La réparation des défauts osseux de taille importante (fracture, tumeur, nécrose de l'os) pour lesquelles une partie de l'os est manquante et doit être remplacée, demeure un défi important pour le domaine médical. Des matériaux synthétiques, comme des matériaux céramiques, métalliques, et polymères, sont ainsi développés comme substituts osseux. Mais ces matériaux n'interagissent pas suffisamment avec l'os du patient et finissent par être encapsulés par une couche de tissu fibreux, ce qui peut résulter en une fracture de l'os, de l'implant, ou de l'interface entre les deux. La recherche vise donc à étudier et comprendre les interactions entre les cellules et les matériaux, afin de développer des matériaux capables d'interagir avec les cellules, et de mettre au point des implants combinant un matériau bioactif, des cellules, et des facteurs bioactifs permettant la reconstruction du tissu osseux. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) ont gagné en popularité en médecine régénératrice compte tenu de leur capacité d'auto-renouvellement, leur multipotence, et leur taux de prolifération élevé. Cependant, une fois extraites du patient et cultivées in vitro, les MSCs ont tendance à se différencier de manière aléatoire, ce qui conduit à une population hétérogène de cellules avec laquelle il est difficile de reconstruire un tissu. Bien que les MSCs soient utilisées en clinique pour le traitement de diverses pathologies, une meilleure compréhension de leur comportement reste nécessaire pour permettre de contrôler leur différenciation vers une lignée spécifique et ainsi améliorer leurs performances en clinique. Les hydrogels ont émergé comme matériaux prometteurs pour la culture cellulaire puisqu'ils permettent de mimer la matrice extracellulaire naturelle des cellules. Notamment, de nombreuses études ont évalué l'impact de la rigidité des hydrogels sur la différenciation des MSCs et ont montré qu'une rigidité proche de celle d'un tissu naturel favorise la différenciation vers les cellules de ce tissu. Cependant, il est maintenant reconnu que les hydrogels et les tissus naturels ne sont pas caractérisés uniquement par leur rigidité, mais aussi par leur viscoélasticité. Or peu d'études ont été menées sur l'impact des propriétés viscoélastiques des hydrogels sur la différenciation des MSCs (15 articles sur les cinq dernières années via PubMed). Dans ce projet, il a été montré qu'il était possible de synthétiser des hydrogels de poly(acrylamide-co-acide acrylique) avec une rigidité et une viscoélasticité contrôlées, mesurées par compression et par AFM. Cinq hydrogels ont été choisis pour étudier l'impact des propriétés mécaniques sur la différenciation ostéogénique des MSCs en variant la rigidité et le pourcentage de relaxation : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, et 140 kPa-70%. Il a été montré que la fonctionnalisation de surface de ces hydrogels avec un peptide mimétique de la protéine BMP-2 a mené à une forme cellulaire étoilée après deux semaines de différenciation, sauf pour la rigidité la plus basse (15 kPa). Cette forme cellulaire étoilée correspondrait à une forme d'ostéocyte, qui est le dernier stade de différenciation ostéogénique des MSCs, et qui n'a jamais été obtenu in vitro à notre connaissance. De plus, une rigidité de 60 kPa a mené à une plus forte expression de marqueurs de différenciation ostéocytaires par rapport à des rigidités de 15 et 140 kPa, pour une même relaxation de 15%. Enfin, la plus forte expression de marqueurs de différenciation d'ostéoblastes et d'ostéocytes a été observée pour l'hydrogel présentant 70% de relaxation et une rigidité de 140 kPa. Ceci semble montrer qu'une viscoélasticité élevée favorise la différenciation ostéogénique des MSCs, même si elle est associée à une rigidité qui n'est pas la plus favorable. Ainsi, les propriétés viscoélastiques de la matrice auraient un impact non négligeable sur la différenciation des MSCs et devraient être considérées à l'avenir. / The repair of large bone defects, including large fracture, tumor, and necrosis for which a part of the bone is missing and has to be replaced, is still a challenge for the medical field. Synthetic materials, such as ceramic, metallic, and polymeric materials, have been developed as bone substitutes. However, these materials do not interact with the bone of the patient and generally end up being encapsulated by a layer of fibrous tissue, that might result in the fracture of the bone, the implant, or the interface between the two. The research therefore aims at studying and understanding cell-material interactions in order to develop materials capable of interacting with cells, and to create new implants combining a carrier material, cells, and bioactive factors, allowing bone reconstruction. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have gained high interest in regenerative medicine considering their self-renewal ability, multipotency, and high proliferative rate. However, once extracted from the patient and cultivated in vitro, MSCs tend to differentiate randomly, which leads to a heterogeneous population of cells with which it is difficult to reconstruct any tissue. Therefore, although MSCs are used in clinics for the treatment of various pathologies, a better understanding of their biological behavior is still required to provide the ability to control their in vitro differentiation into a specific lineage and improve their clinical performance. Hydrogels have emerged as promising materials for cell culture as they allow to mimic the natural extracellular matrix of cells. Particularly, many studies have evaluated the impact of hydrogels stiffness on MSCs differentiation and showed that a stiffness close to that of a biological tissue leads to a differentiation towards cells of this tissue. Nevertheless, it is now recognized that hydrogels as well as biological tissues are not only described by their stiffness, but also by their viscoelastic properties. However, only few studies have been conducted on the impact of hydrogels viscoelastic properties on MSCs differentiation (15 articles over the past five years from PubMed). In this project, it has been shown that it was possible to synthesize poly(acrylamide-co- acrylic acid) hydrogels with different controlled stiffness and viscoelasticity, evaluated using compression and AFM. Five hydrogels have been chosen to study the impact of hydrogels mechanical properties on MSCs osteogenic differentiation by varying the stiffness and the relaxation percent : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, and 140 kPa- 70%. It has been shown that the surface functionalization of these hydrogels with a mimetic peptide of the BMP-2 protein led to star-like cells, except for the lowest stiffness (15 kPa). This star-like shape would correspond to the shape of osteocytes, which is the last stage of osteogenic differentiation, and which has never been obtained in vitro to our knowledge. Moreover, a stiffness of 60 kPa led to a higher expression of osteocyte markers as compared to stiffnesses of 15 and 140 kPa, for a constant low relaxation of 15%. Finally, the strongest expression of osteoblast and osteocyte differentiation markers has been observed for the hydrogel with a high relaxation of 70% and a stiffness of 140 kPa. This shows that a high viscoelasticity would favor MSCs osteogenic differentiation, even if it is associated with a stiffness that is not the most favorable. Thus, the viscoelastic properties of the matrix would have a significant impact on MSCs differentiation and should be considered in the future.

« Maîtrise en sciences cliniques et biomédicales - avec mémoire de l'Université Laval offert en extension à l'Université du Québec à Chicoutimi » / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire dominante où le muscle squelettique est sévèrement affecté. Les personnes atteintes présentent une faiblesse musculaire, une perte progressive de la force musculaire et de l'atrophie. La fonction des cellules souches musculaires (CSM) est également altérée en DM1 en présentant notamment un profil de sénescence prématurée, une capacité de prolifération et de fusion diminuée, mais aussi une différenciation en myotubes retardée. Le profil inflammatoire élevé mesuré chez les individus atteints de DM1 pourrait être, du moins en partie, responsable de l'altération de leur fonction. Actuellement, cette maladie reste incurable, mais il y a un haut potentiel thérapeutique dans le développement de stratégies permettant de restaurer la fonction des CSM. De plus, cette avenue demeure inexplorée. Afin de permettre l'avancement des connaissances dans ce domaine de recherche, ce mémoire présente un travail de recherche visant à développer une nouvelle avenue thérapeutique ciblant la fonction altérée des CSM ainsi que l'inflammation potentiellement présente au niveau musculaire en DM1. Pour répondre à ces objectifs, la force musculaire de 4 groupes musculaires a été mesurée chez 103 participants atteints de DM1, exprimée en valeur prédite, puis comparée entre les individus présentant des niveaux sériques normaux ou anormaux de cytokines pro inflammatoires. De plus, à partir de biopsies musculaires prélevées chez 10 patients DM1 et 15 sujets sains, la densité de cellules inflammatoires (macrophages) a été quantifiée dans les tissus musculaires DM1 et comparée aux tissus contrôles. Des CSM ont aussi été isolées à partir de ces biopsies et utilisées afin d'évaluer le niveau d'expression de certains gènes inflammatoires par technique de séquençage de cellules uniques et d'évaluer l'effet de certains médiateurs lipidiques sur la fonction CSM et ainsi que sur l'expression de certains gènes de l'inflammation. Les résultats de cette étude ont été présentés dans la production d'un article original portant sur l'étude des médiateurs lipidiques sur la fonction des CSM en DM1. En plus de confirmer l'inflammation systémique (sang) documentée chez les individus atteints de DM1, les résultats obtenus démontrent une inflammation locale (tissu musculaire et CSM) chez ceux-ci. Aussi, l'ajout exogène de certaines molécules appartenant à cette famille de médiateurs, dont certaines résolvines et marésines, améliore la prolifération, la différenciation et la fusion des CSM, et diminue significativement l'expression de certains gènes de l'inflammation. Ainsi, cette classe de médiateurs représente un nouvel espoir thérapeutique dans le développement de thérapies ciblant les fonctions altérées des CSM, mais également dans la résolution de l'inflammation en DM1 et autres maladies inflammatoires. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a dominant disease characterized by severely affected skeletal muscles. Individuals with DM1 experienced muscle weakness, progressive loss of muscle strength and atrophy. The function of muscle stem cells (MSC) is also altered in DM1 and they exhibit a premature senescence profile, decreased proliferation and fusion capacity and delayed differentiation into myotubes. At least, the highly inflammatory profile could be responsible of the impairment of their functions. Currently, there is no cure for this disease, but there is a high therapeutic potential in the development of strategies to restore MSC function. Moreover, this avenue remains unexplored. To increase knowledge in this field of research, this thesis presents an original manuscript on the study of lipid mediators on MSC function in DM1. In addition to confirm the systemic inflammation (blood) documented in DM1 patients, the results obtained demonstrate a local inflammation (in muscle tissue and MSC) in DM1 patients. Also, the exogenous addition of lipid mediators including resolvin and maresins family improves the proliferation, differentiation and fusion of MSC and significantly decreases the expression of inflammation genes. Thus, this class of mediators represents a new therapeutic hope to rescue MSC function and decrease inflammatory profile associated with DM1.

L'activation de cathepsines et la présence de cellules cancéreuses dites souches (CSC) participeraient à l'évolution métastatique du cancer colorectal. L'effet d'inhibiteurs intracellulaire (CA-074 ME) et extracellulaire (CA-074) de la cathepsine B a été analysé dans un système de culture tridimensionnelle (3-D) reproduisant le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du côlon. Le CA-074 ME a été le seul à inhiber de façon significative le processus métastatique. Pour l'étude des CSC, le marquage immunohistochimique de CD 133, CD44 et CD24 a été évalué qualitativement et quantitativement dans la culture 3-D et dans des spécimens histologiques provenant de patients porteurs de cancer du côlon. L'expression de ces marqueurs dans les cellules cultivées en 3-D était variable. Par contre, le marqueur CD 133 était fortement exprimé dans les métastases hépatiques associées à des ganglions lymphatiques envahis, tel que démontré en combinaison avec une coloration fluorescente des noyaux. La conclusion reflète les corrélations possibles de ces résultats.

Les cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSCs) ont été conçues pour la première fois en 2007 par l’équipe du Docteur Yamanaka, au Japon. Ce sont des cellules somatiques reprogrammées par un virus permettant, par exemple, la différenciation neuronale à des fins d'étude de maladies neuro-développementales telle que la Schizophrénie. Le prélèvement des cellules somatiques se fait aujourd'hui majoritairement par des méthodes assez invasives, notamment les biopsies de peau ou prélèvements sanguins. Ceci peut représenter un frein à leur utilisation notamment chez les enfants et surtout les enfants malades. La différenciation neuronale privilégiée est la voie dopaminergique (DA) car c'est ce type cellulaire qui est principalement atteint chez les schizophrènes. C'est pourquoi on priorise pour ce projet l'utilisation de cellules contenues dans l'urine, qui seront reprogrammées via un virus non-intégratif, le virus de Sendaï (SeV). La différenciation neuronale nous permettra d'obtenir des neurones DA fonctionnels, caractérisés par électrophysiologie. Les expériences ont montré une très grande efficacité de reprogrammation cellulaire au niveau des cellules d'urine, ainsi qu'un grand potentiel de différenciation neuronale, malgré quelques différences observées entre les lignées saines et schizophréniques. Grâce à ce projet, la réalisation d'un modèle cellulaire pour la Schizophrénie a pu être établie. Les différences notées entre les lignées pendant la différenciation ouvrent une nouvelle voie pour approfondir l'étude de la maladie au niveau cellulaire et moléculaire. / Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) were conceived for the first time in 2007 in Japan, by Doctor Yamanaka’s team. These are somatic cells reprogrammed thanks to a retrovirus allowing, for example, neuronal differentiation for the purpose of neurodevelopmental disorders studies such as Schizophrenia. Today, the removal of somatic cells is mainly made by enough invasive methods, including skin and blood biopsies. This can represent a brake in their use predominantly children, mainly sick children. The preferred neuronal differentiation is the dopaminergic (DA) way because it's the mostly cell type affected in schizophrenics. That's why we prioritize the use of urine cells for this project, reprogrammed via a non integrative virus, the Sendai virus (SeV). The neuronal differentiation enables us to get functional DA neurons characterized by electrophysiology. Experimentations show a huge efficiency of urine cells reprogramming as well as a great potential of neuronal differentiation despite some distinctions between the two lines. Thanks to this project, the achievement of a cellular model for Schizophrenia could be established. The differences noticed between the two lines during the differentiation open up a new way to make cellular and molecular studies of this disease deeper.

Les fusions de MLL peuvent générer trois types de leucémies aiguës (LLA-B, LMA et LLA-T). Les cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées par une méthode de sélection négative ont été infectées par un rétrovirus contrôle exprimant la EGFP ou un rétrovirus exprimant un gène de fusion de MLL et la EGFP, avant d’être injectées dans le fémur de souris immunodéficientes. Après 20 semaines, les souris ont été sacrifiées et les organes hématopoïétiques ont été analysés par FACS. MLL-ENL a généré exclusivement des LLA-B, MLL-ELL des LLA-B et LMA, et MLL-AF9 des LLA-B et mixte. Il semble que certains partenaires peuvent jouer un rôle important dans le phénotype et que le microenvironnement murin peut favoriser le phénotype LLA-B. Cette étude peut aider à comprendre le rôle instructif des MLL-ENL, MLL-ELL et MLL-AF9 sur le phénotype leucémique et leur capacité à initier la transformation des cellules normales en cellules leucémiques. / MLL fusion genes may generate three different types of acute leukemia (B-ALL, AML and T-ALL). Purified human cord blood cells by negative selection technique (Lin-CB) and having CD34+ > 70% were transduced by control retrovirus expressing the EGFP or other retrovirus expressing an MLL fusion gene and the EGFP, and then injected into the immune-deficient NSG mouse femur to test the leukemogenic potential. After 20 weeks, the mice were sacrificed and organs were analysed by FACS. MLL-ENL exclusively produced B-ALL, MLL-ELL B-ALL and AML, and MLL-AF9 B-ALL and mixed. It seems that some MLL partner genes may play an important role in phenotype, and the murine microenvironment of our in vivo model may promote the B-ALL phenotype. This study may help understand the instructive role of MLL-ENL, MLL-ELL and MLL-AF9 fusion genes in leukemic phenotype and their ability to induce the transformation of normal hematopoietic stem/progenitor cells into leukemic cells.

Avec leurs caractéristiques d'auto-renouvellement illimité et de pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent une source infinie de cellules pour la thérapie cellulaire de maladies, telle que la dystrophie musculaire de Duchenne. Des études ont démontré que les hESC pouvaient être différenciées en cellules musculaires squelettiques, mais les techniques employées sont longues et inefficaces. Ce mémoire décrit un nouveau protocole de différenciation des hESC en cellules musculaires squelettiques à l'aide d'un adénovirus exprimant le gène MyoD sous le contrôle du promoteur CAO (Ad.CAO-MyoD). L'efficacité de ce virus pour induire la myogenèse des hESC a été mise en évidence par la présence de divers marqueurs myogéniques. Ensuite, le potentiel de fusion de ces cellules a été illustré par le marquage de la MyHC et par l'observation de quelques myotubes. Ces résultats préliminaires semblent indiquer que l'Ad.CAO-MyoD est un outil prometteur pour différencier les hESC en cellules musculaires squelettiques.

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Le traitement des ulcères cutanés constitue un défi majeur et les options thérapeutiques efficaces demeurent limitées. Le but du présent projet était de concevoir et d’évaluer le potentiel de pansements biologiques fabriqués à partir de cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA) à favoriser la guérison de plaies cutanées. Des pansements faits de CSTA ou de CSTA différenciées en adipocytes ont été mis au point en utilisant la technique d’auto-assemblage développée au LOEX et évalués sur un modèle d’étude in vitro adapté pour l’étude de pansements. L’effet de ces pansements a été évalué en mesurant la progression de la réépithélialisation des plaies in vitro, en caractérisant leur sécrétome et en réalisant des analyses histologiques et immunohistochimiques. Cette recherche suggère que les CSTA différenciées en adipocytes pourraient être utilisées en complément ou alternativement aux fibroblastes dermiques pour la production de recouvrements autologues utiles dans le traitement des plaies cutanées. / Treatment of chronic wounds remains a major challenge in clinic and efficient treatment options are still limited. The goal of this project was to create and evaluate the potential of bioengineered cellular wound dressings made of adipose-derived stem/stromal cells (ASCs) for cutaneous wound healing. Dressings made of ASCs differentiated or not towards the adipogenic lineage were produced using the self-assembly approach and were evaluated using an adapted in vitro wound healing model. The effect of these dressings was assessed by measuring the progression of reepithelialisation on in vitro wounds, by characterizing dressing’s secreted products and by histological and immunohistochemical analyses. This research suggests that ASCs could be used as an alternative or a complement to dermal fibroblasts for the production of autologous dressings useful for healing of chronic wounds.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèse. / DNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis.