O reaproveitamento de resíduos agroindustriais como fontes de carbono e de nitrogênio tem sido investigado na área de biotecnologia para produção de enzimas por micro-organismos. Dentre as enzimas microbianas importadas no Brasil, as proteases são aplicadas no processamento tecnológico de detergentes, fármacos, cosméticos, alimentos, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi produzir proteases por cultivo submerso utilizando resíduos agroindustriais. A determinação da atividade proteolítica ocorreu na presença de azocaseína a 0,2 %. Cultivos submersos de culturas isoladas de Bacillus sp. foram realizados em frascos de Erlermeyer. A atividade máxima de proteases foi determinada na presença de milhocina. A concentração do líquido metabólico com atividade proteolítica por ultrafiltração reteve cerca de 80 % da atividade inicial. Um planejamento experimental fatorial foi realizado para investigar a estabilidade do líquido metabólico. A maior atividade proteolítica média do líquido metabólico livre de células (196 U/mL) foi determinada na presença de sorbato de sódio a 0,5 %, cloreto de cálcio a 0,5 %, glicerol a 7,5 % e polietilenoglicol-200 a 0,5 %. O extrato enzimático formulado reteve 68 % da atividade proteolítica com 10 dias de armazenamento à temperatura ambiente (28 ˚C). O retentado com atividade proteolítica apresentou pH ótimo 9 e 11 e retenção de 90 - 100 % da atividade durante 90 min em pH ótimo; a temperatura ótima foi 50 ˚C e a estabilidade térmica máxima a 40 ˚C durante 30 min a pH 11. A formulação de líquido metabólico concentrado com atividade proteolítica que apresenta estabilidade térmica em pH alcalino é um bioproduto que pode ser utilizado como aditivo em detergentes. / The reuse of agro-industrial waste as sources of carbon and nitrogen has been investigated in biotechnology for the production of enzymes by microorganisms. Among the microbial enzymes imported into Brazil, the proteases are applied in technological processes in the fields of detergents, pharmaceuticals, cosmetics, food, among others. The aim of this work was to produce proteases by submerged cultivation in the presence of agro-industrial waste. The determination of proteolytic activity was in the presence of 0.2 % azocasein. Submerged cultivation of Bacillus sp. strains isolated were carried out in Erlermeyer flasks. The maximum protease activity was determined in the presence of corn steep liquor. The concentration of the liquid metabolic by ultrafiltration of the metabolic liquid with proteolytic activity retained 80% of the activity. A factorial experimental design was carried out to investigate the stability of the metabolic liquid. The maximum proteolitic activity of the liquid metabolic cell-free (196 U/mL) was determined in the presence of 0.5 % sodium sorbate, 0.5 % calcium chloride, and 7.5 % of glycerol and polyethyleneglycol-200. The enzyme extract formulated retained 68 % of the proteolytic activity after 10 days at storage at room temperature (28 ˚C). The retentate with proteolytic activity showed optimum pH 9 and 11 and retention 90 - 100 % of the activity for 90 min at optimum pH; the optimum temperature was 50 ˚C e the maximum thermal stability was at 40 ˚C for 30 min at pH 11. The formulation of metabolic liquid concentrate with proteolytic activity which has thermal stability at alkaline pH is a bioproduct which can be used as an additive in detergents.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4672.pdf: 1519614 bytes, checksum: a835ffbdf3a94ccbfaa789a3611d3aa6 (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / Biosurfactants are a surface-active chemical compounds synthesized by microorganisms. These compounds have many advantages when compared to their chemically synthesized counterparts as specific action, low toxicity, higher biodegradability, effectiveness at extreme temperatures, pH and strength ionic. They appear as promising candidates to replace chemical surfactants produced from petrochemicals. The use of renewable and low cost substrates such as agro based industrial wastes is one of the attractive strategies for economical large scale biosurfactants production. In this work, it was evaluated glycerol, a co-product of biodiesel production, as carbon source for biosurfactant production. Two microorganisms, Pseudomonas aeruginosa MSCIC02 and Bacillus subtilis LAMI009, both isolated from environmental sources, were used thorough this work. In the first part of the work experiments were carried out in shake flasks using P. aeruginosa. The results showed that the increase in nitrogen source (sodium nitrate) and the decrease in the carbon source (glycerin) favored rhamnolipids production. In the range studied, the maximum biosurfactant concentration obtained was 2.3 g⋅L-1 (C/N ratio 12). The effect of nitrogen concentration on the biosynthesis of rhamnolipids and pH behavior as a function of the nitrate concentration in the cultures indicated that this strain probably carried a denitrification route favoring the production of rhamnolipids. Experimental runs carried out in bioreactor indicated that the integrated process of production and separation/concentration by fractionation in bubble column equipment caused many operation problems, such as the drag cell, and reducing the concentration of rhamnolipids to 0.4 g⋅L-1in the reaction medium. The kinetics of product formation was evaluated by two models. The Luedeking-Piret model was not able to represent the process. The model proposed by MERCIER