The structure and function of RNA molecules are dependent on RNA-metal ion interactions in both diffusive and direct ways. Structural information for RNA has been obtained using various biophysical and biochemical methods. In this study, using site-directed spin labeling (SDSL) and EPR spectroscopy, distances in RNA duplexes, TAR RNA, and the hammerhead ribozyme have been measured to investigate RNA structures. Kinetic measurements have been performed in the extended hammerhead ribozyme to correlate the catalytic function with metal dependent ribozyme folding. As a basic model system for distance measurements, inter-spin distances in RNA duplexes with spin labels at various positions are measured using SDSL with continuous EPR and a Fourier deconvolution method. Divalent metal-ion dependent TAR RNA folding from bent to extended conformers is monitored by measuring inter-spin distances near the bulge region. In order to investigate a proposed loop-loop interaction in the extended hammerhead ribozyme which significantly enhances the ribozyme activity, distance measurements, dynamics studies, and kinetics measurements have been performed. We have introduced PELDOR long-distance measurements in order to investigate metal dependent folding of the hammerhead ribozyme. The dynamics of the spin labels attached to the hammerhead ribozyme with increasing mono- and divalent metal ion concentrations are monitored using CW EPR spectroscopy at room temperature. EPR data show that a loop-loop interaction occurs near the U1.6 nucleotide, and that in 0.1 M NaCl the docking occurs at submillimolar Mg2+ concentrations ([Mg2+]1/2, docking = ~ 0.7 mM). Kinetics measurements show that the hammerhead ribozyme requires high concentration of Mg2+ for the maximum cleavage activity ([Mg2+]1/2, cleavage = ~ 90 mM).

The structure and function of RNA molecules are dependent on RNA-metal ion interactions in both diffusive and direct ways. Structural information for RNA has been obtained using various biophysical and biochemical methods. In this study, using site-directed spin labeling (SDSL) and EPR spectroscopy, distances in RNA duplexes, TAR RNA, and the hammerhead ribozyme have been measured to investigate RNA structures. Kinetic measurements have been performed in the extended hammerhead ribozyme to correlate the catalytic function with metal dependent ribozyme folding. As a basic model system for distance measurements, inter-spin distances in RNA duplexes with spin labels at various positions are measured using SDSL with continuous EPR and a Fourier deconvolution method. Divalent metal-ion dependent TAR RNA folding from bent to extended conformers is monitored by measuring inter-spin distances near the bulge region. In order to investigate a proposed loop-loop interaction in the extended hammerhead ribozyme which significantly enhances the ribozyme activity, distance measurements, dynamics studies, and kinetics measurements have been performed. We have introduced PELDOR long-distance measurements in order to investigate metal dependent folding of the hammerhead ribozyme. The dynamics of the spin labels attached to the hammerhead ribozyme with increasing mono- and divalent metal ion concentrations are monitored using CW EPR spectroscopy at room temperature. EPR data show that a loop-loop interaction occurs near the U1.6 nucleotide, and that in 0.1 M NaCl the docking occurs at submillimolar Mg2+ concentrations ([Mg2+]1/2, docking = ~ 0.7 mM). Kinetics measurements show that the hammerhead ribozyme requires high concentration of Mg2+ for the maximum cleavage activity ([Mg2+]1/2, cleavage = ~ 90 mM).

