Le cancer ovarien est la 1ère cause de décès par cancer gynécologique. A ce jour, le traitement le plus efficace consiste en une exérèse la plus complète possible de la tumeur associée à une chimiothérapie à base de sel de platine et de taxanes. Cependant, la survie globale des patientes à 5 ans reste faible (environ 40%), due à un fort taux de récidive et au développement d'une résistance aux traitements. Les interactions entre les cellules tumorales ovariennes (CTO) et le microenvironnement semblent être impliquées dans la progression de la maladie et l'acquisition de cette chimiorésistance. Parmi les cellules du microenvironnement tumoral, nous avons pu isoler des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) à partir de biopsies de carcinome ovarien. Ces MSC associées au cancer (CA-MSC) ont la capacité d'induire une résistance des CTO au traitement par carboplatine. Afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant des MSC à sécréter des facteurs pro-tumoraux, dans un contexte de cancer ovarien, nous avons mis en place un modèle à partir de MSC issues de donneurs ne présentant pas de cancer. Nous avons observé que la présence d'un environnement tumoral ovarien modifie le phénotype de MSC de moelle osseuse (BM-MSC) physiologiques, en entrainant notamment la sécrétion par ces CA-MSC " induites " de facteurs chimioprotecteurs pour les CTO. Parmi les facteurs sécrétés, nous avons identifié des chimiokines telles que CXCL1, CXCL2 et IL-8 comme des cibles thérapeutiques intéressantes pour lutter contre la résistance à la chimiothérapie. En effet, les CA-MSC et les CA-MSC " induites " sécrètent plus de CXCL1, CXCL2 et d'IL-8 que les BM-MSC. En outre, l'inhibition des récepteurs de ces chimiokines (CXCR1 et CXCR2) sensibilise les CTO au carboplatine, même en présence des sécrétions des CA-MSC et des CA-MSC " induites ". Ces expériences in vitro ont été confirmées in vivo dans un modèle expérimental murin. En effet, la co-injection à des souris immunodéprimées de MSC avec des CTO humaines entraine une protection des CTO vis-à-vis du carboplatine comparée à l'injection de CTO seules. Le co-traitement avec un inhibiteur de CXCR1 et de CXCR2 a permis de sensibiliser les CTO au carboplatine et d'empêcher la chimiorésistance induite par les MSC. En effectuant une étude rétrospective évaluant la concentration de ces chimiokines au moment du diagnostic, nous avons confirmé que les patientes qui seront a posteriori " résistantes " au carboplatine ont une concentration sérique de ces chimiokines qui est plus élevées que les patientes du groupe " sensibles " au carboplatine. Outre leur rôle direct dans l'acquisition de la chimiorésistance, les chimiokines comme CXCL1, CXCL2 et IL-8 peuvent être impliquées dans la régulation du système immunitaire. Nous avons montré que les CA-MSC étaient capables de modifier le phénotype des macrophages vers un phénotype M2 décrit comme pro-tumoral. En effet, ces macrophages ainsi polarisés ont un pouvoir cytotoxique dirigé contre les CTO inférieur aux macrophages non stimulés. L'ajout d'un inhibiteur de CXCR1 et de CXCR2 restaure le pouvoir cytotoxique initial des macrophages, même en présence des sécrétions des CA-MSC. Ainsi nos travaux suggèrent que les CA-MSC pourraient provenir de MSC physiologiques qui, au contact d'un environnement tumoral ovarien, vont acquérir un phénotype capable d'induire la sécrétion de facteurs chimioprotecteurs pour les CTO et de polariser les macrophages vers un phénotype moins cytotoxique pour les CTO. Ces deux phénomènes pro-tumoraux peuvent être inhibés par l'utilisation d'un inhibiteur des récepteurs de CXCR1 et de CXCR2. Ainsi ces récepteurs des chimiokines, semblent être des cibles thérapeutiques intéressantes afin de sensibiliser les CTO au carboplatine et traiter plus efficacement la tumeur. Ceci pourrait permettre d'éviter les récidives des cancers ovariens qui sont, à l'heure actuelle, observées chez plus de 70% des patientes. / Ovarian cancer is the leading cause of gynecological cancer death. To date, the most effective treatment consists of the complete excision of the tumor associated with chemotherapy based on platinum salts and taxanes. However, the 5-year overall survival remains low (close to 40%) due to a high rate of recurrence and development of resistance to treatments. Disease progression and the acquisition of this chemoresistance seem to be due to interactions between ovarian tumor cells (OTC) and the microenvironment. Amidst the cells of the tumor microenvironment, we were able to isolate mesenchymal stromal cells (MSC) from tumor biopsies of patients with ovarian