et. al. (1992) could adequately describe the rhamnolipids production from P. aeruginosa strain. Emulsifying capacity of the cell-free culture medium was assessed by the emulsification index (EI24). The biosurfactant produced was able to emulsify vegetable oils as well as mineral oils. EI24 greater than 55% was reached. In the second part of the work experimental data from Bacillus subtilis LAMI009 cultivated in shake flasks showed that the growth of this strain was dependent on iv the medium supplementation with yeast extract. A change in culture medium was implemented in order to reduce the length of the lag phase. The use of inorganic nitrogen sources showed that both ammonium nitrate and ammonium sulphate reached similar values of surfactin concentration and volumetric productivity. It was obtained 35 mg⋅L-1 and 6.1 mg⋅L-1⋅h-1, respectively. Surface tension of the cell-free culture medium was similar for both nitrogen sources. The minimal value obtained was 29.7 mN⋅m-1. Sodium nitrate was found to be an adequate nitrogen source for cell growth. However, in these assays low productivity and low surface tension reduction were obtained when compared to the other nitrogen sources evaluated. The supplementation of the culture medium with yeast extract improves the surfactin concentration (60.0 mg⋅L-1) and volumetric productivity (5.2 mg⋅L-1⋅h-1). In this assay the surface tension reached 28.1 mN⋅m-1. The inoculum size had a great influence on cell growth and production of surfactin. When 2% (v/v) of inoculum was used the surfactin concentration and volumetric productivity obtained were 148.2 mg⋅L-1 e 14.22 mg⋅L-1⋅h-1, respectively. The search for genes responsible for production of lipopeptides surfactin and iturine indicated the presence of the genes lpa14 and ituD in B. subtilis LAMI009 genome. Analysis of the chromatography profile of methanol extracts of the lipopeptides from culture medium with ammonium nitrate and sodium nitrate as nitrogen source showed characteristic peaks of the surfactin and iturine. Thereby, it is believed that this strain is a co-producer of both surfactin and iturine. Emulsifying capacity of the cell-free culture medium showed higher stability with the media that employed ammonium nitrate and sodium nitrate as nitrogen source. It was obtained EI24 of 65% with n-hexadecane and 45% with kerosene. The acid precipitation of biosurfactant from the cell-free culture medium showed that this prepurification step promoted an increase in the emulsifying capacity of the mixture of lipopeptides synthesized by B. subtilis LAMI009. The aqueous solution of crude biosurfactant was able to emulsify naphthenic oils, vegetable oils, and an aromatic hydrocarbon. Values of EI24 greater than 65% were obtained. Emulsions formed with naphthenic oils were more stable according to droplet-size distribution. The smaller the size of droplets, the more stable was the emulsion. / Biossurfactantes são compostos químicos tensoativos sintetizados por microrganismos. Estes compostos possuem muitas vantagens quando comparados com seus equivalentes sintetizados quimicamente como ação específica, baixa toxicidade, alta biodegradabilidade, efetividade em condições extremas de temperatura, pH e força iônica. Apresentam-se como substitutos promissores aos surfactantes químicos derivados da indústria do petróleo. A utilização de substratos renováveis e de baixo custo, como os resíduos agroindustriais, consiste em um dos fatores mais importantes para a viabilização econômica da produção destes compostos em escala industrial. Neste trabalho avaliou-se o uso da glicerina, um coproduto da produção de biodiesel, como fonte de carbono para produção de biossurfactante. Dois microrganismos, Pseudomonas aeruginosa MSIC02 e Bacillus subtilis LAMI009, ambos isolados a partir de amostras ambientais, foram empregados neste trabalho. Na primeira parte do trabalho experimentos realizados em frascos agitados com a P. aeruginosa mostraram que o aumento da produtividade de ramnolipídeos foi favorecido pelo aumento da concentração da fonte de nitrogênio (nitrato de sódio) e pela redução da concentração da fonte de carbono (glicerina). Na faixa estudada a concentração máxima de biossurfactante obtida foi de 2,3 g⋅L-1 (razão C/N de 12). O efeito da concentração de nitrogênio sobre a biossíntese de ramnolipídeos e o comportamento do pH em função da concentração de nitrato durante os cultivos indicou que esta cepa possivelmente realizou uma rota denitrificante favorecendo a produção de ramnolipídeos. Os cultivos realizados em biorreator indicaram que o processo de produção integrado a extração/concentração por fracionamento em coluna de bolhas acarretou diversos problemas operacionais, como o arraste de células, e a redução da concentração de ramnolipídeos no meio reacional para 0,4 g⋅L-1. Foram avaliados dois modelos cinéticos de formação de produto para os ensaios realizados. O modelo de Luedeking-Piret não apresentou boa representatividade do processo. O modelo proposto por MERCIER et al. (1992) mostrou-se mais adequado para representar a produção de ramnolipídeos pela cepa estudada. A avaliação da capacidade emulsificante do meio de cultivo livre de células mostrou que o biossurfactante produzido pela P. aeruginosa teve um desempenho eficiente, sendo capaz de emulsificar óleos de origem vegetal e mineral e atingir índice de emulsificação (IE24) maior que 55 %. Na segunda parte do trabalho, cultivos realizados em frascos agitados para avaliação da produção de biossurfactantes lipopeptídeos por B. subtilis LAMI009 indicaram que o crescimento desta cepa foi dependente da suplementação do meio com extrato de levedura. Uma adaptação ao meio de fermentação foi necessária para eliminar a extensa fase lag durante o processo fermentativo. A utilização de fontes de nitrogênio inorgânicas mostrou que tanto o nitrato de amônio quanto o sulfato de amônio apresentaram valores de concentração de surfactina e produtividade volumétrica da ordem de 35 mg⋅L-1 e 6,1 mg⋅L-1⋅h-1, respectivamente. A tensão superficial do meio de cultivo livre de células também foi semelhante para ambas fontes de nitrogênio, cujo valor mínimo foi 29,7 mN⋅m-1. O nitrato de sódio foi fonte de nitrogênio adequada para o crescimento celular, entretanto apresentou baixa produtividade quando comparado com as demais fontes de nitrogênio avaliadas. Com a suplementação do meio de cultivo com extrato de levedura ii obteve-se maior concentração de surfactina (60,0 mg⋅L-1) e produtividade volumétrica (5,2 mg⋅L-1⋅h-1) e menor tensão superficial (28,1 mN⋅m-1) relativamente ao meio de cultivo contendo fonte de nitrogênio inorgânica. O tamanho do inóculo exerceu grande influência sobre a concentração de surfactina e a produtividade volumétrica. Quando se utilizou 2% (v/v) de inóculo a concentração de surfactina e a produtividade volumétrica alcançaram valores de 148,2 mg⋅L-1 e 14,22 mg⋅L-1⋅h-1, respectivamente. A pesquisa de genes responsáveis pela produção dos lipopeptídeos surfactina e iturina indicou a presença dos genes lpa14 e ituD no genoma da linhagem B. subtilis LAMI009. A avaliação do perfil cromatográfico dos extratos metanólicos de lipopeptídeos obtidos a partir dos cultivos com as fontes de nitrogênio nitrato de amônio e nitrato de sódio apresentou picos característicos de outro lipopeptídeo além da surfactina, a iturina,. Portanto, acredita-se que esta linhagem é uma co-produtora de surfactina e iturina. A capacidade emulsificante do meio de cultivo livre de células apresentou maior estabilidade com os cultivos com nitrato de amônio e nitrato de sódio, obtendo-se IE24 de 65 % com n-hexadecano e 45 % com querosene. A separação do biossurfactante por precipitação ácida a partir do meio de cultivo livre de células mostrou que esta etapa de pré-purificação promoveu um aumento da capacidade emulsificante da mistura de lipopeptídeos sintetizada por B. subtilis LAMI009. A solução aquosa do biossurfactante bruto foi capaz de emulsificar óleos naftênicos, óleos vegetais e um hidrocarboneto aromático, apresentando IE24 maiores que 65 % com os óleos avaliados. As emulsões formadas com óleos naftênicos, utilizados como base para lubrificantes, foram mais estáveis. Quanto menor o tamanho das gotas mais estável foi a emulsão formada.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 511649 bytes, checksum: bafb6e1f723d31526306e1605d68727b (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The production of biossurfactants on an industrial scale is usually limited by the high cost of the media components for the microorganisms cultivation. The use of agroindustrial substrates as the basic culture mean for the production of these compounds has been suggested as an alternative to making the process. The objective was to study the production and the tensoatives properties of biossurfactants in culture medias based on manipueira and molasses by bacterial isolates previously identified as biossurfactants producer. The low values of surface tension and the high values of Critical Micellar Dilution (CMD) showed that three isolates, Pseudomonas aeruginosa LBBMA 88A, Bacillus subtilis LBBMA 155 and B. subtilis subsp. spizizenii LBBMA 283, stood out as the best among the ten selected for the study. The culture medias for each of the selected bacterial isolates and mixed cultures containing these same isolates was optimized using the Response Surface Methodology (RSM) through the Central Composite Rotational Design (CCRD). P. aeruginosa LBBMA 88A and the mixed culture composed by the three selected isolates were potentially the greater interest to the production of biossurfactant, since they were the only which the biossurfactants production was influenced only by the concentration of molasses and the only who reached values of DMC at least 10 times. The surfactant produced by P .aeruginosa LBBMA 88A formed emulsions considered stable with kerosene. Temperatures over 70°C and pH values of 4.0 reduced the viscosity of culture media destabilizing the emulsions formed between aqueous solutions of biossurfactants and kerosene. NaCl concentrations above 10 g L-1 altered the tensoative activity because of estabilization of the present.surfactant micelles. The media based on molasses and manipueira achieved satisfactory results for the production of surfactant by the tested isolates with desirable characteristics for environmental applications, particularly the stability in wide ranges of salinity, temperature and pH. / A produção de biossurfactantes em escala industrial é usualmente limitada pelo alto custo dos componentes do meio para o cultivo dos microrganismos. A utilização de substratos agroindustriais como meio de cultura básico para a produção desses compostos tem sido sugerida como alternativa para viabilizar o processo. O objetivo deste trabalho foi o de estudar a produção e as propriedades tensoativas de biossurfactantes em meios de cultura à base de manipueira e melaço por isolados de bactérias previamente identificadas como produtoras de biossurfactantes. Os baixos valores de tensão superficial e os altos valores de Diluição Micelar Crítica (DMC) demonstraram que três isolados, Pseudomonas aeruginosa LBBMA 88A, Bacillus subtilis LBBMA 155 e B. subtilis subsp. spizizenii LBBMA 283, destacaram-se como os melhores entre os dez selecionados para o estudo. Os meios de cultura para cada um dos isolados bacterianos selecionados e para culturas mistas contendo esses mesmos isolados foi otimizado usando-se a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) por meio do Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). P. aeruginosa LBBMA 88A e a cultura mista composta pelos três isolados selecionados foram potencialmente os de maior interesse para a produção de biossurfactante, uma vez que foram os únicos cuja produção de biossurfactantes foi influenciada apenas pela concentração de melaço e que alcançaram valores de DMC de pelo menos 10 vezes. O surfactante produzido por P.aeruginosa LBBMA 88A formou emulsões consideradas estáveis com querosene. Temperaturas acima de 70°C e valores de pH 4,0 reduziram a viscosidade do meio de cultura desestabilizando as emulsões formadas entre soluções aquosas dos biossurfactantes e o querosene. Concentrações de NaCl acima de 10 g L-1 alteraram a atividade tensoativa em razão da desestabilização das micelas presentes. O meio a base de melaço e manipueira alcançou resultados satisfatórios para a produção de surfactante pelos isolados testados com características desejáveis a aplicações ambientais, em especial a estabilidade em amplas faixas de salinidade, temperatura e pH.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

O ácido ƴ-poliglutâmico (ƴ-PGA) é uma homopoliamida aniônica, biodegradável, comestível e atóxica, sintetizada por bactérias do gênero Bacillus, podendo ser utilizado nas indústrias alimentícia e de cosméticos, na medicina e no tratamento de águas residuais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar potenciais aplicações para o ƴ-PGA obtido através do cultivo submerso de Bacillus subtilis BL53, conduzido sob condições otimizadas em trabalhos anteriores. Além disso, foi avaliado o efeito de diferentes inóculos e da adição de precursores da rota metabólica na produção do biopolímero. A melhor condição obtida foi testada em biorreatores com adição de polidimetilsiloxano (PDMS) como carreador de oxigênio, com o objetivo de aumentar a produtividade do biopolímrero. A massa molar média (Mw), obtida através de espalhamento de luz estático, na ordem de 106 g mol-1 não apresentou diferenças significativas para o biopolímero obtido após 48 e 96 h de cultivo. As análises reológicas conduzidas em viscosímetro rotacional indicaram que os polímeros obtidos após 48 e 96 horas apresentaram comportamento Newtoniano, sendo que após 96 horas a viscosidade absoluta foi maior. As análises térmicas (calorimetria diferencial exploratória e análise termogravimétrica) indicaram a temperatura de fusão (Tm) de 134 ºC e 128 ºC e o intervalo de degradação (Td) entre 120 ºC - 190 ºC e 120 ºC - 215 ºC, para os biopolímeros obtidos após 48 e 96 horas de cultivo respectivamente. O caldo LB apresentou-se como o melhor inóculo para a produção de ƴ-PGA. A adição dos precursores L-glutamina e ácido -cetoglutárico aumentou em 20 % a produção do biopolímero. A adição de 10 % de PDMS nos cultivos em biorreatores aumentou o coeficiente volumétrico de transferência de massa (KLa) e a produção e produtividade do ƴ-PGA, sendo produzidos 23.5 g L-1 do biopolímero em 24 horas de cultivo, uma produtividade aproximadamente 40 % superior às obtidas por outros autores utilizando o mesmo microrganismo. / Poly-ƴ-glutamicacid (ƴ-PGA) is an anionic, biodegradable, non-toxic and edible homopolyamide, synthesized by bacteria of the genus Bacillus, being used in food, cosmetics, medicine and waste water treatment. The aim of this study is to characterize and indentify potencial applicatiions for the ƴ-PGA obtained by submerged cultivation of Bacillus subtilis BL53, conducted under optimized conditions in previous studies. We also evaluated the effect of different inoculants and addition of precursors in the metabolic pathway of production of the biopolymer. The best condition obtained yet been tested in bioreactors with addition of polydimethylsiloxane (PDMS) as a carrier of oxygen in order to further increase the productivity of biopolymer. The average molecular weight (Mw) obtained by static light scattering, on the order of 106 g mol-1, showed no significant differences for biopolymer obtained after 48 and 96 h of cultivation. Analyses conducted in rotational viscometer indicated that biopolymers after 48 and 96 h have a Newtonian behavior, and the 96 hours had higher absolute viscosity. The thermal analysis (differential scanning calorimetry and thermo gravimetric analysis) indicated the melting temperature (Tm) as 134 ºC and 128 ºC and degradation temperature range (Td) of 120 ºC - 190 ºC and 120 ºC - 215 ºC, after 48 and 96 hours respectively. It was found that the best inoculum medium for biopolymer production was the LB broth. The addition of the precursors L-glutamine and -ketoglutaric acid increased in 20% the ƴ-PGA production. The addition of 10% of PDMS in bioreactors cultures increased the mass transfer volumetric coefficient (KLa) and the production and productivity of ƴ-PGA, being produced 23.5 g l-1 of the biopolymer in 24 hours of cultivation, a productivity about 40 % higher than those obtained by other authors using the same microorganism.

Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T13:52:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalcante_DanielAugusto_M.pdf: 768554 bytes, checksum: 806781e209c7df41d14d5cfcb03e7401 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A etapa de sanitização é critica e de suma importância para a qualidade microbiológica de vegetais. ÿ importante que o sanitizante seja além de eficaz, seguro do ponto de vista toxicológico. O uso do ozÃ'nio durante o processamento de vegetais prolonga a vida de prateleira, preserva os atributos sensoriais e não produz resíduos tóxicos. O objetivo deste trabalho foi estudar a eficiência o ozÃ'nio como sanitizante em hortaliças folhosas. Em um primeiro momento foi verificada a ação do sanitizante in vitro em Escherichia coli O157:H7 e Bacillus subtilis. O ozÃ'nio foi utilizado nas concentrações de 0,6, 0,8 e 1,0 mg L-1 nos tempos de 1, 3 e 5 minutos para cada concentração. Na seqüência observou-se a ação de água ozonizada durante um minuto na sanitização de alface americana inoculada com E. coli O157:H7 na concentração de 1,0 mgL-1 e, para completar o estudo, foi verificado o comportamento da hortaliça durante dez dias de armazenamento a 2ºC, sob ação de 1,0 mg L-1 de água ozonizada nos tempos de 1, 2 e 3 minutos. No estudo in vitro a E. coli O157:H7 e o Bacillus subtilis, no tempo de 3 minutos de exposição a 1,0 mg L-1 de água ozonizada, apresentaram uma redução de 6,6 e 6,3 ciclos logarítmicos, respectivamente. A atuação de 1,0 mgL-1 de água ozonizada aplicada durante 1,0 minuto em alface americana inoculada intencionalmente com E. coli O157:H7 apresentou uma redução média de 3,2 ciclos logarítmicos. No trabalho de vida de prateleira a alface permaneceu com menos de 3 NMP g-1 de Coliformes termotolerantes durante os 10 dias de tempo de estocagem nos tempos de 1, 2 e 3 minutos, após ser sanitizada com água ozonizada na concentração de 1,0 mgL-1, enquanto que as alfaces tratadas apenas com água corrente apresentaram, no último dia de estocagem, uma população de 1,1x104 NMP g-1 do mesmo microorganismo. Os resultados demonstram que o ozÃ'nio na concentração de 1,0 mgL-1 no tempo de 1 minuto é capaz de manter a qualidade microbiológica de alface americana dentro dos padrões higiênicos vigentes / Abstract: The sanitization is a critical stage for the microbiological quality of vegetables. Itâ?¿s important that the sanitizer has effectiveness, and most be safe of the toxicological point of view. The use of ozone during the process of vegetables contributes to extend their shelf life, to preserve their sensorial attributes without producing toxic residues. The objective of this work was to study the potential of ozone as sanitizer in vegetables. In a first moment, the action of the sanitizer in vitro was verified in Escherichia coli O157:H7 and Bacillus subtlis. The ozone was used at concentrations of 0,6, 0,8 and 1,0 mg L-1 in times of 1, 3 and 5 minutes for each concentration. In the sequence the action of 1,0 mg L-1 of ozone water was observed during one minute in the sanitization of iceberg lettuce inoculated with E. coli O157:H7 and, to complete, the behavior of the vegetable was verified during ten days of storage at 2ºC, by the action of 1,0 mg L-1 of ozone water in times of 1, 2 and 3 minutes. In the study in vitro, the E. coli O157:H7 and the Bacillus subtilis, exposed for 3 minutes to 1,0 mg L-1 of ozone water, presented a reduction of 6,6 and 6,3 logarithmic cycles, respectively. The performance of 1,0 mg L-1 of ozone water applied for 1,0 minutes in Iceberg lettuce inoculated intentionally with E. coli O157:H7 presented a medium reduction of 3,2 logarithmic cycles. Concerning to shelf life the lettuce stayed with less than 3 MPN g-1 of Coliforms thermtolerants during the 10 days of storage in the times, after being sanitized with ozone water 1, 2 and 3 minutes in the concentration of 1,0mg L-1. On the other hand, the lettuce treated only with current water presented, in the last day of storage, a population of 1,1x104 MPN g-1 of the same microorganism. The results demonstrate that the ozone in the concentration of 1,0 mg L-1 in the time of 1 minute is capable to maintain the microbiological quality of iceberg lettuce inside of the effective hygienic patterns / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Larissa_ Kummer.pdf: 3836984 bytes, checksum: 1746a7b3c060c75c722565a4bf452739 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / High concentrations of heavy metals in the soil can affect the sustainability of ecosystems and the health of humans and animals. The metal availability in the environment is related to the characteristics of each element, historical and source of contamination, as well as the properties of each soil. The presence of more than one element is common in contaminated areas and their interaction can affect their behavior in the environment. Researches have been developed to study the behavior of metals in different types of soils and thus help in cases of remediation. In recent years, the soil washing with biosurfactant has been presented as a promising method of remediation with little or no effect on the physico-chemical and microbiological characteristics of the soil, but the costs of obtaining this biosurfactant are still high, because most manufacturers use artificial means for production. Thus, this study had the objective of evaluating the remediation potential of the biosurfactant obtained from the fermentation of cassava water through the action of the bacteria Bacillus subtilis. This biosurfactant was characterized as surfactin, an anionic lipopeptide. Soils of different origins were used, one of them typical of the southwestern state of Paraná and the other from the northwest. The soils were first evaluated according to their potential for adsorption of the elements copper, zinc and lead in monometallic and multimetalic conditions, representing non-competitive and competitive conditions respectively. This evaluation was carried out by tests of adsorption and application of the matematical models of Langmuir and Freündlich. Soils were characterized chemically, physically and mineralogically. After that, it was performed the process of artificial contamination of these soils for application in the experiments of soil washing with biosurfactant in different conditions, having pH and concentration of biosurfactant solution as the main variables. Furthermore, it was also assessed the adsorption s capacity for metals by biosurfactant in liquid medium. The results showed that metals have different behaviors related to the adsorption and desorption to soil and to the biosurfactant. The soil type is also very important for the efficiency of metal removal. The clay soil showed higher adsorption capacity and therefore lower capacity of metal removal when compared to the sandy soil. In general, the soils showed the following sequence of adsorption capacity: Pb > Cu > Zn. The Pb was the element that less desorved by the washing process. It can also be concluded that, when soils are contaminated by more than one element at the same time, its ability to leach is greater than when the element is alone in the medium. This situation occurs because of differences between the competitive processes that take place in the active sites. The washing experiments showed that the biosurfactant was not able to improve the efficiency of removal of metals. The results obtained by the control treatments (only pure water) had very similar values to those that contained biosurfactant. When the wash solution containing the biosurfactant was in high concentrations, decrease in removel efficiency was found in some of the samples. Analysis of high performance liquid chromatography showed that the biosurfactant was adsorbed to soil samples, which is the consequence of not observing the effectiveness of the extractor in the removal of metals. It is notable, however, that the surfactin obtained has the potential to bind to metals, since the tests of adsorption to metals was confirmed by experiments. According to the results obtained, it can be inferred that the surfactin has greater potential for metal removal in liquid media than in solid medium, because of the lower possibility of adsorption. In soil, the results indicated potential use of this biosurfactant as stabilizing of metals in methods of remediation "in situ". / Concentrações elevadas de metais pesados no solo podem afetar a sustentabilidade dos ecossistemas e também a saúde dos seres humanos e animais. A disponibilidade do metal no ambiente está relacionada às características de cada elemento, histórico e fonte de contaminação, bem como às propriedades de cada solo. A presença de mais de um elemento em áreas contaminadas é comum e a interação entre eles pode afetar o seu comportamento no ambiente. Diante do problema, pesquisas vêm sendo realizadas a fim de estudar o comportamento dos metais em diferentes tipos de solos e assim auxiliar nos procesos de remediação. Nos últimos anos, a lavagem do solo com biossurfactante tem sido apresentada como um método promissor de remediação com pequeno ou nenhum efeito sobre as características físico-químicas e microbiológicas do solo, porém os custos de obtenção deste biossurfactante ainda são altos, pois a maioria dos fabricantes utiliza meios artificiais para sua produção. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo geral avaliar o potencial de remediação do biossurfactante obtido a partir do bioprocessamento da manipueira pela ação de bactérias Bacillus subtilis. Este biossurfactante foi caracterizado como surfactina, um lipopeptídeo aniônico. Foram utilizados solos de origens distintas, sendo um deles típico da região sudoeste do estado do Paraná e outro da região noroeste. Os solos utilizados foram primeiramente avaliados de acordo com o seu potencial de adsorção dos elementos cobre, zinco e chumbo em condições monometálicas e multimetálicas, representando condições não-competitivas e competitivas, respectivamente. Esta avaliação foi feita por meio de testes de adsorção e aplicação de modelos matemáticos de Langmuir e Freündlich. Os solos foram caracterizados química, física e mineralogicamente. A partir de então realizou-se o processo de contaminação artificial destes solos para posterior aplicação dos experimentos de lavagem com o biossurfactante em diferentes condições, sendo as variáveis pH e concentração da solução de biossurfactante como as principais. Além disso, também foi avaliada a capacidade de adsorção dos metais pelo próprio biossurfactante, em meio líquido. Os resultados mostraram que os metais apresentam comportamentos distintos quanto a adsorção e dessorção ao solo e ao biossurfactante. O tipo de solo também é muito importante para a avaliação da eficiência de remoção de metais. O solo argiloso apresentou maior capacidade de adsorção e consequentemente menor capacidade de remoção dos metais quando comparado ao solo arenoso. De modo geral, os solos apresentaram a seguinte sequência de capacidade de adsorção: Pb > Cu > Zn. O Pb foi o elemento que menos dessorveu pelos processos de lavagem. Foi possível também concluir que quando os solos estão contaminados por mais de um elemento ao mesmo tempo, a capacidade de lixiviar-se é maior do que quando o elemento está sozinho no meio. Esta situação ocorre em virtude dos processos competitivos existentes entre os sítios ativos. Os experimentos de lavagem mostraram que o biossurfactante não foi capaz de melhorar a eficiência de remoção dos metais. Os resultados obtidos pelos tratamentos controle (somente água pura) tiveram valores muito semelhantes aos que continham biossurfactante. Quando a solução de lavagem continha o biossurfactante em altas concentrações, foi encontrada, em algumas amostras, queda na eficiência de remoção. Análises de cromatografia líquida permitiram concluir que o biossurfactante foi adsorvido às amostras de solo, sendo esta a consequência da não observação da eficácia do extrator na remoção dos metais. Cabe ressaltar, entretanto, que a surfactina obtida apresenta potencial de ligar-se aos metais, uma vez que os testes de adsorção desta aos metais foi confirmado pelos experimentos realizados. De acordo com os resultados encontrados, pode-se inferir que a surfactina tem maior potencial de remoção de metais em meio líquido do que em meio sólido, devido a menor possibilidade de adsorção na matriz sólida. Em solo, os resultados indicaram potencial de utilização deste biossurfactante como agente de estabilização dos metais em métodos de remediação in situ .

The grapevine is a fruit that has significant importance in the world economic sector and several factors may compromise its development and especially productivity, including pathogen attack. The disease known as downy mildew is caused by Plasmopara viticola and may cause serious damage to the crop if not controlled. Thus, the major way of controling the disease is associated with the use of fungicides, which causes risks to the environment and human health. The aim of this study was to evaluate the potential of biological agents and chitosan on controlling downy mildew throughthe induced resistance mechanism in grapevine cv. Cabernet Sauvignon. It was hypothesized that the biological agents Trichoderma spp. and Bacillus subtilis, as well as chitosan have the ability to affect directly the viability of P. viticola sporangia and to elicit defense responses in leaf cells of grapevine. Germination of sporangia was measured in vitro andexperiments in greenhouse were conducted, aimed at monitoring the progress of downy mildew on plants exposed to the products studied and, two days later, inoculated with P. viticola. In another experiment, in the absence of the pathogen, leaf tissue of grapevine plants exposed to the same products was collected for conducting biochemical and biological analysis, aiming to characterize the induction of resistance (IR) in plant cells. The activity of pathogenesis related proteins (PRPs) such as guaicol peroxidases, chitinases , β-1,3-glucanases , and polyphenoloxidases in leaves exposed to the products was determined, as well as the levels of total soluble phenols and lignin. Chitosan, but not the biological control agents, reduced the viability of sporangia of P. viticola. All products promoted protection, although not significant when compared to control plants. All studied products produced alterations in the production of PRPs and total phenols. Despite the sharp increase, but not significant, in the lignin content of leaves, small reduction in the area under the mildew progress curve was observed that can be attributed to mechanisms of resistance induction activated by the products studied through elicitor action. / A videira é uma frutífera que possui relevante importância no setor econômico mundial, sendo que vários fatores podem comprometer seu desenvolvimento e consequente rendimento, incluindo o ataque de patógenos. A doença conhecida como míldio da videira, causada pelo pseudofungo Plasmopara viticola, causa sérios danos à cultura quando não controlada. Dessa maneira, a principal forma de controle da doença está associada à utilização de químicos, os quais causam riscos ao ambiente e à saúde do homem. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de agentes biológicos e quitosana, na viabilidade de esporângios de míldio, o efeito no progresso da doença e os mecanismos de indução de resistência vegetal, em plantas de videira cv. Cabernet Sauvignon. Hipotetizou-se que os agentes biológicos Trichoderma spp. e Bacillus subtilis, bem como quitosana têm a capacidade de afetar diretamente a viabilidade de esporângios de P. viticola, assim como atrasar ou evitar o progresso de míldio e elicitar respostas de defesa em células foliares de videira. Para tanto, a viabilidade de esporângios de P. viticola foi analisada in vitro e experimentos em casa de vegetação foram conduzidos, afim de, acompanhar o progresso de míldio em plantas de videira expostas aos produtos estudados. Em outro experimento, na ausência do patógeno, tecido foliar de plantas de videira, submetidas aos mesmos produtos, foi coletado para realização de análises bioquímicas e metabólicas, visando à caracterização da indução de resistência (IR) celular vegetal. Foram determinadas atividades de proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) como peroxidases de guaicol, quitinases, β-1,3-glucanases e polifenoloxidases em folhas expostas aos produtos, bem como os teores de fenóis solúveis totais e lignina. A quitosana, mas não os agentes biológicos, reduziram a viabilidade dos esporângios. Todos os produtos estudados geraram alterações na produção de PRPs e fenóis totais. Os teores de lignina embora não significativos em relação à testemunha demonstraram aumento, e isso pode estar associado com a porcentagem de proteção que os produtos conferiram às plantas de videira na área abaixo da curva de progresso da doença, induzindo a produção de compostos envolvidos na síntese de lignina.

En réponse à un stress nutritif, les espèces du genre Bacillus sont susceptibles de former desspores métaboliquement dormantes résistantes à d’autres formes de stress. Ces spores peuventse retrouver à forte concentration dans beaucoup d’aliments secs, ce qui peut provoquer desintoxications alimentaires ou dégrader les aliments lorsqu’ils sont réhydratés. Comme leurdestruction est très difficile, la plupart des méthodes couramment utilisées pour décontaminerles aliments secs sont peu efficaces. L’objectif de ce travail est de comprendre l’influence del’hydratation de la spore sur l’inactivation des spores sèches de B. subtilis. Une étudefondamentale a été menée en soumettant les spores placées dans les capsules d’AnalyseEnthalpique Différentielle à différent traitements thermiques et en associant simultanémentles thermogrammes obtenus à la viabilité des spores traitées. Les résultats montrent lapersistance d’une teneur en eau relativement élevée dans le protoplaste des spores équilibréesà faible aw (0,13). De plus, une relation forte a été mise en évidence entre la teneur en eau duprotoplaste de la spore et sa sensibilité thermique. La spectroscopie IR à transformée deFourier a montré que cette sensibilité est fortement reliée à la dénaturation/agrégation desprotéines et à la libération de l’acide dipicolinique. Ces résultats ont finalement permis dedévelopper un procédé d’inactivation thermique sous pression (entre 2 et 7 bar) des sporessèches. Le maintien d’une pression d’azote dans le réacteur chauffé permet d’empêcherl’évaporation de l’eau du protoplaste des spores et donc de favoriser leur inactivation. A termeet après développement, ce procédé peut être un moyen original de décontaminationd’aliments secs. / In response to starvation, species from the genre Bacillus are able to form metabolicallydormant spores which are very resistant to multiple forms of stress. They are found in quitehigh concentrations in some dried foods which, upon rehydration, may lead to food deterioration or food-borne diseases. Moreover, their destruction is rather difficult and mostof the techniques commonly used to treat dry foods result in a very low spore inactivation.The aim of this work is to better understand the role spore hydration in the inactivation ofdried Bacillus subtilis spores. A fundamental study was conducted using DifferentialScanning Calorimetry pans as reactors to perform a heat treatment in dried spores andsimultaneously relate the thermograms to spore viability. Results show the persistence of arelatively high water concentration in the core of extremely dry spores. Besides, a strongrelation between this core water concentration and spore thermal sensitivity wasdemonstrated. This destruction was found to be highly related to proteindenaturation/aggregation and dipicolinic acid release through Fourier Transform InfraredSpectroscopy analysis. From this fundamental study, a procedure for the inactivation of driedspores using low pressures (2-7 bar) and high temperature was developed. The systemconsisted of a heated reactor in which gaseous nitrogen was compressed to prevent theevaporation of water from the spores and so favor spore inactivation (> 5 log10). This methodof inactivation could be an interesting new way to optimize the decontamination of driedfoods.