Le travail méthodologique mis en place durant cette thèse a consisté en l'optimisation des acquisitions et des traitements de données pour l'imagerie quantitative de la perfusion cérébrale et de la vasoréactivité en ASL. Dans un premier temps, une méthode originale pour mesurer la largeur du bolus des spins marqués appelée BoTuS (Bolus Turbo Sampling) a été mise en place et validée afin d'améliorer la quantification de la perfusion cérébrale basale en ASL. Les acquisitions en ASL pulsé ont été comparé aux mesures de perfusion en premier passage gadolinium et en premier passage de produit de contraste iodé en scanner X sur des patients atteints de tumeurs cérébrales. Dans un second temps, afin d'améliorer la qualité des cartes de vasoréactivité en ASL, des analyses des variations physiologiques des sujets ont été implémenté afin d'être utilisé comme modèle dans l'analyse statistique des données. Enfin, ces méthodes optimisées au niveau de l'acquisition et de la chaîne traitement ont été appliquées sur des populations de sujets sains et de patients afin de les valider. Les applications cliniques ont été menées sur des patients porteurs de la maladie d'Alzheimer où l'on a montré une baisse de la vasoréactivité par rapport aux témoins âgés. La perfusion cérébrale et la vasoréactivité de sujets atteints de sténoses a été étudié. Enfin, une étude avant et après acclimatation à l'altitude a montré qu'un séjour de 7 jours à 4365 m augmente le débit sanguin cérébral et diminue la vasoréactivité cérébrale. / The methodological aspects implemented during this Ph.D. thesis consisted of the optimization of the acquisitions and data processing of ASL imaging for quantitative assessment of cerebral perfusion and vasoreactivity. First of all, an original technique called BoTuS (Bolus Turbo Sampling) was implemented and validated,with the aim to render the quantification of the pulsed ASL signal more robust. Cerebral blood flow measurements obtained using pulsed ASL were compared to gold standard techniques such as the first passage of gadolinium MRI and CT-scan perfusion in a population of patients with treated brain tumors. Secondly, a new processing technique was tested, taking into account the physiological state of the subject during the exam to model the ASL signal during the vasoreactivity paradigm, and thus to provide more reliable maps at the subject level. Finally, these methods were applied in various studies on healthy subjects and patients. A decrease in vasoreactivity was found in Alzheimer disease patients compared to elderly subjects. Studies on patients with severe stenosis were conducted to test our methods at the subject level. An increase in CBF and a decrease in vasoreactivity in subjects exposed to high altitude at 4365 m during 7 days was demonstrated and correlated to transcranial Doppler results.

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Le dioxyde de carbone (CO2) est un résidu naturel du métabolisme cellulaire, la troisième substance la plus abondante du sang, et un important agent vasoactif. À la moindre variation de la teneur en CO2 du sang, la résistance du système vasculaire cérébral et la perfusion tissulaire cérébrale subissent des changements globaux. Bien que les mécanismes exacts qui sous-tendent cet effet restent à être élucidés, le phénomène a été largement exploité dans les études de réactivité vasculaire cérébrale (RVC). Une voie prometteuse pour l’évaluation de la fonction vasculaire cérébrale est la cartographie de la RVC de manière non-invasive grâce à l’utilisation de l’Imagerie par Résonance Magnétique fonctionnelle (IRMf). Des mesures quantitatives et non-invasives de de la RVC peuvent être obtenus avec l’utilisation de différentes techniques telles que la manipu- lation du contenu artériel en CO2 (PaCO2) combinée à la technique de marquage de spin artériel (Arterial Spin Labeling, ASL), qui permet de mesurer les changements de la perfusion cérébrale provoqués par les stimuli vasculaires. Toutefois, les préoccupations liées à la sensibilité et la fiabilité des mesures de la RVC limitent de nos jours l’adoption plus large de ces méthodes modernes de IRMf. J’ai considéré qu’une analyse approfondie ainsi que l’amélioration des méthodes disponibles pourraient apporter une contribution précieuse dans le domaine du génie biomédical, de même qu’aider à faire progresser le développement de nouveaux outils d’imagerie de diagnostique. Dans cette thèse je présente une série d’études où j’examine l’impact des méthodes alternatives de stimulation/imagerie vasculaire sur les mesures de la RVC et les moyens d’améliorer la sensibilité et la fiabilité de telles méthodes. J’ai aussi inclus dans cette thèse un manuscrit théorique où j’examine la possible contribution d’un facteur méconnu dans le phénomène de la RVC : les variations de la pression osmotique du sang induites par les produits de la dissolution du CO2. Outre l’introduction générale (Chapitre 1) et les conclusions (Chapitre 6), cette thèse comporte 4 autres chapitres, au long des quels cinq différentes études sont présentées sous forme d’articles scientifiques qui ont été acceptés à des fins de publication dans différentes revues scientifiques. Chaque chapitre débute par sa propre introduction, qui consiste en une description plus détaillée du contexte motivant le(s) manuscrit(s) associé(s) et un bref résumé des résultats transmis. Un compte rendu détaillé des méthodes et des résultats peut être trouvé dans le(s) dit(s) manuscrit(s). Dans l’étude qui compose le Chapitre 2, je compare la sensibilité des deux techniques ASL de pointe et je démontre que la dernière implémentation de l’ASL continue, la pCASL, offre des mesures plus robustes de la RVC en comparaison à d’autres méthodes pulsés plus âgées. Dans le Chapitre 3, je compare les mesures de la RVC obtenues par pCASL avec l’utilisation de quatre méthodes respiratoires différentes pour manipuler le CO2 artérielle (PaCO2) et je démontre que les résultats peuvent varier de manière significative lorsque les manipulations ne sont pas conçues pour fonctionner dans l’intervalle linéaire de la courbe dose-réponse du CO2. Le Chapitre 4 comprend deux études complémentaires visant à déterminer le niveau de reproductibilité qui peut être obtenu en utilisant des méthodes plus récentes pour la mesure de la RVC. La première étude a abouti à la mise au point technique d’un appareil qui permet des manipulations respiratoires du CO2 de manière simple, sécuritaire et robuste. La méthode respiratoire améliorée a été utilisée dans la seconde étude – de neuro-imagerie – où la sensibilité et la reproductibilité de la RVC, mesurée par pCASL, ont été examinées. La technique d’imagerie pCASL a pu détecter des réponses de perfusion induites par la variation du CO2 dans environ 90% du cortex cérébral humain et la reproductibilité de ces mesures était comparable à celle d’autres mesures hémodynamiques déjà adoptées dans la pratique clinique. Enfin, dans le Chapitre 5, je présente un modèle mathématique qui décrit la RVC en termes de changements du PaCO2 liés à l’osmolarité du sang. Les réponses prédites par ce modèle correspondent étroitement aux changements hémodynamiques mesurés avec pCASL ; suggérant une contribution supplémentaire à la réactivité du système vasculaire cérébral en lien avec le CO2. / Carbon dioxide (CO2) is a natural byproduct of cellular metabolism, the third most abundant substance of blood, and a potent vasoactive agent. The resistance of cerebral vasculature and perfusion of the brain tissue respond to the slightest change in blood CO2 content. The physiology of such an effect remains elusive, yet the phenomenon has been widely exploited in studies of the cerebral vascular function. A promising avenue for the assessment of brain’s vascular function is to measure the cerebrovascular reactivity to CO2 (CVR) non-invasively using functional MRI. Quantitative and non-invasive mapping of CVR can be obtained using respiratory manipulations in arterial CO2 and Arterial Spin Labeling (ASL) to measure the perfusion changes associated with the vascular stimulus. However, concerns related to the sensitivity and reliability of CVR mea- sures by ASL still limit their broader adoption. I considered that a thorough analysis and amelioration of available methods could bring a valuable contribution in the domain of biomedical engineering, helping to advance new diagnostic imaging tools. In this thesis I present a series of studies where I exam the impact of alternative manipulation/ASL methods on CVR measures, and ways to improve the sensitivity and reliability of these measures. I have also included in this thesis a theoretical paper, where I exam the possible contribution of an unappreciated factor in the CVR phenomenon: the changes in blood osmotic pressure induced by the products of CO2 dissolution. Apart from a general introduction (Chapter 1) and conclusion (Chapter 6), this thesis comprises 4 other chapters, in which five different research studies are presented in the form of articles accepted for publication in scientific journals. Each of these chapters begins with its own specific introduction, which consists of a description of the background motivating the study and a brief summary of conveyed findings. A detailed account of methods and results can be found in the accompanying manuscript(s). The study composing Chapter 2 compares the sensitivity of two state-of-the-art ASL techniques and show that a recent implementation of continuous ASL, pCASL, affords more robust measures of CVR than older pulsed methods. The study described in Chapter 3 compares pCASL CVR measures obtained using 4 different respiratory methods to manipulate arterial CO2 (PaCO2) and shows that results can differ significantly when manipulations are not designed to operate at the linear range of the CO2 dose-response curve. Chapter 4 encompasses two complementary studies seeking to determine the degree of reproducibility that can be attained measuring CVR using the most recent methods. The first study resulted in the technical development of a breathing apparatus allowing simple, safe and robust respiratory CO2 manipulations. The improved respiratory method was used in the second – neuroimaging – study, in which I and co-authors investigate the sensitivity and reproducibility of pCASL measuring CVR. The pCASL imaging technique was able to detect CO2-induced perfusion responses in about 90% of the human brain cortex and the reproducibility of its measures was comparable to other hemodynamic measures already adopted in the clinical practice. Finally, in Chapter 5 I present a mathematical model that describes CVR in terms of PaCO2-related changes in blood osmolarity. The responses predicted by this model correspond closely to the hemodynamic changes measured with pCASL, suggesting an additional contribution to the reactivity of cerebral vasculature to CO2.

Die magnetische Blutbolusmarkierung (Spin-Labeling) ermöglicht die nichtinvasive quantitative Messung des Blutflusses im Gewebe. Beim Spin-Labeling wird arterielles Blut durch Radiofrequenzpulse magnetisch markiert und der Transport der Markierung MR-tomographisch gemessen. Am Modell einer unter physiologischen Bedingungen perfundierten extrakorporalen Schweineniere konnte die Quantifizierbarkeit der Messmethode nachgewiesen werden. In einer Studie an 36 Hirntumorpatienten wurde das Verfahren mit der kontrastmittelbasierten First-Pass-Bolus-Methode zur nicht-quantitativen Perfusionsmessung verglichen. Es zeigte sich eine sehr gute Übereinstimmung zwischen beiden Methoden, der lineare Korrelationskoeffizient des relativen Blutflusses in der Tumorregion lag bei R=0,83. Die mittels Spin-Labeling ermittelten Absolutwerte des Blutflusses spielen bei der Beurteilung des Tumorgrades eine untergeordnete Rolle, da die mittlere Perfusion individuell sehr verschieden ist. Ein zweiter Anwendungsbereich für das Spin-Labeling ist die Darstellung großer Arterien. Spin-Labeling ermöglicht die nichtinvasive dynamische Angiographie (Dynamische Spin-Labeling-Angiographie - DSLA). Analog zur digitalen Subtraktionsangiographie kann damit der Einstromvorgang des Blutes in den Gefäßbaum zeitaufgelöst gemessen werden, jedoch mit wesentlich höherer zeitlicher Auflösung und frei wählbarer Projektionsrichtung. In einer Studie an 18 Patienten mit einseitigen Carotisstenosen wurden die Zeitdifferenzen der Anflutung der zerebralen Gefäße zwischen der betroffenen und der nicht stenosierten Seite bestimmt. Die im Carotis-Siphon gemessenen Zeitdifferenzen korrelieren signifikant mit dem Stenosegrad, steigen aber erst ab einer Lumeneinengung oberhalb von 80 Prozent deutlich an. Im Vergleich zu den etablierten Methoden werden die Möglichkeiten und Grenzen der DSLA dargestellt. / Arterial spin labeling methods allow to determine quantitative tissue blood flow values noninvasively. Arterial blood is labelled by an inversion pulse and the distribution of this intrinsic tracer is measured using magnetic resonance imaging. Experiments using an extra corporal in-vitro porcine kidney in a MR compatible set-up were carried out to determine the accuracy of blood flow values calculated from arterial spin labeling measurements. In a study of 36 brain tumor patients, spin labeling was compared to non-quantitative contrast-enhanced dynamic susceptibility-weighted perfusion imaging. Relative blood flow values determined with both methods were in good agreement, the linear regression coefficient in the tumor region was R=0.83. Due to the variable individual perfusion state, quantitative blood flow values determined using spin labeling play a minor role in the assessment of tumor grade. Application of spin labeling to angiography of major arteries was investigated. Dynamic spin labeling angiography (DSLA) sequences were implemented and tested on a clinical scanner. This technique allows time-resolved depiction of blood flow in large vessels with very high temporal resolution. As opposed to digital subtraction angiography, the method allows arbitrary projection directions. In a study, 18 patients with one-sided carotid stenoses were examined. In these patients the time differences of blood bolus arrival at both hemispheres were determined. Time differences measured in the carotid siphon show a significant correlation with the degree of stenosis. However, a clear increase is not seen until 80% narrowing of a carotid. Possibilities and limitations of the DSLA method are discussed in comparison to established techniques.

Die zerebrale Perfusion ist eine wichtige physiologische Größe, die den Blutfluss in grauer bzw. weißer Hirnsubstanz beschreibt. Zur Perfusionsmessung in der klinischen Anwendung hat sich pseudo-kontinuierliches Arterielles Spin-Labeling (pCASL) als nichtinvasive Methode in der Magnetresonanzbildgebung etabliert. Das Anliegen der vorliegenden Arbeit ist es, pCASL zu charakterisieren und die Ursache für dessen Empfindlichkeit gegenüber intrinsischen Magnetfeldgradienten zu untersuchen. Anhand von Simulationen mit der Bloch-Gleichung konnten optimale Messparameter abgeleitet werden, um das Verfahren in dieser Hinsicht robuster zu machen. Die damit unabhängig von intrinsischen Magnetfeldgradienten bei 3\,T vorhergesagte hohe Labeling-Effizienz von 90\,\% wurde in vivo mittels eines eigens dafür entwickelten Messverfahrens experimentell validiert. / Cerebral perfusion is an important physiological parameter that describes the blood flow in brain tissue. To measure perfusion in a clinical setting, pseudo-continuous arterial spin labeling (pCASL) has been established as noninvasive method in magnetic resonance imaging. The purpose of this work is to characterize pCASL and to investigate its susceptibility to intrinsic magnetic field gradients. By simulations based on the Bloch equation, optimal parameter settings could be derived with particular focus on robustness against their impairing influence. As a result, a high labeling efficiency of 90\% was predicted independently of magnetic field gradients at 3\,T. This finding could finally be validated in vivo by a dedicated experimental approach.

Le flux sanguin cérébral (CBF) caractérise la micro-circulation et l'irrigation des tissus. Cette information de perfusion cérébrale est utilisé en clinique pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de nombreuses maladies. La technique de mesure de CBF la moins invasive est celle par marquage de spins artériels (ASL) où l'eau du sang fait office de traceur. L'objectif de cette thèse, menée dans le cadre d'une convention CIFRE, consistait à faciliter l'utilisation de séquences ASL continues et pseudo-continues (CASL, pCASL) ainsi qu'à améliorer leur performance en pré-clinique. En effet, la mesure quantitative de CBF par ASL est un protocole complexe qui nécessite plusieurs étapes d'ajustements, d'acquisitions et de traitement de données. Dans le but d'alléger ce protocole, un package CASL a été développé en collaboration avec Bruker. Plusieurs étapes d'ajustements et de post-processing ont été automatisées, rendant la génération de cartes CBF relatives et absolues plus aisée. Le champ magnétique élevé des scanners IRM pré-cliniques présente de nombreux avantages mais est également une source de problèmes en ASL. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux d'entre eux : l'instabilité du marquage de spins et l'échauffement induit par les séquences ASL. Pour stabiliser le marquage ASL, une stratégie d'optimisation de la séquence pCASL a été développée et testée chez le rat à 9.4 T. Ceci a permis l'obtention d'un marquage robuste, même en situations de shim dégradé. Le package pCASL a été partagé avec dix autres instituts dans le monde. L'échauffement induit lors de séquences CASL et pCASL par le dépôt d'énergie radiofréquence a été caractérisé globalement et localement, dans le cerveau et au niveau des carotides, pour deux configurations d'antenne d'émission. Pour finir, une séquence pCASL encodée en temps a été développée et appliquée à la souris, dans le cadre d'une collaboration avec des équipes néerlandaises du Leiden University Medical Center. Cet outil permet la mesure simultanée de CBF et du temps de transit artériel, un paramètre pouvant refléter des pathologies vasculaires sous-jacentes. / Cerebral blood flow (CBF) characterizes the blood supply to brain tissue. This perfusion-related parameter contributes in diagnosis and therapeutic follow-up in many diseases. The least invasive technique to measure CBF is arterial spin labeling (ASL), where arterial water is used as tracer. The aim of this PhD project, conducted within a CIFRE agreement (Convention Industrielle de Formation par la REcherche), was to increase the performance and to facilitate the use of continuous and pseudo-continuous arterial spin labeling (CASL, pCASL) tools in preclinical studies. CBF quantification by means of ASL is one of the most challenging MRI modalities in terms of the workflow, since additional adjustments, acquisitions and post-processing steps are required. First, to render the workflow smoother for the user, a CASL package has been developed in collaboration with Bruker. This workflow allows easier relative and absolute CBF measurements, thanks to the integration of automated adjustments and reconstruction steps. In a second step, problems arising at high magnetic field were addressed. A strategy to optimize the pCASL labeling sequence in order to obtain robust results was developed and its robustness towards suboptimal shim conditions was demonstrated at 9.4 T in rats. The developed pCASL-package, consisting of three sequences, was shared with ten other institutes worldwide. Another issue encountered at high magnetic fields is heating due to RF power deposition, which was assessed locally in the brain and in the carotids, as well as globally, for the CASL and pCASL sequences and for two different transmit coil configurations. In a third step, time-encoded pCASL was developed in mice in collaboration with teams of the Leiden University Medical Center. This tool enables the simultaneous mapping of CBF and arterial transit time, a parameter that can reflect underlying pathologies such as increased vessel tortuosity or occlusion.

AcrA is the periplasmic component of an efflux system AcrA-AcrB-TolC, which can expel different classes of antibiotics. AcrB is the inner membrane (IM) pump that utilizes proton-motive force for the active transport, TolC is the outer membrane (OM) channel, and AcrA coordinates the actions of AcrB and TolC, so that substrates are expelled across the two membranes, bypassing the periplasm. It has been proposed that AcrA either provides a static seamless link between AcrB and TolC, or acts like its analogous viral membrane fusion protein (MFP) and actively brings the IM and OM closer for substrate transfer. To better understand the role of AcrA in the efflux mechanism, site-directed spin labeling (SDSL)/EPR (electron paramagnetic resonance) spectroscopy is used to investigate the structure and dynamics of AcrA in solution. My results demonstrated that AcrA is a dynamic protein that undergoes pH-dependent and reversible conformational changes. AcrA contains an interrupted alpha-helical, coiled-coil domain flanked by a pair of beta-stranded lipoyl motifs, and my SDSL/EPR analysis revealed that the pH-induced conformation change mainly involves the coiled-coil and the lipoyl domains. In addition, I found that each AcrA monomer folds into an intra-molecular hairpin and AcrA monomers oligomerize with their coiled-coil hairpins aligned in parallel. Unlike the pH-induced conformational rearrangement of a viral MFP, change in pH alters both intra- and inter-molecular interaction along the coiled-coil of AcrA without rearranging the hairpin fold. The organization of AcrA protomers and its pH-induced conformational switching are, however, congruent with the TolC coiled-coil hairpins in the iris-like opening of the TolC channel. Together, my studies suggest that rather than being a passive structural linkage between AcrB and TolC, AcrA plays an active role mediating the drug efflux. The reported AcrA dynamics provides new insights into the AcrA-TolC interactions for the channel opening during the efflux process.