adenocarcinoma. These cancer-associated MSC (CA-MSC) have the ability to induce resistance to carboplatin in OTC. In order to understand the mechanisms leading to the secretion of pro-tumoral factors by the CA-MSC in the context of ovarian cancer, we have developed a model based on the in vitro MSC culture of from healthy donors in tumor conditioning media. We have observed that an ovarian tumor environment modifies the physiological phenotype of bone marrow MSC (BM-MSC), leading in particular to the secretion by these "induced" CA-MSC of chemoprotective factors for OTC. Among these secreted factors, we have identified chemokines such as CXCL1, CXCL2 and IL-8 as therapeutic targets in order to control drug resistance. In fact, CA-MSC and "induced" CA-MSC secrete more CXCL1, CXCL2 and IL-8 than BM-MSC and the use of an inhibitor of their receptors (CXCR1 and CXCR2) sensitized OTC to carboplatin even in the presence of CA-MSC and " induced " CA-MSC secretions. These in vitro experiments have been confirmed in an experimental mouse model in vivo. Indeed, the co-injection of MSC with OTC yielded a greater protection of OTC to carboplatin compared with the OTC injection alone. Co-treatment with a CXCR1 and CXCR2 inhibitor resulted in sensitization of OTC to carboplatin and prevention of MSC-induced chemoresistance. We conducted a retrospective study evaluating the concentration of these chemokines at the time of diagnosis. We thus showed that patients who are a posteriori "resistant" to carboplatin have a higher concentration of chemokines than patients belong to the "sensitive" group to carboplatin. In addition to their direct role concerning the acquisition of chemoresistance, chemokines such as CXCL1, CXCL2 and IL-8 may be involved in the immune system regulation. In this context, we showed that CA-MSC were able to modify the phenotype of macrophages into a M2 phenotype described in literature to have a pro-tumoral activity. Indeed, these polarized macrophages present a lower cytotoxic capacity against OTC than unstimulated macrophages. CXCR1 and CXCR2 inhibitor restores the initial cytotoxic activity of macrophages even in the presence of CA-MSC secretions. Thus, our work suggests that CA-MSC could originate from physiological MSC which, in contact with an ovarian tumor environment, acquire a phenotype capable of inducing the secretion of chemoprotective factors for CTO and of polarizing macrophages into a less cytotoxic phenotype for OTC. These two pro-tumoral mechanisms can be inhibited by the use of CXCR1 and CXCR2 receptor inhibitors emphasizing the role of these chemokines in the development of a chemoresistance and showing how important is to go further is this study. Finally, these chemokines receptors seem to be therapeutic targets in order to sensitize OTC to carboplatin and to potentialize actual treatments. This could prevent the recurrence of ovarian cancers that are presently observed in more than 70% of patients.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5178.pdf: 2466586 bytes, checksum: be50519a129b12383d84e69ae25b54db (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for clinical therapy has been limited by the low amount of cells that can be obtained directly from tissue, making it necessary to develop techniques for in vitro cell number expansion. The current methods of expansion are laborintensive, exhibit unfavorable environments for cell growth, show still modest levels of expansion and low yield in the recovery of these cells. In the search for better alternatives, several types of bioreactors have been assessed, however, with results still discreet. A littlestudied system, which has showed itself very effective in the use with other types of animal cells, is the hollow fiber bioreactor. This bioreactor has relatively homogeneous culture environment, low level of hydrodynamic stress on cells and the process control is made through manipulation external to the culture. Thus, it is proposed in this work the study of the in vitro expansion of MSCs in 15 mL hollow fiber prototype bioreactor designed and built with a configuration specifically conceived for expansion of MSCs for use in therapeutic applications. The inoculum was prepared with MSCs precultured adhered to microcarrier Cultispher-S at concentration of 4 g/L in spinner flask containing 50 mL of α-MEM culture medium with 15% v/v fetal bovine serum. The preculture was performed in CO2 incubator at pH close to 7.3 and temperature of 37°C. For bioreactor expansion cultures, it was used the same culture medium, with addition of 12 g/L of alginate and 4.25-4.50 mM of CaCl2 as