observation faitepar notre laboratoire démontrant l’augmentation de la masse de ce tissu graisseux entourant lecoeur chez les souris déficientes pour le récepteur P2Y4. Nous avons ensuite identifié un effetnégatif de l’UTP, ligand des récepteurs P2Y4 et P2Y2, sur la différenciation et la maturationadipogénique des cASC. Par ailleurs, l’utilisation d’agonistes spécifiques aux deux récepteursa permis de démontrer que cet effet négatif de l’UTP observé sur la différenciation adipocytaireétait lié à l’activation du récepteur P2Y4. Ces effets ont rapidement été corrélés à une diminutiond’expression de facteurs adipogéniques (PPARy, SCD1 et THRSP) identifiant ainsi le P2Y4comme un régulateur négatif du processus adipogénique.Cette première étude a également permis d’évaluer la fonction cardioprotectrice du TAC enl’absence du récepteur P2Y4. Des études in vivo réalisées sur un modèle murin d’infarctus dumyocarde (LAD) a permis d’expliquer l’effet cardioprotecteur précédemment observé enl’absence du récepteur P2Y4. Il semblerait que la cardioprotection observée dans les sourisdéficientes pour le récepteur P2Y4 serait dépendant de la surexpression d’une adipokinecardioprotectrice, l’adiponectine. La réalisation du modèle LAD sur des souris double knockoutpour le récepteur P2Y4 et l’adiponectine a en effet permis de démontrer la corrélation entrela cardioprotection et l’augmentation d’adiponectine dans les souris déficientes pour lerécepteur P2Y4. Enfin, la mise en évidence d’adipocytes de type beige dans le TAC de sourisP2Y4 knockout est venue étayer la dimension cardioprotectrice du TAC.Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés au rôle du récepteur P2Y2,dans la différenciation des cASC en cellules endothéliales et leurs propriétés angiogéniquesdans un modèle in vivo de revascularisation post-ischémique.Des expériences d’angiogenèse in vitro réalisées au moyen de cASC prédifférenciées encellules endothéliales ont démontré la formation de réseaux plus développés après unestimulation à l’UTP (100μM) au cours de la différenciation des cASC. L’effet positif de l’UTPdans la formation des réseaux vasculaires, conservé dans les cASC issues de souris déficientespour le P2Y4, était cependant inhibé en l’absence du récepteur P2Y2. Ces résultats, associés àl’expression forte du récepteur P2Y2 observée dans les cultures de cASC (comparée à celle duP2Y4), sont venus confirmer le rôle de ce récepteur dans le processus de différenciationendothéliale des cASC et dans la formation de tubes vasculaires. Des expériences de RNAsequencing nous ont permis d’identifier des protéines cibles de l’UTP dans les cASC possédantdes propriétés pro-angiogéniques.Enfin, la dernière partie de ce travail fut la mise en place d’un modèle in vivo conséquentpermettant d’étudier l’effet de l’UTP sur le potentiel de revascularisation post-ischémique descASC différenciées. L’injection post-infarctus des cASC préstimulées à l’UTP a démontré uneffet positif sur la densité capillaire dans la périphérie de la zone ischémique. Enfin, cet effetpro-angiogénique d’un prétraitement des cASC à l’UTP pendant leur différenciation était perduen cas d’injection de cASC issues de souris déficientes pour le récepteur P2Y2.Cette seconde étude a donc permis de mettre en évidence le rôle régulateur de l’UTP, parl’activation du récepteur P2Y2, dans le potentiel pro-angiogénique des ASC après leur injectiondans un modèle d’infarctus. L’identification de régulateurs, permettant d’améliorer l’efficacitéthérapeutique des ASC en agissant notamment sur leurs effets pro-angiogéniques paracrines etdonc leur capacité de revascularisation, représente un enjeu majeur dans l’optimisation desthérapies cardiaques.L’ensemble de nos travaux suggère que les récepteurs aux nucléotides présentent un potentielrégulateur majeur dans des processus physiologiques tels que la différenciation adipocytaire etendothéliale des ASC. Ces récepteurs pourraient ainsi constituer des cibles thérapeutiquesintéressantes dans la régulation de la fonction cardioprotectrice du TAC et dans le potentiel proangiogéniquedes ASC dans un processus de revascularisation post-ischémique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

During embryonic development and embryonic stem (ES) cell differentiation, the different cardiovascular cell lineages that compose the mature heart arise from different groups of cardiovascular progenitors (CPs), which contribute to the formation of different heart regions. Mesp1 expression is the earliest sign of cardiovascular development. Tracing of the early Mesp1-exressing cells reveals that all cardiovascular cell of the mature heart arise from Mesp1-derived cells. Various functional studies demonstrated that Mesp1 acts as a central regulator of cardiovascular lineage commitment, controlling the expression of early cardiac transcription factors, and promoting the differentiation into cardiomyocytes (CMs), endothelial cells (ECs) and smooth muscle cells (SMCs). In the first part of my thesis work, we generated a Mesp1-GFP reporter ES cell line allowing tracking and isolating the earliest Mesp1-expressing cells. We found that Mesp1 marks an early population of CPs that presents the ability to differentiate into CM, EC and SMC from both heart fields. Transcriptional profiling of Mesp1-CPs uncovered cell surface markers allowing their isolation. In this work, we demonstrated that Mesp1 is required for the specification of these early CPs. To ensure harmonious cardiovascular development, CP specification and migration must be tightly coordinated. In addition to the induction of cardiovascular cell fate, Mesp1 seems also involved in the migration of early CPs, as suggested by the cardiac malformation associated with the persistence of cardiovascular specification and differentiation in Mesp1 null embryo. The upregulation of the expression of Mesp2, its closest homologue, in the cardiac mesoderm, suggest that Mesp2 could partially compensate for Mesp1 function during early cardiogenesis, while Mesp1 presents a unique and non-redundant function during CP migration. However, Mesp2 KO embryos do not present cardiac malformation but rather major skeletal malformations. Inactivation of both Mesp1 and Mesp2 leads to the complete absence of mesoderm formation and consequently heart development, precluding the assessment of the redundant function of Mesp1 and Mesp2 during cardiovascular specification and differentiation. The second aim of this work was to investigate the mechanisms that compensate for Mesp1 functions during the early steps of cardiogenesis, and those that control the unique Mesp1 function during CP migration. Using inducible gain of function experiments during ES cell differentiation, we found that Mesp2 was as efficient as Mesp1 at promoting CP specification, EMT and cardiovascular differentiation. However, only Mesp1 stimulated the polarity and directional cell migration through a cellular autonomous mechanism. Transcriptional analysis and ChIP experiments revealed that Mesp1 and Mesp2 activate a common set of target genes that promote CP specification and differentiation. We identified two direct Mesp1 target genes, Prickle1 and RasGRP3, that are strongly induced by Mesp1 and not Mesp2 and which control the polarity and the speed of cell migration. Altogether our results identify the molecular interface controlled by Mesp1 that links CP specification and migration during ES cell differentiation. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules souches embryonnaires (ES) et induites à la pluripotence (iPS) portent de grands espoirs pour la médecine régénératrice du fait de leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation. Une question cruciale est de savoir comment ces cellules mettent en place et maintiennent l’épigénome pluripotent. Les cellules ES et iPS ont un cycle cellulaire particulier, avec un temps de doublement rapide, une phase G1 courte et une phase S représentant 60-70% du cycle cellulaire. Au cours de ce projet, nous avons essayé de voir si les chromosomes dans les cellules ES murines et humaines étaient répliqués de façon particulière qui aiderait à maintenir l’état pluripotent.Les chromosomes mammifères sont dupliqués grâce au recrutement de ~20000 origines de réplication qui sont organisés dans des clusters. Ces clusters forment des foyers de réplication qui sont régulés dans le temps pendant la phase S et dans l’espace nucléaire. Certains de ces domaines topologiques changent leur timing de réplication pendant la différenciation ou la reprogrammation. Néanmoins les mécanismes exacts impliqués dans ce processus et leurs conséquences sur l’expression génique ne sont pas connus.Nous avons étudié la dynamique de réplication dans des cellules pluripotentes murines et humaines à l’échelle de molécules individuelles par la technique de peignage moléculaire de l’ADN. Nous avons comparé les vitesses de fourches, les distances inter-origines et la densité de fourches dans des cellules différenciées (MEF) et pluripotentes (mES), ainsi que pendant la différenciation de ces dernières. Les vitesses de fourches de réplication sont légèrement moins élevées dans les cellules souches embryonnaires que dans les fibroblastes (1.8 vs 2.0 kb/min), et les distances inter-origines intra-cluster sont équivalentes. Par contre, la densité globale instantanée de fourches est divisée par deux dans les cellules ES (1 fourche/Mb) par rapport aux fibroblastes. Un résultat similaire est retrouvé dans les cellules souches embryonnaires humaines (H9) comparées aux fibroblastes (BJ).Afin de tester si cette densité de fourches basse est compensée par un allongement de