Neuronal nitric oxide (NO) synthase (NOS-I) and its adaptor protein (NOS1AP) have been repeatedly and consistently associated with neuropsychiatric disorders in several genetic association and linkage studies, as well as functional studies. NOS-I has an extended PDZ domain which enables it to interact with postsynaptic density protein 95 (PSD-95) bringing NOS-I in close proximity to NMDA receptors. This interaction allows NMDA receptor activity dependent calcium-influx to activate NOS-I, linking NO synthesis to regulation of glutamatergic signaling pathways. NOS1AP is a PDZ-domain ligand of NOS-I and has been proposed to compete with PSD-95 for NOS-I interaction. Studies performed on post-mortem brain tissues have shown increased expression of NOS1AP in patients with schizophrenia and bipolar disorder, suggesting that increased NOS-I/NOS1AP interactions might be involved in neuropsychiatric disorders possibly through disruption of NOS-I PDZ interactions. Therefore, I have investigated the involvement of NOS-I in different endophenotypes of neuropsychiatric disorders by targeting its specific PDZ interactions in vitro and in vivo. To this end, I used recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors expressing NOS1AP isoforms/domains (NOS1AP-L: full length NOS1AP; NOS1AP-LC20: the last 20 amino acids of NOS1AP-L, containing the PDZ interaction motif suggested to stabilize interaction with NOS-I; NOS1AP-LΔC20: NOS1AP-L lacking the last 20 amino acids; NOS1AP-S: the short isoform of NOS1AP), residues 396-503 of NOS1AP-L (NOS1AP396-503) encoding the full NOS-I interaction domain, and N-terminal 133 amino acids of NOS-I (NOS-I1-133) encoding for the extended PDZ-domain. Neuropsychiatric disorders involve morphological brain changes including altered dendritic development and spine plasticity. Hence, I have examined dendritic morphology in primary cultured hippocampal and cortical neurons upon overexpression of constructed rAAV vectors. Sholl analysis revealed that overexpression of NOS1AP-L and NOS1AP-LΔC20 mildly reduced dendritic length/branching. Moreover, overexpression of all NOS1AP isoforms/domains resulted in highly altered spine plasticity including significant reduction in the number of mature spines and increased growth of filopodia. These findings suggest that NOS1AP affects dendritic growth and development of dendritic spines, which may involve both, increased NOS-I/NOS1AP interaction as well as interaction of NOS1AP with proteins other than NOS-I. Interestingly, the observed alterations in dendritic morphology were reminiscent of those observed in post-mortem brains of patients with neuropsychiatric disorders. Given the dendritic alterations in vitro, I have examined, whether disruption of NOS-I PDZ interaction would also result in behavioral deficits associated with neuropsychiatric disorders. To this end, rAAV vectors expressing NOS1AP-L, NOS1AP396-503, NOS-I1-133, and mCherry were stereotaxically delivered to the dorsal hippocampus of 6-week-old male C57Bl/6J mice. One week after surgery, mice were randomly separated into two groups. One of those groups underwent three weeks of chronic mild stress (CMS). Afterwards all mice were subjected to a comprehensive behavioral analysis. The findings revealed that overexpression of the constructs did not result in phenotypes related to anxiety or depression, though CMS had an anxiolytic effect independent of the injected construct. Mice overexpressing NOS-I1-133, previously shown to disrupt NOS-I/PSD-95 interaction, showed impaired spatial memory, sensorimotor gating, social interaction, and increased locomotor activity. NOS1AP overexpressing mice showed mild impairments in sensorimotor gating and spatial working memory and severely impaired social interaction. NOS1AP396-503 overexpressing mice also showed impaired social interaction but enhanced sensorimotor gating and reduced locomotor activity. Taken together, these behavioral findings indicate an involvement of NOS-I PDZ interactions in phenotypes associated with positive symptoms and cognitive deficits of psychotic disorders. In summary, this study revealed an important contribution of NOS-I protein interactions in the development of endophenotypic traits of neuropsychiatric disorders, in particular schizophrenia, at morphological and behavioral levels. These findings might eventually aid to a better understanding of NOS-I-dependent psychopathogenesis, and to develop pharmacologically relevant treatment strategies. / Die neuronal Stickstoffmonoxid(NO)synthase (NOS-I) und deren Adapterprotein (NOS1AP) wurden in mehreren Genassoziations- und Genkopplungsstudien, sowie funktionellen Studien, wiederholt und konsistent mit neuropsychiatrischen Störungen assoziiert. NOS-I trägt eine erweiterte PDZ Domäne, die eine Interaktion mit postsynaptic density protein 95 (PSD-95) ermöglicht und es in die Nähe von NMDA Rezeptoren bringt. Diese Interaktion erlaubt es NMDA Rezeptoraktivitätsabhängigen Kalziumeinstrom NOS-I zu aktivieren, was die Synthese von NO an die Regulierung glutamaterger Signalwege koppelt. NOS1AP ist ein Ligand der NOS-I PDZ Domäne und NOS1AP kompetiert mit PSD-95 um die Bindung mit NOS-I. Post mortem Untersuchungen zeigten eine erhöhte Expression von NOS1AP im Gehirn von Patienten mit Schizophrenie und bipolarer Störung, was eine erhöhte NOS-I/NOS1AP Interaktion (was möglicherweise zu gestörter NOS-I PDZ Interaktion führt) mit neuropsychiatrischen Störungen verbindet. Daher habe ich den Einfluss von NOS-I auf Endophänotypen neuropsychiatrischer Störungen untersucht, indem ich spezifische PDZ Interaktionen von NOS-I in vitro und in vivo gestört habe. Dazu verwendete ich rekombinante Adenoassozierte virale (rAAV) Vektoren, die NOS1AP Isoformen/Domänen (NOS1AP-L: Volllänge NOS1AP; NOS1AP-LC20: Die letzten 20 Aminosäuren von NOS1AP-L, welche das PDZ Interaktionsmotiv enthalten, das zur Stabilisierung der Interaktion mit NOS-I beiträgt; NOS1AP-LΔC20: NOS1AP-L dessen letzte 20 Aminosäuren fehlen; NOS1AP-S: die Kurzform von NOS1AP), Aminosäurereste 396-503 von NOS1AP-L (NOS1AP396-503), welche die volle NOS-I Interaktionsdomäne kodieren, und die N-terminalen 133 Aminosäuren von NOS-I (NOS-I1-133), welche die erweiterte PDZ Domäne enthalten. Bei neuropsychiatrischen Störungen kommt es zu morphologischen Änderungen des Gehirns, einschließlich veränderter dendritischer Entwicklung und Plastizität dendritischer Dornfortsätze (‚spines‘). Daher habe ich die dendritische Morphologie in primär kultivierten Hippokampal- und Kortikalneuronen nach Überexpression der konstruierten rAAV Vektoren untersucht. Eine Sholl Analyse ergab dabei, dass die Überexpression von NOS1AP-L und NOS1AP-LΔC20 die Länge und Anzahl dendritscher Verzweigungen leicht reduzierte. Zudem führte die Überexpression aller NOS1AP Isoformen/Domänen zu einer stark veränderten Plastizität dendritischer ‚spines‘, einschließlich einer signifikanten Reduktion der Anzahl ausgereifter ‚spines‘ und einem erhöhten Wachstum von Filopodien. Diese Ergebnisse zeigen, dass NOS1AP einen Einfluss auf das dendritische Wachstum und die Entwicklung dendritischer ‚spines‘ hat, dem sowohl eine erhöhte NOS-I/NOS1AP Interaktion, sowie Interaktionen von NOS1AP mit anderen Proteinen zugrunde liegen könnten. Interessanterweise, ähnelten die beobachteten Veränderungen solchen, die in post mortem Gehirnen von Patienten mit neuropsychiatrischen Störungen beobachtet wurden. Aufgrund der Beobachtungen in vitro, habe ich untersucht, ob eine Störung der NOS-I PDZ Interaktion auch zu Verhaltensdefiziten, die mit neuropsychiatrischen Störungen assoziiert sind, führt. Zu diesem Zweck, wurden rAAV Vektoren, die NOS1AP-L, NOS1AP396-503, NOS-I1-133,und mCherry exprimieren, stereotaxisch in den dorsalen Hippokampus von sechs Wochen alten männlichen C57Bl/6J Mäusen injiziert. Eine Woche nach der Operation wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine dieser Gruppen wurde für drei Wochen dem ‚chronic mild stress‘(CMS) Paradigma unterzogen. Im Anschluss daran wurden alle Mäuse einer umfassenden Verhaltensanalyse unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression der Konstrukte nicht zu Angst- oder Depressionsassoziierten Phänotypen führten. Jedoch hatte das CMS Paradigma einen anxiolytischen Effekt, der unabhängig vom injizierten Konstrukt war. Eine