gelling agents to immobilize and keep in suspension the microcarriers, in the conditions of pH and temperature used in the preculture. The oxygenation of the culture medium continuously recirculated through the intracapilar space was carried out by air bubbling in an external flask. The oxygenation levels were of 70 to 90% of saturation with air. The experimental results obtained show that the used configuration of hollow fiber bioreactor promoted good conditions for expansion of MSCs without cell aggregation, reaching 15.3-fold expansion and cell recovery levels of 82%. These results also demonstrate the possibility of improving the efficiency of MSCs expansion through the renewal of medium to maintain suitable levels of arginine, nutrient present in limiting amounts, and ammonium, growth inhibitor metabolite. / A utilização de células estromais mesenquimais (MSCs em inglês) para a terapia clínica tem sido limitada pela baixa quantidade de células que podem ser obtidas diretamente do tecido, tornando necessário o desenvolvimento de técnicas de expansão do número de células in vitro. Os métodos atuais de expansão apresentam necessidade de intensa mão de obra, ambientes desfavoráveis para o crescimento celular, níveis de expansão ainda modestos e baixo rendimento na recuperação destas células. Na procura de melhores alternativas, diversos tipos de biorreatores vêm sendo avaliados, porém, com resultados ainda discretos. Um sistema pouco estudado que tem se mostrado muito eficiente no uso com outros tipos de células animais é o biorreator de fibra oca. Este biorreator apresenta ambiente de cultura relativamente homogêneo, baixo nível de forças hidrodinâmicas sobre as células e o controle do processo é feito através de manipulação externa à cultura. Assim, é proposto neste trabalho o estudo da expansão in vitro de MSCs num protótipo de biorreator de fibra oca de 15 mL projetado e construído com uma configuração especialmente concebida para expansão de MSCs a serem utilizadas em aplicações terapêuticas. O inóculo foi preparado com MSCs précultivadas aderidas ao microcarregador Cultispher-S na concentração de 4 g/L em frasco spinner contendo 50 mL de meio de cultura α-MEM com 15% v/v de soro fetal bovino. O précultivo foi realizado em incubadora de CO2 a pH próximo a 7,3 e temperatura de 37°C. Para os cultivos de expansão no biorreator foi utilizado o mesmo meio de cultura, com adição de 12 g/L de alginato e 4,25-4,50 mM de CaCl2 como agentes geleificantes para imobilizar e manter suspensos os microcarregadores, nas condições de pH e temperatura utilizadas no précultivo. A oxigenação do meio de cultura continuamente recirculado pelo espaço intracapilar foi realizada mediante borbulhamento de ar em um frasco externo. Os níveis de oxigenação foram de 70 a 90% da saturação com ar. Os resultados experimentais obtidos mostram que a configuração utilizada propiciou boas condições para a expansão sem agregação celular das MSCs, chegando-se a fatores de expansão estimados de 15,3 vezes e níveis de recuperação de células de 82%. Esses resultados também evidenciam a possibilidade de melhora da eficiência da expansão das MSCs através da renovação do meio de cultivo para a manutenção de níveis adequados de arginina, nutriente presente em quantidades limitantes, e amônia, metabólito inibidor de crescimento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6615.pdf: 4694610 bytes, checksum: 288df2441cd04d5e5e4c36da49c66cb9 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Mesenchymal stromal cells (MSCs) are required by the scientific community in the development and enhancement of therapeutic techniques in different fields of medicine. The MSCs are present in small concentrations in tissues, which makes necessary the expansion in vitro for enable studies and therapeutic applicability. These are cells with high sensitivity to environmental conditions of cultivation. So, for increase productivity in vitro is used the technology of bioreactors in the development of processes in order to produce high cell densities in less time, with reduce use of resources and maintaining a safe operation. The new concepts of "disposable bioreactors", as the wave-induced motion bioreactor or Wave bioreactor, with possibility operating in a closed system, controlled and automated, reduced investment cost and operation, less risk of contamination, higher level biosecurity, added to the fact of being a underexplored technology and already approved by the FDA (Food and Drugs Administration) becomes a highly attractive alternative bioprocessing for cultivation of animal cells in large scale. In this context, the present work aims to develop a protocol for cultivation of MSCs in the Wave Bioreactor System 2/10. Experiments were performed to characterize the CEMs's culture behavior in the Wave bioreactor to obtain high cell productivity while maintaining the therapeutic potential of the CEMs. The experiments were carried out with 2 L Cellbag and Cultispher-S microcarrier with 300 ml of α-MEM medium culture supplemented with glucose, glutamine, and arginine and 15% v/v fetal bovine serum at 37 ° C and pH between 6,9-7,4. In the preliminary experiments it was verified that most of the inoculated cells did not adhere to the microcarriers. It was shown that such behavior is due to low relation between adhesion area (AMC = total projected area of the microcarriers) and wet surface area of Cellbag (ASMCellbag), which in the normal condition of operation results an adhesion between 25,7 and 61,7% of the inoculated cells. To solve the problem were performed experiments reducing ACellbag which enabled improvements in cell adhesion by up to 100%. It was also found low performance of the cell expansion phase, presumably linked to operational problems like: microcarriers segregation in certain regions of the bioreactor causing depletion of nutrients, formation of aggregates of MCs colonized with cells and adhesion of MCs to Cellbag. In addition, it was observed that reducing CEM/MC ratio at the start of the culture, the cell expansion factor could be increased to values equal to or greater than 10. These results show that the Wave bioreactor has good potential for expansion of MSCs and that the same can be improved. / As células estromais mesenquimais (CEMs) estão sendo visadas pela comunidade científica no desenvolvimento e aprimoramento de técnicas terapêuticas em diferentes ramos da medicina. As CEMs estão presentes em pequenas concentrações nos tecidos, o que torna necessário a sua expansão in vitro para viabilizar pesquisas e a aplicabilidade terapêutica. Tratam-se de células com elevada sensibilidade em relação às condições do ambiente de cult ivo. Assim, para o aumento da produtividade in vitro utiliza-se a tecnologia de biorreatores no desenvolvimento de processos com objetivo de produzir altas densidades celulares em curto tempo, de forma econômica e respeitando as normas impostas pelos órgãos reguladores. O novo conceito de biorreator descartável, como o do biorreator com movimento induzido em forma de ondas, ou biorreator Wave, apresenta possibilidade de operação em sistema fechado segundo as boas práticas de fabricação (BPF), controlado e automatizado. O custo de investimento e operação reduzido, com menor risco de contaminação, maior nível de biossegurança, somado ao fato de utilizar uma tecnologia pouco explorada e já aprovada pelo FDA (Food and Drugs Administration) se transforma numa alternativa de bioprocessamento altamente atrativa para cultivo de células animais em larga escala. Nesse contexto, o presente trabalho tem por meta avaliar o desempenho do biorreator Wave 2/10 na expansão das CEMs. Para tal, foram realizados experimentos visando caracterizar o comportamento do cultivo nesse biorreator a fim de obter alta produtividade celular mantendo a potencialidade terapêutica das CEMs. Os experimentos foram realizados com saco plástico (doravante Cellbag) de 2 L e microcarregador (MC) Cultispher-S com 300 mL me io de cultivo α-MEM suplementado com glicose, glutamina e arginina e 15% v/v de soro fetal bovino a 37°C e pH entre 6,9-7,4. Nos experimentos preliminares constatou-se que grande parte das células inoculadas não aderiam aos microcarregadores. Comprovou-se que tal comportamento se devia à baixa relação entre área de adesão (AMC = área total projetada dos microcarregadores) e área de superfície molhada da Cellbag (ASMCellbag) que na condição normal de operação resultava numa adesão entre 25,7 e 61,7% das células inoculadas. Para melhorar a adesão foram realizados experimentos reduzindo a ASMCellbag, o que possibilitou melhoria na adesão celular em até 100%. Na etapa de expansão celular verificou-se baixo desempenho, presumivelmente vinculado a problemas de operação como: segregação de microcarregadores em determinadas regiões do biorreator provocando o esgotamento de nutrientes, formação de agregados de MCs colonizados com células e adesão dos MCs à Cellbag. Em adição, notou-se que diminuindo a relação CEM/MC no início do cultivo a expansão celular podia ser aumentada para valores iguais ou maiores que 10. Ao todo, os resultados mostraram que o biorreator Wave possui bom potencial para a expansão de CEMs e que o mesmo ainda pode ser melhorado.

L'accident vasculaire cérébral (AVC) représente la première cause de handicap acquis de l'adulte. A l'heure actuelle, moins de 10% des patients peuvent bénéficier de la thrombolyse, et aucun traitement, en dehors de la rééducation, ne permet de réduire efficacement le handicap. Il existe donc un réel besoin de disposer de nouvelles thérapeutiques permettant d'améliorer la récupération et pouvant être administrées dans un délai élargi par rapport à celui de la thrombolyse. Nos travaux expérimentaux chez le rat, associant imagerie IRM de la microvascularisation, analyse de l'expression des gènes de l'angiogenèse et étude comportementale, ont permis de définir une phase de transition (J3-J7) suivie d'une phase subaigüe (J7-J25) post-AVC. Ces deux phases sont apparues comme des fenêtres thérapeutiques potentielles pour l'administration de traitement pro-angiogéniques. Depuis près de 20 ans, de nombreuses équipes se sont tournées vers la thérapie cellulaire, notamment par cellules souches/stromales mésenchymateuses humaines (CSMh), comme thérapie réparatrice dans les AVC avec un triplement du nombre d'essais cliniques au cours des 10 dernières années. Cependant, les données de la littérature ne permettent pas de bien comprendre le mécanisme d'action des CSMh, particulièrement après une administration à la phase subaigüe. Nos travaux ont permis de progresser dans la compréhension de l'effet microvasculaire des CSMh, administrées dans les conditions d'un essai clinique de phase II qui se déroule actuellement à Grenoble (ISIS : Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke). Nous avons montré que la récupération sensori-motrice et cognitive post-ischémique observée après administration intraveineuse de CSMh était liée à une augmentation de l'angiogenèse. Les facteurs angiogéniques Ang2, Ang1, SDF-1 et TGFβ1, dont la sécrétion endogène est augmentée par les CSMh, semblent participer à une meilleure stabilisation vasculaire et pourrait expliquer l'effet bénéfique de ces cellules. Dans le cadre du développement des CSMh en tant que médicament de thérapie innovante, nous avons montré l'absence de potentiel tumorigène des CSMh par une étude toxicologique de tumorigénicité in vivo. Par analyse rétrospective des CSMh produites dans le cadre de l'essai clinique de phase II, nous avons montré la faisabilité de la production de CSMh conformes aux spécifications et en quantité suffisante par l'Unité de Thérapie Cellulaire. Par ailleurs, ces CSMh cultivées ex vivo peuvent présenter des anomalies caryotypiques erratiques, non clônales. Ces anomalies semblent être liées au maintien en culture, plus qu'au procédé lui-même. Une composante "donneur" semble également contribuer à l'apparition de ces anomalies. / Stroke is the leading cause of disability in adult. Less than 10% of patients can be treated with thrombolysis. Except rehabilitation, no effective treatment exists to improve functional recovery after the acute phase. Therefore, there is a wide need to develop an effective therapy applicable after several days or weeks following stroke. Using a multiparametric approach (microvascular MRI, analysis of angiogenic genes expression and behavioral study) in rat ischemic stroke model, we defined a transition stage (D3-D7) followed by a subacute phase (D7-D25) during post-stroke remodeling. These two phases represent an interesting target time-window for administration of pro-angiogenic therapies. Since 20 years, cell therapy, notably by human mesenchymal stem/stromal cells (hMSC), emerged as a “regenerative treatment” with threefold increase in clinical trial during the last 10 years. However, still limited data are available regarding the mechanisms by which hMSC benefit, especially at the subacute phase. We progressed in understanding the microvascular plasticity that occurs after an intravenous injection of hMSC in a rat model of transient focal cerebral ischemia. Our preclinical studies were carried out simultaneously with a phase II clinical trial that currently goes on in Grenoble (ISIS: Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke). We reported a sustained functional and cognitive long-term benefit of hMSC IV injected at the subacute stage correlated to an increase of angiogenesis. Ang2, Ang1, SDF-1 and TGFβ1, whose endogenous level tends to be overexpressed by hMSC, would enhance stabilization and survival of newborn vessels, accounting for benefit of these cells. As part of the hMSC development as an advanced therapy medicinal product, we realized an in vivo tumorigenicity assay and showed the absence of tumor development after hMSC injection. We also retrospectively analyzed hMSC produced for the phase II clinical trial. We confirmed the feasibility to produce hMSC, conformed to specifications and in adequate quantity, in the Cell Therapy Unit. In addition, we showed that ex vivo expanded hMSC can present, non clonal, erratic chromosomal abnormalities. Such chromosomal abnormalities appeared to be more related to the maintenance in culture than to the manufacturing process. A “donor” component may also contribute to emergence of such abnormalities.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

Human mesenchymal stromal cells (hMSC) are adult stem or progenitor cells, which physiological role is reparation of damaged tissues. This is achieved mostly by secretion of trophic, angiopoietic and immunomodulatory factors. Beside this, hMSC have potential to differentiate in vitro into specialized cells, especially of the mesodermal lineages. Human MSC also significantly support hematopoiesis in hematopoietic niche. This knowledge raised high hopes for therapeutic use of hMSC, especially in regenerative medicine and treatment of autoimmune diseases, including graft versus host disease (GvHD). As a proof of concept served initially crude preparations of bone marrow mononuclear cells (BMMC), which contain small numbers of hMSC. In our hospital, two pilot clinical studies with BMMC were performed: study of treatment of acute myocardial infarction (negative, prematurely terminated) and study of treatment of peripheral leg arthery disease (promising results). Further research was aimed on optimalisation of hMSC cultivation method for clinical use to obtain highest possible yield and get free from animal proteins. Human MSC were traditionally cultivated in research-grade media with fetal calf serum (FCS), which can lead to immunization of patients after repeated application of hMSC. We achieved...

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição seletiva de células pancreáticas produtoras de insulina. O tratamento convencional é feito com insulina e existe atualmente a necessidade de desenvolver alternativas terapêuticas para o DM-1, como por exemplo o tratamento com células-tronco. As células estromais mesenquimais multipotentes (multipotent mesenchymal stromal cells-MSCs) representam uma fonte de células ideal para terapias celulares em virtude de seu fácil isolamento, expansão e capacidades imunomoduladora e regenerativa. Ainda não está esclarecido se MSCs isoladas de indivíduos com doenças autoimunes possuem alterações funcionais que poderiam limitar seu uso no contexto do transplante autólogo. Já foi descrito que MSCs de pacientes com esclerose múltipla, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico possuem alterações fenotípicas e/ou funcionais. No entanto, pouco se sabe acerca das características das MSCs de pacientes com DM-1. Desse modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a eficácia da infusão de MSCs derivadas de pacientes com DM-1 no tratamento do diabetes experimental e comparar os resultados obtidos com o tratamento feito com MSCs isoladas de indivíduos saudáveis. Além disso, investigamos os efeitos da hiperglicemia in vitro sobre as MSCs, estabelecemos a melhor via de administração das MSCs em camundongos diabéticos e caracterizamos fenotipicamente e funcionalmente as MSCs de pacientes com DM-1. O diabetes experimental foi induzido em camundongos C57BL/6 por meio da administração de estreptozotocina. MSCs isoladas de tecido adiposo murino (ADMSCs) foram administradas em camundongos diabéticos pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intrapancreática ou intraesplênica. MSCs foram isoladas da medula óssea de pacientes com DM-1 recém-diagnosticado (DM1-MSCs) e de indivíduos saudáveis (C-MSCs). A morfologia, tamanho celular, perfil imunofenotípico, diferenciação em adipócitos, migração e capacidade imunossupressora foram avaliados. 1x106 DM1-MSCs ou C-MSCs foram injetadas pela via intraesplênica em camundongos diabéticos 20 dias após indução do diabetes. A glicemia foi monitorada periodicamente. Após sacrifício dos camundongos, avaliamos a histologia do tecido pancreático, níveis de insulina circulante, a população de células T reguladoras no baço e linfonodos pancreáticos, o perfil de citocinas no soro e homogeneizado pancreático. A migração das ADMSCs Luc+ injetadas foi avaliada por meio de processamento de imagem baseado em bioluminescênia. Sete dias após cultivo com diferentes concentrações de glicose, as MSCs não apresentaram alterações nos parâmetros avaliados. A injeção de MSCs em camundongos diabéticos por meio da via intraesplênica foi a mais eficiente, promovendo reversão da hiperglicemia em cerca de 70-100% dos camundongos tratados. As DM1-MSCs apresentaram morfologia, tamanho celular, perfil imunofenotípico, diferenciação in vitro em adipócitos e capacidade imunossupressora in vitro semelhante às MSCs de indivíduos saudáveis. No entanto, as DM1-MSCs apresentaram maior migração in vitro em relação às C-MSCs. Não houve diferenças significantes do tratamento de camundongos diabéticos feito com DM1-MSCs ou C-MSCs, uma vez que ambas MSCs foram capazes de reverter a hiperglicemia, promover aumento da massa de células pancreáticas, bem como diminuir os níveis de IL-2 e IFN- no pâncreas dos camundongos tratados. Considerando-se que as MSCs de pacientes com DM-1 recém-diagnosticados não apresentaram alterações fenotípicas ou funcionais, elas poderiam ser transplantadas de forma autóloga nesses pacientes, representando uma nova alternativa terapêutica para o DM-1. / Type 1 diabetes mellitus (DM-1) is an autoimmune disease characterized by a selective destruction of insulin-producing pancreatic cells. The conventional treatment for DM-1 patients is the administration of insulin and new therapeutic approaches are needed, such as stem cell therapies. Mesenchymal stromal cells (MSCs) represent an important stem cell source for cell therapies because they are easy to isolate, present good capacity of expansion and they exhibit immunomodulatory and regenerative properties. However, it is not fully understood if MSCs from autoimmune patients are functionally defective or not, limiting their use in the autologous transplantation setting. There are some reports in the literature showing that MSCs from patients with multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus exhibit phenotypical and/or functional alterations. However, little is known about MSCs isolated from DM-1 patients (DM1-MSCs). Taking this into account, the aim of this work was to evaluate the efficacy of DM1-MSCs transplantation in diabetic mice and to compare this treatment with the treatment using MSCs isolated from healthy individuals. We also evaluated the influence of in vitro hyperglycemia on MSCs and we established the best route of MSCs administration in diabetic mice. The phenotypical and functional characteristics of DM1-MSCs were analyzed. The experimental diabetes model was induced in C57BL/6 male mice by the administration of streptozotocin. MSCs were isolated from mouse adipose tissue (ADMSCs) and injected in diabetic mice by intravenous, intraperitoneal, intrapancreatic or intrasplenic routes. DM1-MSCs were isolated from bone marrow aspirates of newly-diagnosed type 1 diabetes patients and C-MSCs were obtained from healthy individuals. The morphology, immunophenotypic profile, cell size, adipocyte differentiation (in vitro), migration (in vitro) and immunosuppressive capacity (in vitro) were evaluated. 1x106 DM1-MSCs or C-MSCs were injected by intrasplenic route in diabetic mice 20 days after diabetes induction. Glycemia was frequently monitored. The pancreatic tissue (histology and immunohistochemistry), serum insulin levels, the regulatory T cells population in spleen and pancreatic lymph nodes, the serum and pancreatic homogenate cytokine profiles were evaluated after MSCs administration. The homing of ADMSCs Luc+ was analyzed by bioluminescence based image processing. MSCs cultured for seven days with different glucose concentrations did not exhibit alterations in all evaluated parameters. The intravenous, intraperitoneal, intrapancreatic or intrasplenic routes of MSCs administration were tested. The intrasplenic route was the most efficient and promoted diabetes reversion in about 70-100% of MSCs-treated mice. No differences in morphology, cell size, immunophenotypic profile, adipocyte differentiation and immunosuppressive capacity were found for DM1-MSCs when compared with C-MSCs. However, the migration capacity of DM1-MSCs was higher than C-MSCs. The intrasplenic administration of DM1-MSCs or C-MSCs in diabetic mice similarly promoted a decrease in blood glucose levels, improved insulin-producing cell mass and modulated the production of IL-2 e IFN- in pancreatic tissue. Taking into account that MSCs from newly-diagnosed DM-1 patients did not show phenotypical and functional alterations, these cells could be isolated from diabetic patients representing a new therapeutic approach for DM-1 patients (autologous transplantation).

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.