la phase S, nous avons développé une technique basée sur deux marquages aux analogues de la thymidine. Elle permet une mesure de la durée de la phase S sur des populations asynchrones de cellules. Nous avons trouvé que la phase S a la même durée dans les cellules mES et MEF (~8.4h). Une question intéressante est donc comment les cellules ES peuvent répliquer la même quantité de l’ADN, dans la même durée mais en utilisant deux fois moins de fourches ? Nous proposons que la plus faible densité instantanée en origines serait compensée par une fréquence plus élevée de l’activation des foyers de réplication. Cette fréquence élevée pourrait participer au maintien de la structure épigénétique responsable de la pluripotence ou de l’auto-renouvellement. / Embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have a great potential for regenerative medicine due to their capacity to self-renew indefinitely and to generate multiple cell types, but the key question of how they establish and maintain a pluripotent epigenome is not resolved. Interestingly all ES and iPS cells display a peculiar cell cycle with rapid doubling time, very short G1, and S phase representing 60-70% of the total cell cycle. In this work we tried to see whether chromosomes in mouse and human ES cells are replicated in a special way that might be used to set up the pluripotency state or to define cell identity. Mammalian genomes are duplicated by the firing of ~20,000 replication origins, organized in ~3000 small clusters forming replication foci that are spatially and temporally regulated during S phase. It has been shown that many of these topologically-associated domains change their replication time upon cell differentiation or reprogramming, but the exact mechanisms involved remain poorly understood. Here we used DNA combing to compare fork velocity (FV), local inter-origin distances (IOD) and global instant fork density (GIFD) between pluripotent mouse ES cells and fibroblasts (MEF), as well as during the differentiation of mES cells into embryoid bodies (EB) and neural precursors. We found that FV is slightly reduced (1.8 vs 2.0 kb/min) and IOD basically unchanged in mES compared to MEF. In contrast GIFD, which represents the density of forks active at any moment during S phase, shows a strong reduction from 2 forks/Mb in MEF to 1 fork/Mb in mES cells. We found a similar drop in GIFD in human ES cells (H9) compared to fibroblasts (BJ). To test whether this lower fork density is compensated by an extension of S phase, we developed a dual pulse/chase protocol to measure S-phase length in asynchronous populations by FACS. Using this assay, we found that S-phase length is identical (~8.4 hr) in both mES and MEF cells, despite the GIFD drop in the former. This raises an interesting question: how can ES cells replicate the same amount of DNA, in the same time and with similar fork velocity, but using a 2-fold lower instant fork density? We propose that the lower GIFD (amplitude) is compensated by a higher frequency of replication foci activation, which is not detected by the GIFD pulse protocol. This higher frequency of replication foci activation could play a role in the establishment and/or maintenance of a chromatin structure permissive for pluripotency or self-renewal.

Les cellules souches spermatogoniales (SSCs) constituent la population de cellules germinales initiales support de la production des spermatozoïdes tout le long de la vie d’un individu. Ces cellules caractérisées par leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation maintiennent ainsi une réserve et garantissent la production continue de cellules germinales différenciées. Chez les mammifères, plusieurs marqueurs permettant de reconnaitre cette population cellulaire au sein du testicule ont été identifiés. De plus, parmi ces marqueurs, certains permettent d’isoler et de purifier les SSCs. Ils ont ainsi permis d’aborder les mécanismes de régulation du devenir des SSCs par des expériences menées in vitro et in vivo. En revanche, la biologie de ces cellules est beaucoup moins connue chez les vertébrés non mammaliens, en particulier chez les poissons téléostéens. Notre modèle d’étude, la truite arc-en-ciel (Oncorynchus mykiss) est caractérisée par une spermatogenèse cyclique et fortement saisonnée. La croissance du testicule immature, la prolifération active des spermatogonies à la puberté, et la quiescence de ces dernières en fin de cycle semblent être des étapes clés de régulation du devenir des SSCs. Grâce à l’analyse des profils d’expression au cours du cycle spermatogénétique et dans des fractions de cellules testiculaires isolées, nous montrons la conservation d’expression de gènes décrit comme marqueurs de SSCs chez les mammifères (pou2, plzf, nanos2 et 3, gfra1) dans les populations de spermatogonies A