Überexpression des NOS-I1-133 Konstruktes, von welchem zuvor eine Störung der NOS-I/PSD-95 Interaktion nachgewiesen wurde, führte zu Störungen des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses, der Reaktionsunterdrückung (‚sensorimotor gating‘) und der sozialen Interaktion, sowie zu erhöhter lokomotorischer Aktivität. NOS1AP überexprimierende Mäuse zeigten leichte Störungen in der Reaktionsunterdrückung und des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses, sowie erheblich gestörte soziale Interaktionen. NOS1AP396-503 überexprimierende Mäuse zeigten ebenfalls gestörte soziale Interaktion, jedoch eine erhöhte Reaktionsunterdrückung und verminderte lokomotorische Aktivität. Zusammengenommen, deuten diese Verhaltensuntersuchungen auf einen Beitrag der NOS-I PDZ Interaktionen zu Phänotypen, die mit positiven Symptomen und kognitiven Defiziten bei Psychosen assoziiert sind, hin. Zusammengefasst konnte diese Studie einen wichtigen Beitrag der NOS-I Proteininteraktionen bei der Entstehung endophenotypischer Züge (morphologisch sowie im Verhalten) neuropsychiatrischer Störungen, insbesondere der Schizophrenie, aufzeigen. Diese Erkenntnisse könnten zu einem besseren Verständnis NOS-I abhängiger Psychopathogenese, sowie zur Entwicklung relevanter pharmakologischer Behandlungsstrategien führen.

Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer übermäßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen führen kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiemöglichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es ermöglichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden können, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden können. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert – den Zellen, die wahrscheinlich für den übermäßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer stärkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erhöhten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reportermäusen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato−; (2) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato−. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Auflösung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber hauptsächlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Auflösung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Auflösung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Auflösung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollständig ersetzt. Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer veränderten Leberfibrose führt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. Während bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erhöhte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die NO-GC über die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose ausübt. / By means of the questions addressed in this work, new insights were gained on the role of NO-GC in the pathogenesis of lung and liver fibrosis. As a result of fibrosis in the lungs and liver, there is an excessive accumulation of EZM, which can lead to organ failure. So far, there are only a few treatment options available for the treatment of organ fibrosis. However, it has recently been shown that the use of NO-GC-stimulators/activators can improve/heal diverse organ fibrosis. Therefore, NO-GC is thought to play a modulatory role in the development of organ fibrosis, however, effector cells are still not known. In the first part of this work, the effector cells of the lung were examined in vitro. Since it is known that NO-GC in the lung is expressed in pericytes, a protocol was established that allowed to specifically isolate pericytes from the lung and bring them into culture. By using different markers, these isolated pericytes were further characterized. Furthermore, NO-GC-expression was detected in these isolated cells. In addition, pericytes can also be marked by a marker (SM/MHC), which is actually known as a VSMC-marker. These data were analogous to the in vivo data of Aue et al.. Although, it was investigated whether these NO-GC-expressing pericytes differentiated into myofibroblasts in culture. This was not been achieved by stimulation with TGF-β1. In the second part of this work, it was investigated in which cells in of the liver NO-GC is expressed. In vivo it could be shown that NO-GC is expressed in HSC of the liver. Since it is known that the NO-GC has an influence on organ fibrosis, NO-GC-expression in liver fibrosis was investigated. It was found that there is an increased NO-GC-expression in CCl4-induced liver fibrosis. Expression was mainly found in myofibroblasts - the cells likely responsible for production of EZM. To further investigate the influence of NO-GC on liver fibrosis, fibrosis between WT and GCKO animals was compared. It could be observed that there was a stronger fibrosis in GCKO-animals than in WT-animals, as seen by an increased accumulation of collagen and an increased expression of TGF-β1. This demonstrated that NO-GC plays a likely protective role in liver fibrosis. In the third part of this work, the role of HSC in liver fibrosis was examined in more detail. For the first time, it was found that HSC can be subdivided into subpopulations. Reporter mice expressing the tdTomato fluorophore under the SM/MHC- or PDGFRβ-promoter allowed the subdivision of the HSC into 3 subpopulations: (1) SM/MHC-Tomato − and PDGFRβ-Tomato −; (2) SM/MHC- Tomato − and PDGFRβ-Tomato+ and (3) SM/MHC-Tomato + and PDGFRβ-Tomato −. HSC lineage tracing-experiments showed that these subpopulations have different roles during liver fibrosis and the resolution. In the healthy liver subpopulation, 1 is mainly located in zones 2 and 3 of the liver acinus. In fibrosis, these cells migrate to the fibrotic regions and differentiate into myofibroblasts. In the dissolution phase of fibrosis, these cells disappear by apoptosis. Under physiological conditions, HSC-subpopulation 2 are located to zone 1 of the liver acinus. Even in and after the dissolution of liver fibrosis these cells persist. HSC-subpopulation 3 in the healthy liver is also only in zone 1 of the liver acinus. In fibrosis these cells migrate to zone 2 and 3 were they replace HSC-subpopulation 1 that has migrated into the fibrotic region. After dissolving of liver fibrosis, subgroup 3 has completely replaced population 1. After identifying the HSC-subpopulation, the question was whether a specific section of the NO-GC leads to altered liver fibrosis compared to WT. For this purpose, NO-GC was deleted under SM/MHC- and PDGFRβ-promoter and fibrosis was investigated in these knockouts. While there was no difference in the deletion of NO-GC under the PDGFRβ-promoter compared to WT, SM/MHC-GCKO showed different results. The excision of NO-GC in the cells of HSC- subpopulation 3 resulted in a decreased expression of PPARγ in the healthy liver. Since PPARγ acts as an antagonist of the TGF-β1-pathway, increased TGF-β1-expression in SM/MHC-GCKO was seen in the healthy and fibrotic liver compared to WT-liver. These results suggest that NO-GC has a protective effect on liver fibrosis by the control of PPARγ.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2003.

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Eine optimale Regulation der Koronardurchblutung ist für die Aufrechterhaltung der kardialen Pumpfunktion und damit der systemischen Perfusion von größter Bedeutung. Da Einschränkungen der Durchblutungszunahme des Herzmuskels Einschränkungen des maximalen myokardialen Sauerstoffverbrauchs und damit der Herzleistung zur Folge haben, ist es notwendig, die Koronardurchblutung kurzfristig an die jeweilige Stoffwechsellage des Herzens anzupassen (metabolische Koronarflussregulation). Die lokal-metabolischen Mechanismen gehören zu den wirksamsten Komponenten der Regulation der myokardialen Durchblutung und funktionieren auch am isolierten (denervierten) Herz. Dabei ist die hyperkapnie- und azidoseinduzierte Koronardilatation ein wesentlicher Bestandteil der metabolischen Koronarflussregulation. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese der Abhängikeit der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation von einer intakten NO-Produktion. Das Koronarsystem des isolierten WT-Mausherzens reagiert auf akute Hyperkapnie (91 % O2, 9 % CO2) mit einer deutlichen Koronarflusssteigerung von ca. 35 % über dem Basalfluss.Es konnte gezeigt werden das Stickstoffmonoxid (NO) und ATP-abhängige Kaliumkanäle (K+ATP-Kanäle) für die Koronarflussregulation der Maus eine ausschlagebende Rolle spielen und neben der Aufrechterhaltung des Basalflusses auch an der Vermittlung der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation maßgeblich beteiligt sind.Interessanterweise ist bei einem Fehlen der endothelialen NO-Synthase durch genetischen Knockout die hyperkapnieinduzierte Flussantwort in Kinetik und Ausmaß vollständig erhalten. Die Vermittlung kann dabei durch andere Mechanismen kompensiert werden, wie zum Beispiel einer verstärkten Aktivität der K+ATP-Kanäle. Prostaglandine und neuronale NO-Synthase scheinen sowohl beim Wildtypherzen als auch bei Herzen mit fehlender NO-Synthase für die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation von untergeordneter Bedeutung. Nach chronischer pharmakologischer Blockade der NO-Synthase durch zweiwöchige L-NAME Tränkung bleibt die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation erhalten durch NOS-unabhängige Mechanismen. Die hyperkapnieinduzierte Flussantwort ist bei Herzen von weiblichen eNOSKO Tieren vorhanden, erscheint jedoch gegenüber den männlichen Mäusen geringer ausgeprägt. Daher wird vermutet, dass die Mediatorsysteme der endothelabhängigen Koronarflussregulation geschlechtsspezifisch bzw. geschlechtsabhängig sind.

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Eine optimale Regulation der Koronardurchblutung ist für die Aufrechterhaltung der kardialen Pumpfunktion und damit der systemischen Perfusion von größter Bedeutung. Da Einschränkungen der Durchblutungszunahme des Herzmuskels Einschränkungen des maximalen myokardialen Sauerstoffverbrauchs und damit der Herzleistung zur Folge haben, ist es notwendig, die Koronardurchblutung kurzfristig an die jeweilige Stoffwechsellage des Herzens anzupassen (metabolische Koronarflussregulation). Die lokal-metabolischen Mechanismen gehören zu den wirksamsten Komponenten der Regulation der myokardialen Durchblutung und funktionieren auch am isolierten (denervierten) Herz. Dabei ist die hyperkapnie- und azidoseinduzierte Koronardilatation ein wesentlicher Bestandteil der metabolischen Koronarflussregulation. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese der Abhängikeit der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation von einer intakten NO-Produktion. Das Koronarsystem des isolierten WT-Mausherzens reagiert auf akute Hyperkapnie (91 % O2, 9 % CO2) mit einer deutlichen Koronarflusssteigerung von ca. 35 % über dem Basalfluss.Es konnte gezeigt werden das Stickstoffmonoxid (NO) und ATP-abhängige Kaliumkanäle (K+ATP-Kanäle) für die Koronarflussregulation der Maus eine ausschlagebende Rolle spielen und neben der Aufrechterhaltung des Basalflusses auch an der Vermittlung der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation maßgeblich beteiligt sind.Interessanterweise ist bei einem Fehlen der endothelialen NO-Synthase durch genetischen Knockout die hyperkapnieinduzierte Flussantwort in Kinetik und Ausmaß vollständig erhalten. Die Vermittlung kann dabei durch andere Mechanismen kompensiert werden, wie zum Beispiel einer verstärkten Aktivität der K+ATP-Kanäle. Prostaglandine und neuronale NO-Synthase scheinen sowohl beim Wildtypherzen als auch bei Herzen mit fehlender NO-Synthase für die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation von untergeordneter Bedeutung. Nach chronischer pharmakologischer Blockade der NO-Synthase durch zweiwöchige L-NAME Tränkung bleibt die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation erhalten durch NOS-unabhängige Mechanismen. Die hyperkapnieinduzierte Flussantwort ist bei Herzen von weiblichen eNOSKO Tieren vorhanden, erscheint jedoch gegenüber den männlichen Mäusen geringer ausgeprägt. Daher wird vermutet, dass die Mediatorsysteme der endothelabhängigen Koronarflussregulation geschlechtsspezifisch bzw. geschlechtsabhängig sind.

Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel). / abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).

Homocystein (tHcy) gilt als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor und korreliert eng mit einer endothelialen Dysfunktion, welche nichtinvasiv mittels der flussinduzierten Vasodilatation (FMD) messbar ist. Experimentelle Hyperhomocysteinämie ist mit einer reduzierten Bioverfügbarkeit von endothelialen Stickstoffmonoxid (NO) bei gleichzeitig erhöhten Spiegeln des kompetetiven Inhibitors der NO-Biosynthese asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) assoziiert. In-vivo senkt eine Östrogenbehandlung neben tHcy auch die ADMA-Spiegel und verbessert signifikant die Endothelfunktion. Hinsichtlich ihrer Wirkung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren wird angenommen, dass Phytoöstrogene, speziell Sojaisoflavone, ähnliche Effekte hervorrufen.<br><br> Innerhalb einer europäischen, multizentrischen, doppelblinden Interventionsstudie an 89 gesunden, postmenopausalen Frauen wurde der Einfluss von Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus, den Blutdruck und die in-vivo Endothelfunktion untersucht. Die cross-over Studie umfasste zwei achtwöchige Interventionsperioden, die von einer gleichlangen Wash-out-Phase unterbrochen waren. Die Zuteilung zum Isoflavon- (50 mg/d) oder Plazeboregime für die erste Interventionsphase erfolgte randomisiert. Endpunkterhebungen fanden jeweils in den Wochen 0 und 8 der Interventionsperioden statt.<br><br> Die renale Ausscheidung von Genistein, Daidzein und Equol war während der Isoflavonintervention signifikant erhöht (P>0,001). Die Phyoöstrogene hatten weder einen Effekt auf die tHcy-Konzentration (P=0,286), noch auf ADMA, Erythrozytenfolat und Vitamin B-12 (P>0,05) im Plasma. Während die Summe aus Nitrat und Nitrit (NOx), welche die NO-Bioverfügbarkeit reflektiert, im Verlaufe der Plazebobehandlung abfiel, wurde ein leichter Anstieg bei der Isoflavonsupplementation beobachtet (Delta Wo8-Wo0: -2,60 [-8,75; 2,25] vs. 1,00 [-6,65; 7,85] µmol/L P<0,001), was zu einem signifikanten Behandlungseffekt führte. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen ADMA und Vitamin B-12 gefunden (R=0,252; P=0,018). Die flussinduzierte Vasodilatation (P=0,716), ein Maß für die Endothelfunktion, blieb durch die Isoflavonbehandlung unbeeinflusst, obwohl sich diese über die Zeit insgesamt verbesserte (P>0,001). Bis auf einen marginalen Anstieg des systolischen Wertes (P=0,032) im Vergleich zur Plazebobehandlung blieb der Blutdruck während der Isoflavonintervention unverändert.<br><br> Im Gegensatz zu Östrogen übten Sojaisoflavone weder einen Einfluss auf die in-vivo Endothelfunktion noch auf die traditionellen und neuen kardiovaskulären Risikofaktoren den Blutdruck, tHcy und ADMA aus. Demzufolge ist der gesundheitliche Nutzen isolierter Isoflavone hinsichtlich einer Prävention hormonmangelbedingter Erkrankungen in gesunden postmenopausalen Frauen fraglich. / Homocysteine (tHcy) is a strong and independent risk factor for cardiovascular disease. Hyperhomocysteinemia contributes to endothelial dysfunction as assessed by flow-mediated vasodilation (FMD). The mechanisms by which homocysteine generates endothelial dysfunction remain incompletely understood although a growing body of data suggests that the bioavailability of nitric oxide (NO) is reduced. The principal competitive inhibitor of endothelial NO-synthase asymmetric dimethylarginine (ADMA) may play a central role in homocysteine related dysfunction as it is derived from homocysteine metabolism. Cardiovascular risk factor modification has suggested beneficial effects of estrogen on endothelial function by lowering homocysteine and ADMA levels. We hypothesize that phytoestrogens particular isoflavones act in a similar manner.<br><br> The effects of soy isoflavones on homocysteine metabolism and endothelial function were investigated within a multi-centre, double blind, cross-over intervention trial in 89 European postmenopausal women. Subjects consumed either fruit cereal bars with or without soy isoflavones (50 mg/d) for 8 weeks each with a 8 weeks washout period in between. Endpoint measurements were during both treatment phases at baseline and weeks 8, respectively. <br><br> Urinary phytoestrogens increased significantly after isoflavone intervention (P<0.001). Isoflavone supplementation did affect neither plasma total homocysteine (P=0.286) nor ADMA, vitamin B-12 or folate (P<0.05). Isoflavones had a favorable effect on NO-metabolism assessed by analysis of NO-metabolites (NOx) nitrite and nitrate. While NOx concentration significantly decreased during placebo there was a slight increase after isoflavone supplementation leading to a significant treatment difference (delta wk8-wk0: -2.60 [-8.75; 2.25] vs. 1.00 [-6.65; 7.85] µmol/L P<0.001). There was no association between total homocysteine and ADMA whereas a positive correlation was found for ADMA and vitamin B-12 (R=0.252; P=0.018). The endothelial function model did not demonstrate any difference between either treatment regime (P=0.716), although endothelial function assessed by flow-mediated vasodilation improved in general (P<0.001). A potential adverse effect was noted, with an elevation in systolic blood pressure (P=0.032) whereas diastolic blood pressure and mean arterial pressure remained unaffected.<br><br> Soy isoflavones did not have beneficial effects on endothelial function as well as on traditional and novel cardiovascular risk factors like plasma homocysteine, blood pressure and ADMA as observed for estrogen treatment. The health benefit of isolated isoflavones in healthy postmenopausal women is questionable.

<p> Meine Doktorarbeit ist ein Beitrag zum Gebiet der Reaktionsdynamik an Oberflächen. In diesem Forschungsbereich wird daran gearbeitet, ein detailliertes mikroskopisches Verständnis von chemischen Prozessen an Oberlächen zu erzielen. Fortschritt resultierte dabei häufig aus der Zusammenarbeit von experimentell und theoretisch arbeitenden Forschern und die vorliegende Arbeit führt diese Tradition weiter. Ausgangspunkt meiner Untersuchungen war eine bemerkenswerte theoretische Vorhersage, die ich experimentell überprüft habe. Dabei habe ich mehrere neue Beobachtungen gemacht, von denen ich hoffe, dass sie zu Weiterentwicklungen in der theoretischen Chemie beitragen. </p> <p> Ein aktuelles und wichtiges Thema auf das ich meine Forschung gerichtet habe, ist das Versagen der Born-Oppenheimer Näherung und die damit einhergehenden elektronisch nichtadiabatischen Energietransferprozesse an Oberflächen. Dafür habe ich das Streuverhalten von hoch schwingungsangeregtem Stickstoffmonoxid (NO) an der (111)-Oberfläche eines Goldkristalls untersucht. Dieses System war bereits vor dieser Arbeit ein bedeutendes Modellsystem für nichtadiabatische Prozesse an Oberflächen. Beim Stoß mit der Oberfläche geben die hochschwingungsangeregten NO Moleküle Schwingungsenergie an elektronische Freiheitsgrade im Metall ab. Dieser sehr effiziente Energietransfer kann nur im Rahmen eines nichtadiabatischen Effektes (Versagen der Born-Oppenheimer Näherung) erklärt werden und der aktuelle Stand der Forschung ist, dass dieser Prozess durch einen transienten Elektronentransfer (ET) von der Oberfläche zum Molekül verursacht wird. </p> <p> Gemessen habe ich Schwingungs- und Rotationsverteilungen von in verschiedenen angeregten Schwingungszuständen (<i>v</i>_i = 3, 11, und 16) präparierten NO Molekülen nach dem Stoß mit der Au(111) Oberfläche. Dabei wurden die einfallende Translationsenergie (<i>E</i>_i^trans=0.05 - 1 eV) und die Orientierung der Moleküle systematisch variiert. Dies sollte den Einfluss dieser Parameter auf den durch ET getriebenen Energietransfer aufzeigen, sowie generell zu einem besseren Verständnis der Gesetzmäßigkeiten beitragen, nach denen Prozesse an Oberflächen ablaufen. Um die angestrebten Experimente durchführen zu können, habe ich an der Entwicklung von zwei neuen experimentellen Methoden mitgewirkt: 1) einer Methode um polare Moleküle in einem elektrischen Feld auszurichten ( "Optische Zustandsselektion mit adiabatischer Orientierung") und 2) einer Methode für die Unterdrückung von spontaner Emission beim optischen Pumpen ("Pump-Dump-Sweep"). </p> <p> Der Einfluss der Orientierung ist sowohl drastisch als auch komplex. Für NO in <i>v</i>_i = 3 und 11 wird die Schwingungsrelaxation stark durch eine Ausrichtung der Moleküle mit dem N-Atom in Richtung der Oberläche gegenüber einer Ausrichtung mit dem O-Atom in Richtung der Oberfläche verstärkt. Für diese Zustände nimmt die Relaxation außerdem mit steigender einfallender Translationsenergie zu. Interessanterweise verschwinden sowohl der Einfluss der Translationsenergie, als auch der Orientierung für NO in <i>v</i>_i = 16 und alle Moleküle relaxieren zu niedrigeren Schwingungszuständen. Die Rotationsverteilungen der gestreuten Moleküle hängen ebenfalls stark von der einfallenden Translationsenergie, Orientierung sowie dem Schwingungszustand ab und zeichnen sich durch ausgeprägte nicht-thermische Maxima ("Rotationsregenbögen") aus. Dies ist die erste Beobachtung von Rotationsregenbögen in Molekülen, die zuvor Schwingungsenergie durch einen Stoß mit einer Oberfläche verloren haben. </p> <p> Die Messergebnisse weisen eine komplizierte Abhängigkeit von Orientierung, Einfallsenergie und Schwingungszustand auf. Trotzdem können die beobachteten Trends in der Schwingungsrelaxationswahrscheinlichkeit mit einem einfachen Modell verstanden werden, welches auf einer energetischen Barriere der zugrundeliegenden Elektronentransferreaktion basiert. Die Höhe dieser Barriere nimmt mit zunehmender einfallender Schwingungsenergie ab. Dies erklärt den Trend hin zu stärkerer Schwingungsrelaxation, wenn <i>v</i>_i erhöht wird. Die Änderung der Barriere erklärt auch, warum die Schwingungsrelaxation für <i>v</i>_i = 3 und 11 stark von der Translationsenergie beeinflusst, für <i>v</i>_i = 16 hingegen kaum benötigt wird. Die Barrierenhöhe wird außerdem durch eine Ausrichtung der Moleküle mit dem N-Atom in Richtung der Oberfläche verringert und führt zu einem starken Anstieg der Relaxation für diese Orientierung. </p> <p> Die experimentellen Daten aus dieser Arbeit ermöglichen einen sehr detaillierten Test für Methoden der theoretischen Chemie. Aktuelle Berechnungen zu dem untersuchten System basierend auf den Methoden der Elektronischen Reibung ("electronic friction") oder IESH ("independent electron surface hopping") scheitern bei der Vorhersage der erzeugten Schwingungsverteilungen und deren Abhängigkeiten von den Bedingungen des Streuexperiments. Ich hoffe, dass die neuen Daten als Grundlage für weitere theoretische Arbeiten dienen, um so noch tiefere Einblicke in dieses bedeutende Beispiel eines nichtadiabatischen Prozesses in der Oberflächendynamik zu erhalten. </p> <p> Ein unabhängiges Thema, welches in der vorliegenden Arbeit zusätzlich behandelt wird, ist die Erzeugung eines Molekularstrahls hoch schwingungsangeregter CO Moleküle. Dafür habe ich eine Methode entwickelt, die "Pump-pump-perturb and dump" genannt wird und auf dem optischen Pumpen in erster Näherung dipolverbotener elektronischer Übergänge beruht. Ich demonstriere die erfolgreiche Implementierung der Methode in dem bestehenden Versuchsufbau.