Eukaryotic DNA-binding proteins mediate many important steps in embryonic development and gene regulation. Consequently, a better understanding of these proteins would hopefully allow a more complete picture of gene regulation to be determined. In this study, a structure-based subfamily classification of the homeodomain family of DNA-binding proteins was undertaken in order to determine whether sub-groupings of a protein family could be identified that corresponded to differences in specific function, and identification of subfamily-determining residues was performed in order to gain some insight on functional differences via analysis of the residue properties. Subfamilies appear to have different specific DNA binding properties, according to DNA profiles obtained from TRANSFAC [1] and other sources in the literature. Subfamily-specific residues appear to be frequently associated with the protein-DNA interface and may influence DNA binding via interactions with the DNA phosphate backbone; these residues form a conserved profile uniquely identifying each subfamily.

Eukaryotic DNA-binding proteins mediate many important steps in embryonic development and gene regulation. Consequently, a better understanding of these proteins would hopefully allow a more complete picture of gene regulation to be determined. In this study, a structure-based subfamily classification of the homeodomain family of DNA-binding proteins was undertaken in order to determine whether sub-groupings of a protein family could be identified that corresponded to differences in specific function, and identification of subfamily-determining residues was performed in order to gain some insight on functional differences via analysis of the residue properties. Subfamilies appear to have different specific DNA binding properties, according to DNA profiles obtained from TRANSFAC [1] and other sources in the literature. Subfamily-specific residues appear to be frequently associated with the protein-DNA interface and may influence DNA binding via interactions with the DNA phosphate backbone; these residues form a conserved profile uniquely identifying each subfamily.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24508号 / 医博第4950号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 平井 豊博, 教授 武藤 学, 教授 中島 貴子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1

Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1

Les canaux potassiques à deux domaines pore sont impliqués dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques. Lors de ma thèse je me suis intéressé à la sous famille TREK dont les membres, TREK-1, TREK-2 et TRAAK jouent un rôle dans la nociception, la dépression et la neuroprotection. Leur activité est finement régulée par des stimuli physicochimiques (Température, étirement, pH), pharmacologiques (anesthésiques volatils, fluxétine,…) et physiologiques (GPCR). Lors de ma thèse je me suis intéressé à deux nouveaux modes de régulation de ces canaux ainsi qu'à leur diversité combinatoire. Tout d'abord j'ai mis en évidence que la phospholipase D2, en interagissant avec TREK1, produit un microenvironnement riche en acide phosphatique qui va potentialiser le canal. Cette régulation explique comment un second messager peut spécifiquement réguler un canal ainsi que la sensibilité de TREK-1 à l'alcool. La seconde étude a porté sur l'hétérodimérisation des membres de la sous-famille TREK. Nous avons mis en évidence grâce à des techniques en molécule unique que les sous-unités TREK-1, TREK-2 et TRAAK peuvent hétérodimériser entre elles. Elles forment ainsi des canaux avec de nouvelles propriétés comme une sensibilité particulière au pH. Enfin j'ai étudié le mécanisme d'action d'une toxine, la mycolactone, sur le canal TRAAK. Nous avons montré que cette toxine est impliquée dans le l'hyperpolarisation des fibres nociceptives induisant une analgésie. Cela étant dû à l'activation du canal TRAAK via le récepteur à l'angiotensine II de type 2. La seconde partie du projet a consisté à caractériser la voie de signalisation non canonique induite par la mycolactone / Two pore potassium channel play a key role in the answers of cells of intra and extracellular signals. I have focus my PhD on the study of sub family TREK (TREK-1, TREK-2 and TRAAK). They involved in the nociception, the depression and the neuroprotection. The activity of this channels is finely tuned by several stimuli i) physicals agents like temperature and mechanical stree, ii) chemicals agents like intra and extracellular pH and phospholipids, iii) pharmacological agents like volatile anesthetics, and iv) neurotransmitters via the G protein–coupled receptor. During my PhD I have worked on two new regulation of this channel and are capacity to make heterodimer. In a first time I discovers that TREK-1 interacted with the phospholipase D2 that permit the local production of phosphatidic acid (PA). This made a PA rich microenvironment, this last will tonicaly potentiate the basal activity of the channel. This mechanism explain have a second massager can specifically regulate a channel and how TREK-1 is sensitive to ethanol. In a second time I have work on the heteromerisation of the sub family TREK. With the single molecule technics we have shown that TREK-1, TREK-2 and TRAAK can heterodimerize. This mechanism increase the functional diversity of the family. To finish I have study the action of the toxin mycolacton on the TRAAK channel. We have shown that the mycolacton induce the hyperpolarization of nociceptive nerfs. This is due to the activation of TRAAK channel by the toxin via the angiotensin 2 receptor type II. Next I have shown that the mycolacton induce a non-canonical pathway. This is independent of G-proteins and spatially restricted by a direct interaction between TRAAK and AT2R

In 1990, the classification of carbohydrate-active enzymes (CAZymes) was introduced by the scientist Bernard Henrissat. According to sequence similarity, these enzymes were separated into families with conserved structures and reaction mechanisms. One interesting class of CAZymes is the group of glycoside hydrolases (GHs) containing more than 138000 modules divided into 131 families as of February 2013. One of the most versatile and the largest of these GH families, containing enzymes with numerous biomass-deconstructing activities, is glycoside hydrolase family 5 (GH5). However, for large and diverse families like the GH5 family, another layer of classification is required to get a better understanding of the evolution of diverse enzyme activities. In Paper I, a new subfamily classification of GH5 is presented in order to sort the family members into distinct groups with predictive power. In total, 51 subfamilies were defined. Despite the fact that several hundred GH5 enzymes have been characterized, 20 subfamilies lacking biochemically characterized enzymes and 38 subfamilies without structural data were identified. These highlighted subfamilies contain interesting targets for future investigation. The GH5 family includes endo-β-mannanases catalyzing the hydrolysis of the β-1,4-linked backbone of mannan polysaccharides, which are common hemicelluloses found as storage and structural polymers in plant cell walls. Mannans are commonly utilized as raw biomaterials in food, feed, paper, textile and cosmetic industries, and mannanases are often applied for modifying and controlling the property of mannan polysaccharides in such applications. The overwhelming majority of characterized mannanases are from microbial origin. The situation for plant mannanases is quite different, as the catalytic properties for only a handful have been determined. Paper II describes the first characterization of a heterologously expressed Arabidopsis β-mannanase. / År 1990 introducerade forskaren Bernard Henrissat en klassificering av kolhydrataktiva enzymer (CAZymer), enligt vilken enzymerna - baserat på sekvenslikhet - delades in i familjer med konserverade strukturer och reaktionsmekanismer. En intressant CAZym-klass är glykosidhydrolaserna (GH), en klass som i februari 2013 innehöll fler än 138000 katalytiska moduler indelade i 131 olika familjer. En av de största och mest varierade av GH-familjerna är glykosidhydrolasfamilj 5 (GH5), vilken innehåller en mångfald av identifierade enzymaktiviteter relevanta för nedbrytning av biomassa. För stora och diversifierade familjer som GH5 krävs det dock ytterligare en klassificeringsnivå för att bättre förstå evolutionen och uppkomsten av de många förekommande enzymaktiviteterna. I manuskript I presenteras en ny uppdelning av GH5 enzymer i subfamiljer med syfte att dela upp familjemedlemmarna i distinkta grupper som representerar olika funktioner. Utifrån denna klassificering kan sedan ett enzyms funktion förutsägas baserat på vilken subfamilj det tillhör. Totalt definierades 51 subfamiljer. Trots att hundratals GH5 enzymer har karaktäristerats så visade det sig att 20 av subfamiljerna helt saknar biokemiskt karaktäriserade enzymer och 38 av dem saknar publicerade proteinstrukturer. Dessa subfamiljer är särskilt intressanta för framtida studier. GH5-familjen inkluderar endo-β-mannanaser som katalyserar hydrolysen av den β-1,4-länkade huvudkedjan i mannanpolysackarider. Dessa växtpolymerer som ingår i hemicellulosagruppen är vanligt förekommande i cellväggarna, där de fungerar som energilagringsmolekyler eller har en strukturell funktion. Mannaner används ofta som råmaterial för industriell livs- och djurfodersproduktion, papper, textilier och kosmetika. I dessa processer behövs ofta mannanaser för modifiering och kontroll av egenskaperna hos dessa polysackarider. Den överväldigande majoriteten av alla karaktäriserade mannanaser kommer från mikroorganismer. Endast för ett fåtal växtmannanaser har de katalytiska egenskaperna analyserats. Manuskript II beskriver den första karaktäriseringen av ett heterologt uttryckt β-mannanas från Arabidopsis. / <p>QC 20130506</p>

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.