indifférenciées de truite. En particulier, gfra1 et nanos2 identifient tous deux une sous-population de cellules au sein des spermatogonies. Nous proposons donc que les cellules gfra1+ et/ou nanos2+ sont des SSCs au sein du testicule de truite. Par ailleurs, nous montrons que l’orthologue truite de gdnf, ligand de gfra1 et régulateur majeur du maintien des SSCs chez la souris, est exprimé très fortement juste avant la fin de cycle spermatogénétique. Cette expression corrélée avec un pic de sécrétion plasmatique de Fsh suggérait une régulation positive de gdnf par cette hormone. Notre étude in vitro n’a pas permis d’aboutir aux mêmes conclusions, mais cette technique ne reflète pas toutes les régulations réciproques ni le rôle des autres facteurs in vivo. En conclusion, nous avons découvert des marqueurs probables de SSCs chez la truite. En particulier, gfra1 et nanos2 qui permettront une analyse plus approfondie de la biologie des SSCs chez les téléostéens. De plus, l’expression de gdnf et de son récepteur dans le testicule, régulée en fonction du stade du cycle spermatogénétique, nous permet d’envisager cette voie comme régulateur du devenir des SSCs chez la truite. / Spermatozoa production throughout life requires the presence of the initial germ cells, the spermatogonial stem cells (SSCs). Their self-renewal and their ability to differentiate assure to keep a reserve and to produce continuously differentiated germ cell. In mammals, several markers of the SSCs have been identified. Interestingly, some of them allow us to sort the SSCs population and further to analyze their fate in vitro and in vivo. By contrast, only scarce information has been obtained in non-mammalian vertebrates including the teleost fishes. Our model of study, the rainbow trout (Oncorynchus mykiss), presents a seasonal spermatogenesis. The growth of the immature testes, the active spermatogonial proliferation starting at puberty, and their quiescent state at the end of the cycle represent interesting stages to study the regulation on the SSCs fate. Using various testicular stages and purified testicular cell fractions we show that pou2, plzf, nanos2 and 3 and gfra1, all expressed by spermatogonial stem cells in mammals, are specifically expressed in the undifferentiated A spermatogonia population. In particular, gfra1 and nanos2 are expressed in a sub-population of these cells. Thus, we propose that the nanos2+ and/or gfra1+ cells are SSCs. Furthermore, in our study, gdnf, ligand of gfra1 regulating the SSCs fate in mouse, is highly expressed just before the end of the spermatogenetic cycle. Such expression correlates with Fsh peak of secretion. However a stimulation of gdnf expression by Fsh was not observed in our in vitro experiments, but this technique doesn’t represent reciprocal regulations nor the roles of all factors in vivo. To conclude, we discovered potent marker of SSCs in trout. In particular, gfra1 and nanos2 will allow us to investigate further the SSCs biology in teleosts. Moreover, gdnf and its receptor expression in the testis in a spermatogenetic-dependent way lead us to propose this pathway as a potent regulator of the SSCs fate in trout.

La perte de l’organe dentaire entraine une perte de substance de l’os alvéolaire. Les techniques mises en place pour reconstruire l’os alvéolaire préalablement à la pose d’implant utilisent des membranes (seules ou associées à une greffe osseuse), faisant d’une part office de barrière vis-à-vis des tissus mous environnants, et permettant d’autre part le maintien d’un espace nécessaire à l’ostéogénèse. Ce travail de thèse pluridisciplinaire vise à développer des matrices innovantes destinées à la régénération osseuse. Inspirés par la nature hybride du tissu osseux, des revêtements à base de phosphates de calcium et de polymères organiques (chitosane et acide hyaluronique) ont été élaborés par pulvérisation simultanée de solutions d’espèces réactives. La construction de ces revêtements a permis la précipitation d’un composé à base d’apatite carbonatée et de brushite sur des lamelles de verre (preuve de concept), tandis qu’un composé hybride complexe (brushite, phosphate octocalcique et apatite nanocristalline) a été construit sur des membranes de collagène d’origine porcine, utilisées en régénération osseuse. Sur le verre, les revêtements semblent posséder les propriétés intrinsèques (rugosité, élasticité) en faveur d’une différenciation ostéoblastique, ce qui a été confirmé par une différenciation ostéoblastique précoce des cellules souches. Sur la membrane, le revêtement n’induit pas de différenciation mais stimule les propriétés ostéo-immunomodulatrices des cellules souches, nécessaires à la régénération osseuse. De plus, le revêtement a démontré dans les deux cas une activité antibactérienne, le rendant très attractif pour des applications en régénération osseuse. Enfin, le développement d’un dispositif médical de classe II à partir de la gelée de Wharton a été envisagé. Cette source allogénique semble prometteuse en médecine régénératrice osseuse. / Bone loss following tooth extraction requires pre-implantory surgery techniques to regenerate bone. These techniques use an occlusive membrane positioned over a bone graft material or not, providing space maintenance and enabling to seclude soft tissue infiltration to promote bone regeneration. This pluridisciplinary thesis work aims at developing innovative biomaterials for bone regeneration applications. Inspired by bone hybrid composition, coatings made of calcium phosphates and organic polymers (chitosan and hyaluronic acid) were developed using simultaneous spray coating of interacting species process. Coating build-up led to precipitation of a compound made of carbonated apatite and brushite on glass coverslip (proof of concept), whereas a complex hybrid compound (brushite, octacalcium phosphate and nanocrystalline apatite) was formed on collagen membrane. Coating on glass coverslip seems to possess required properties (roughness, elasticity) for osteoblastic differentiation, which was confirmed by stem cells early osteoblast commitment. However, coating on collagen membrane did not induce osteoblastic differentiation, but stimulated stem cells osteo-immunomodulatory properties, required for bone regeneration. Interestingly, coating demonstrated in both cases antibacterial activities, which makes it very attractive for bone regeneration applications. Finally, Wharton’s jelly from umbilical cord was suggested as an innovative source for new biomaterials, to replace xenogeneic membranes.

Le gène H19 est soumis à l’empreinte génomique parentale et ne code aucune protéine. Le produit de ce gène, le long ARN non codant (lncRNA) H19, agit en tant qu’ARN et est impliqué dans le développement embryonnaire ainsi que dans la tumorigenèse. Le lncRNA H19 est le précurseur du miR-675. Mes travaux de thèse ont permis d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la tumorigenèse mammaire par le gène H19. Nous avons mis en évidence que le lncRNA H19 régule négativement la protéine p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux ont démontré que le lncRNA H19 interagit physiquement avec la protéine p53 et MDM2 afin d’induire sa dégradation et empêcher sa translocation dans le noyau. Ce nouveau mode d’action d’H19 dans les cancers du sein pourrait expliquer le manque de pertinence clinique de l’étude du statut mutationnel de p53 par immunohistochimie dans ce cancer. J’ai également mis en évidence que non seulement le lncRNA H19 est impliqué dans la régulation des cellules souches cancéreuses, mais également le miR-675-5p. En effet, les tumeurs exprimant des signatures géniques associées aux marqueurs de cellules souches cancéreuses sont des tumeurs qui surexpriment le gène H19. De plus, la modulation de l’expression du lncRNA H19 et de son microARN régule les capacités fonctionnelles associées aux cellules souches cancéreuses mammaires. Pour finir, j’ai initié un projet permettant l’identification, sans a priori, des gènes cibles du lncRNA H19 et de son microARN dans les cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, j’ai mis en évidence l’implication du lncRNA H19 et du miR-675-5p dans différents processus impliqués dans la tumorigenèse mammaire. / The H19 gene is subject to genomic imprinting and does not encode protein. The product of this gene, the long non coding RNA (lncRNA) H19, act as an RNA and is involved in development and the tumorigenesis. The H19 RNA is the precursor of miR-675. My thesis work identified new mechanism involved in the regulation of breast tumorigenesis by H19. We have demonstrated that the lncRNA H19 negatively regulates the p53 protein in breast cancer cell lines. My work revealed that H19 interacts with p53 and MDM2 to induce the degradation of p53 and impedes its nuclear localization. This new mechanism of H19 in breast cancer could explain the lack of clinical relevance of the p53 mutational state measured by immunohistochemistry in breast cancer. My work also revealed that not only the lncRNA H19 is involved in the regulation of breast cancer stem cells but also the miR-675-5p. Indeed, we have shown a correlation between overexpression of H19 and expression of a cancer stem cell phenotype in patient tumors. Furthermore, the modulation of H19 or miR-675 expression regulates the functional capacities associated with breast cancer stem cells. I also initiated a project that will allow the identification of H19 and miR-675 target genes in breast cancer cell lines. To conclude, I highlighted the implication of the lncRNA H19 and miR-675 in different process involved in breast cancer tumorigenesis.

Toutes les cellules de l’organisme relarguent de façon constitutive des nucléotides dans l’espace extracellulaire. Ces nucléotides extracellulaires agissent comme des molécules de signalisation, entre autres, via les récepteurs P2Y (P2YRs) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les P2YRs sont exprimés, pour la majorité, de façon ubiquitaire dans l’organisme. L’analyse phénotypique des lignées de souris knockout pour les P2YRs (P2YR-/-) a permis de confirmer l’importance de cette voie de communication dans différents processus physio/pathologiques. Au sein de notre laboratoire, grâce à l’utilisation de souris P2YR-/-, nous étudions depuis quelques années le rôle de ces récepteurs dans la biologie des cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (MSCs). Ces cellules se caractérisent par une faible immunogénicité et surtout par la propriété de multipotence, i.e. capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires (adipocytes, chondroblastes, ostéoblastes). Cette dernière propriété suscite l’intérêt de la médecine régénérative qui vise à exploiter la multipotence de ces cellules en thérapie cellulaire. Toutefois, leur utilisation à des fins thérapeutiques est encore limitée, notamment parce que les mécanismes régulateurs de ces processus de différenciation sont encore mal compris. Il est donc fondamental de continuer à étudier les voies de signalisation régulant les processus de différenciation de ces cellules pour leurs applications cliniques.Dans ce travail de recherche, nous avons investigué l’implication de la signalisation dépendant des P2YR dans le modèle expérimental des MSCs dérivées du tissu adipeux sous-cutané inguinal (ATMSCs) murin. D’abord, nous avons montré que parmi les 7 sous-types connus de récepteur P2Ys, les ATMSCs expriment le P2Y2R (récepteur à l’ATP et l’UTP) et le P2Y6R (récepteur à l’UDP) et que ces récepteurs sont fonctionnels. Par une approche combinant l’analyse quantitative de leur expression, l’effet de leur activation pharmacologique et enfin l’effet de l’invalidation de leur gène (P2ry2 ou P2ry6), nous avons montré que ces deux récepteurs influencent à des degrés divers le processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs in vitro.Concernant le P2Y2R, nos données montrent que l’expression de son messager diminue dans les ATMSCs différenciées en adipocytes tandis que son activation et que l’invalidation de son gène sont sans effet sur l’intensité de différenciation adipogénique. Par ailleurs, après une différenciation ostéoblastogénique, le niveau d’expression du messager codant P2Y2R n’est pas modifié. Par contre, les ATMSCs P2Y2R-/- ont un potentiel de différenciation ostéoblastogénique diminué par rapport aux WT. Cet effet pourrait être lié à une diminution de l’expression de gènes codant des facteurs de signalisation des voies Wnt et/ou BMP, connues pour contrôler la production d’ostéoblastes à partir des MSCs.Le récepteur P2Y6R semble intervenir à la fois dans l’adipogénèse et l’ostéoblastogénèse des ATMSCs. En effet, l’expression du messager codant P2Y6R n’est pas modulée dans les adipocytes matures et l’activation du récepteur n’a pas d’effet sur le processus de différenciation adipogénique. Par contre, les ATMSCs P2Y6R-/- ont un potentiel de différenciation adipogénique réduit ce qui est corrélé à une diminution de l’expression du messager codant PPARγ2. D’autre part, nous avons constaté que l’augmentation de tissu adipeux est moindre chez les souris P2Y6R-/- âgées sous régime normal ou riche en graisse. Par ailleurs, l’expression du messager codant P2Y6R est diminuée après différenciation ostéoblastogénique. L’activation de P2Y6R par l’UDP altère la maturation complète des ATMSCs en ostéoblastes et l’invalidation du gène P2ry6 augmente l’activité principale de cette phase tardive, c’est-à-dire la production de minéralisation. Ces données suggèrent que la voie UDP-P2Y6R régule négativement le processus de différenciation ostéoblastogénique dans le modèle cellulaire étudié dans ce travail.Avec le modèle pathologique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs), modélisant une différenciation ectopique, nous avons montré que l’invalidation des gènes P2ry2 et P2ry6 affecte la transdifférenciation de ces cellules en cellules minéralisantes.En résumé, notre travail a permis de définir les rôles des P2Y2R et P2Y6R dans les processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs et de transdifférenciation des VSMCs en cellules calcifiantes. Des études complémentaires devront être réalisées pour établir la signification physio/pathologique de ces données expérimentales. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished