Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Grapevines are one of the most cultivated fruits in the world, and many factors can affect its potential income and longevity, including pathogens attack. In 1990, black foot disease of grapevine began to worry producers and agronomists in various places of the planet where the crop was grown. Since 1999, plants with disease symptoms have been observed in Brazil. However, little is known about this disease in the southern region of the country. Thus, this study aimed to: 1) characterize isolates of the Ilyonectria spp. and Campylocarpon pseudofasciculare associated with black foot disease and study their pathogenicity; 2) evaluate Bacillus subtilis and Trichoderma spp. on the control in vitro and in vivo of Ilyonectria macrodidyma. For that, symptomatic plants were collected in georeferenced vineyards of Rio Grande do Sul. Isolation of the pathogen occurred from necrotic fragments of roots and crown for further study of the etiology and pathogenicity. In vitro tests (volatile metabolites and pairing of cultures) and in vivo (Vitis vinifera cv. Merlot grafted on Paulsen 1103) were performed to evaluate the control efficiency of Bacillus subtilis and Trichoderma spp., obtained from different commercial products, over Ilyonectria macrodidyma. Morphological characterization and multi-gene analysis of three regions (ITS, β-tubulin and histone H3) confirmed the existence of Ilyonectria macrodidyma, Ilyonectria robusta, "Cylindrocarpon" pauciseptatum and Campylocarpon pseudofasciculare associated with black foot disease. All 20 isolates were pathogenic to Vitis labrusca cv. Bordô, resulting in reduced mass of roots and shoots, roots and crown necrosis, vascular lesions, wilting of shoots and plant death. Bacillus subtilis and Trichoderma spp. were effective in inhibiting the mycelial growth of I. macrodidyma through volatile metabolites and pairing of culture tests. / A videira é uma das principais frutíferas cultivadas no mundo, sendo que diversos fatores podem afetar seu potencial de rendimento e longevidade, incluindo o ataque de patógenos. A partir da década de 90, a doença pé-preto da videira começou a preocupar viticultores e técnicos em várias locais do planeta onde a cultura é cultivada. Desde 1999, vem sendo observadas plantas com sintomas da doença no Brasil. Porém, pouco se conhece sobre essa enfermidade na região sul do país. Assim, este trabalho objetivou: 1) caracterizar isolados de Ilyonectria spp. e Campylocarpon pseudofasciculare associados à doença pé-preto, bem como estudar sua patogenicidade e 2) avaliar Bacillus subtilis e Trichoderma spp. no controle in vitro e in vivo de Ilyonectria macrodidyma. Para isso, plantas sintomáticas foram coletadas em vinhedos georreferenciados do Rio Grande do Sul. Isolamento do patógeno se deu a partir de fragmentos necrosados de raízes e colo para posteriores estudos de etiologia e patogenicidade. Foram realizados testes in vitro (metabólitos voláteis e pareamento de culturas) e in vivo (Vitis vinifera cv. Merlot enxertada em Paulsen 1103) para avaliar a eficiência de Bacillus subtilis e Trichoderma spp., obtidos de diferentes produtos comerciais no controle de Ilyonectria macrodidyma. O estudo de caracterização morfológica e análise multi-gene de três regiões (ITS, β-tubulina e histona H3) confirmaram a existência de Ilyonectria macrodidyma, Ilyonectria robusta, Cylindrocarpon pauciseptatum e Campylocarpon pseudofasciculare associados à doença pé-preto. Todos os 20 isolados foram patogênicos a Vitis labrusca cv. Bordô, resultando em redução de massa de raízes e parte aérea, necrose no colo e raízes, lesões vasculares, murchamento de parte aérea e morte de plantas. Bacillus subtilis e Trichoderma spp. foram eficazes na inibição do crescimento micelial de I. macrodidyma através de testes de metabólitos voláteis e pareamento de culturas.

O objetivo deste trabalho foi a construção de linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis capazes de expressar porções de intimina, principal componente envolvido na capacidade de colonização de linhagens enteropatogênicas de Escherichia coli (EPEC), como estratégia vacinal de administração oral contra diarréias infecciosas. As vacinas desenvolvidas empregaram cinco regiões da intimina de EPEC e linhagens de B. subtilis capazes de expressar e acumular proteínas recombinantes no citoplasma. Além disso, avaliamos o uso de esporos e células vegetativas como veículos vacinais para a entrega de antígenos recombinantes a partir de sistema de expressão epissomal. A eficácia do modelo vacinal foi demonstrada pela: (i) produção de anticorpos sistêmicos (IgG) e secretados (sIgA) contra intimina, (ii) capacidade de neutralização das intiminas expressas por diferentes linhagens de EPEC pelos anticorpos específicos gerados nos animais imunizados; e (iii) proteção a desafio com linhagens de EPEC a partir de modelo experimental que emprega camundongos recém-nascidos. Os resultados representam uma etapa importante na validação de uma nova estratégia vacinal para o controle de patógenos entéricos. Além disto, propomos a utilização de um modelo animal como uma nova ferramenta para se avaliar o potencial protetor de vacinas contra EPEC. / The objective of this work was the construction of genetically modified strains of B. subtilis able to express portions of intimin, the main component involved in colonization by enteropathogenic Escherichia coli strains (EPEC) as a strategy of oral vaccination against infectious diarrhea. The vaccines employed five regions of EPEC intimin and B. subtilis strains expressing recombinant proteins in the cytoplasm. Furthermore, we evaluated the use of spores and vegetative cells as vaccine vehicles for the delivery of recombinant antigens based on an epissomal expression system. The efficacy of the vaccines was demonstrated by: (i) production of systemic (IgG) and mucosal (sIgA) antibody responses to intimin, (ii) neutralizing of intimin expressed by different strains of EPEC by the antibodies generated in immunized animals, and (iii) protection to lethal challenges carried out with EPEC strains using an experimental model based in newborn mice. The results represent an important step in the validation of a new vaccine strategy for the control of enteric pathogens. Moreover, we propose the use of an animal model as a new tool to evaluate the protective potential of vaccines against EPEC.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O camarÃo peneÃdeo Farfantepenaeus subtilis à uma importante espÃcie nativa do litoral nordestino que possui uma grande ocorrÃncia na pesca. Dentre os camarÃes marinhos de importÃncia comercial, os peneÃdeos se destacam por constituÃrem um valioso recurso para pesca e aqÃicultura em regiÃes tropicais e subtropicais. Entretanto, a disponibilidade de informaÃÃes sobre essas espÃcies à bastante escassa, principalmente em relaÃÃo à estrutura genÃtica que atua no crescimento muscular desses animais. Tendo como objetivo identificar genes envolvidos na contraÃÃo muscular de camarÃes, neste trabalho foram parcialmente isolados e seqÃenciados os genes de betaactina e miosina de cadeia pesada do camarÃo rosa F. subtilis, a partir do cDNA do mÃsculo abdominal. Para tanto, camarÃes coletados no estuÃrio do rio Pacoti, estado do CearÃ, foram inicialmente identificados taxonomicamente e, depois atravÃs de amplificaÃÃo de DNA seguida por sequenciamento das regiÃes citocromo oxidase subunidade I (COI) e 16S. Utilizando-se os tecidos frescos dos camarÃes, foi extraÃdo o RNA total e foram obtidos os respectivos DNAs complementares (cDNAs). Baseado na construÃÃo de primers especÃficos a partir do alinhamento entre sequÃncias descritas no Genbank/NCBI, os genes foram isolados por meio de RT-PCR (ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase atravÃs da transcriptase reversa) e seqÃenciados. Foi obtido um fragmento parcial de 760 pares de base para o cDNA de beta-actina e para o cDNA de miosina de cadeia pesada foi obtido um fragmento de 570 pares de base. AnÃlises das sequÃncias realizadas pela ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) revelaram alta similaridade com outras beta-actinas e miosinas de camarÃes, confirmando a identidade das sequÃncias genÃticas isoladas. Como resultado do alinhamento pareado entre as sequÃncias desses genes obtidos no trabalho com as de outras espÃcies presentes no GenBank, pÃde-se observar que as maiores similaridades foram com Penaeus monodon (93%) e com Farfantepenaeus paulensis (88%). Os resultados obtidos neste estudo demonstraram a viabilidade da metodologia utilizada na identificaÃÃo de genes relacionados com caracterÃsticas importantes. Esses dados irÃo facilitar o isolamento completo das sequÃncias desses genes, alÃm de contribuir para incentivar a identificaÃÃo de outros genes importantes em camarÃes, principalmente os nativos do Brasil. AnÃlise de genes que atuam desenvolvimento do tecido muscular do animal poderà fornecer informaÃÃes genÃticas importantes acerca de uma espÃcie nativa que està sendo superexplorada e que poderà ser viÃvel para cultivo. Outrossim, esses dados beneficiarÃo a comunidade cientÃfica, servindo como base para estudos de fisiologia, filogenia e evoluÃÃo em peneÃdeos / The penaeid shrimp Farfantepenaeus subtilis is an important native species for fisheries industry in Brazil. Among marine shrimps of commercial importance, penaeids are recognized as a valuable resource for fishery and aquaculture in tropical and subtropical regions. However, data on these species is extremely reduced, especially concerning genetic elements involved in animal muscle growth. Therefore, aiming at identifying shrimp genes directly associated with muscle contraction in this research, beta-actin and myosin heavy chain genes of the pink shrimp F. subtilis were isolated from its muscular abdominal and partially sequenced. Shrimps collected from Pacoti estuary, CearÃ, were first identified through taxonomy and, then, through DNA amplification followed by sequencing of Cytochrome Oxidase subunit I (COI) and 16S. From fresh shrimp tissues, total RNA was extracted and complementary cDNA was obtained. Based on specific primers designed after sequence alignments performed against sequences at GenBank/NCBI, genes were amplified from RT-PCR (reverse transcriptase - polimerase chain reaction) and sequenced. A 760bp partial F. subtilis beta-actin cDNA fragment was obtained, while the partial F. subtilis myosin heavy chain cDNA was 570bp long. Sequence analyses using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) program indicated that F. subtilis beta-actin gene product is very similar to betaactin of other species of shrimps, while the myosin heavy chain protein is highly homologous to crustacean myosins heavy chain, confirming the identity of the isolated gene sequences. Alignment of these gene sequences with other sequences in GenBank showed high similarity with Penaeus monodon (93%) and Farfantepenaeus paulensis (88%). Results have showed the feasibility of partial gene identification as a means to identify genes of strategic interest. These data would help further attempts to elucidate the complete isolation of these genes, as well as the detection of other important genes, especially from shrimp species occurring at the Brazilian coast. Genes analyses involved with muscle growth might provide important genetic information on native species that are overexploited and may be viable for the shrimp cultivation. In addition, these data might also benefit the scientific community, improving a range of research areas such as physiology, phylogeny and evolution of penaeids

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

Seja no meio ambiente, dentro de um hospedeiro ou em outro habitat, bactérias estarão frequentemente enfrentando condições adversas, como exposição a compostos antibacterianos ou carência nutricional. Em situações como essas, as bactérias são capazes de ativar a chamada resposta estringente, modulada pelo alarmônio (p)ppGpp. O acúmulo de (p)ppGpp promove a inibição da transcrição de rRNAs e tRNAs e a supressão do processo de tradução, e a ativação de operons de biossíntese de aminoácidos. Sabe-se também hoje que a resposta estringente está relacionada a outras importantes carências nutricionais em Escherichia coli, como a falta de ácidos graxos, porém não se sabe se o mesmo ocorre em Bacillus subtilis ou em outras Grampositivas. (p)ppGpp atua também direta e indiretamente em vários outros processos celulares, como motilidade, resistência a antibióticos, virulência e persistência, indicando que (p)ppGpp é um regulador central que integra informação metabólica e respostas adaptativas. O presente trabalho buscou estudar a correlação da resposta estringente de B. subtilis com a carência de ácidos graxos e a busca por pequenas moléculas capazes de modular RelA (a principal proteína envolvida na síntese de (p)ppGpp) e impedir o acúmulo de (p)ppGpp. Para a indução da carência de ácidos graxos, foram utilizadas duas estratégias; uso da droga Cerulenina (inibidor de FabF) e mutantes condicionais no gene FabF. Observou-se que mutantes incapazes de ativar a resposta estringente (cepa ppGpp(0) ou RelAD264G) apresentaram grande perda de viabilidade celular durante a carência de ácidos graxos, ao passo que a cepa selvagem manteve sua viabilidade celular. A causa da morte se deu majoritariamente devido ao colapso do potencial de membrana. Apesar de não termos observado aumento de (p)ppGpp nas células selvagens durante a carência de ácidos graxos, observou-se uma redução da razão GTP/ATP, ao passo que na cepa ppGpp(0), a razão GTP/ATP aumentou, devido ao acúmulo de GTP. O uso da droga decoinina, capaz de reduzir os níveis intracelulares de GTP, resgatou parcialmente a viabilidade da cepa e impediu a perda do potencial de membrana, indicando que os níveis de GTP são importantes durante a carência de ácidos graxos em B. subtilis. Para a triagem de pequenas moléculas inibidoras do acúmulo de (p)ppGpp, foi utilizada uma biblioteca de 2320 diferentes compostos químicos, e buscou-se drogas capazes de reverter o fenótipo de crescimento lento de cepas de B. subtilis que acumulam (p)ppGpp (via mutação pontual; mutante RelAH77A e via tratamento com o indutor hidroxamato de arginina) em meio rico. A primeira etapa selecionou 40 moléculas capazes de resgatar o crescimento de células tratadas com arginina-hidroxamato, porém apenas uma, salicilanilida, foi capaz de também resgatar o crescimento da cepa RelAH77A. Todavia, apesar de ser capaz de acelerar o crescimento de B. subtilis esse efeito é limitado. Diversos análogos de salicilanilida foram testados, porém não apresentaram efeito superior a salicilanilida para a reversão do fenótipo de crescimento lento de B. subtilis. Em adição, a droga não foi capaz de aumentar a sensibilidade dos organismos a diversos antibióticos testados, e aparentemente é incapaz de alterar os níveis internos de (p)ppGpp, porém é capaz de causar alterações nos níveis de ATP. Logo, acredita-se que o efeito observado para o crescimento das células seja devido a efeitos indiretos, possivelmente envolvendo alteração de outros nucleotídeos fosforilados. / In the environment, inside a host or other habitat, bacteria will always face adverse conditions, as for example exposure to antimicrobials or starvation. In situations like those, bacteria activate the stringent response, modulated by the alarmone (p)ppGpp. (p)ppGpp accumulation promotes inhibition of rRNA and tRNA transcription and suppression of translational process, at the same time that it activates several amino acid biosynthesis operons. It is known also that the stringent response it is related to other starvation stress in Escherichia coli, like lack of fatty acids, but there is no knowledge if the same occurs for Bacillus subtilis or other gram-positive bacteria. ppGpp acts directly and indirectly affecting several other cellular process, as motility, resistance to antibiotics, virulence and persistence, indicating that (p)ppGpp is a central regulator that integrates metabolic information and adaptive responses. This work aimed to study the correlation between the stringent response in B. subtilis with fatty acid starvation, and search for small moleculas capable of modulating RelA (the main enzyme responsible for ppGpp synthesis) and stop (p)ppGpp production. For fatty acid starvation induction, two strategies were used; use of the drug Cerulenin (inhibitor of the FabF protein) and conditional mutants of the FabF gene. We observed that mutants incapable of activating the stringent response (strains ppGpp(0) ou RelAD264G) presented great loss of viability during fatty acid starvation, whereas the wild-type strain keeps its viability. The main cause of death is due membrane rupture in some cells, but mainly due to membrane potential collapse. Although we did not observed increase of (p)ppGpp in wild-type strains during fatty acid starvation, we observed reduction in GTP/ATP ratios, a hallmark of (p)ppGpp production in gram-positive bacteria. In the strain ppGpp(0) GTP/ATP ratio increased, mainly due to GTP increase. Using the drug decoyinine, capable of reducing GTP levels, partially recued viability and protects cells of losing its membrane potential, indicating that GTP levels plays an important role during fatty acid starvation in B. subtilis. For the screening of small molecules capable of inhibit (p)ppGpp production, a library of 2320 different chemical compounds were used, and we looked for drugs capable of reverting the slow growth phenotype of B. subtilis strains with (p)ppGpp accumulation (using a mutant RelAH77A; and using a stringent response inductor, arginine hidroxamate). The first step selected for 40 molecules capable of rescuing the growth of cells treated with arginine hidroxamate, but only one drug, salicilanilyde could also rescue the growth of the strain RelAH77A. Although capable of rescuing growth of B. subtilis that accumulates (p)ppGpp, this rescue is limited. Several analogues of salicilanilyde were tested, but none were stronger than salicilanilyde itself in rescuing growth of slow growing strains of B. subtilis. In addition, the drug was not capable of increasing antibiotic sensibility and it is incapable of changing intracellular (p)ppGpp levels, but it does shifts ATP levels. Therefore, we believe that the observed effects of salicilanilyde is due indirect action, probably involving other phosphorylated nucleotides, rather than modifying (p)ppGpp levels

Em âmbito hospitalar é crescente o emprego de dispositivos confeccionados de distintos materiais termossensíveis. Assim, o emprego de metodologias esterilizantes compatíveis tem sido o foco de muitas pesquisas, dentre as quais destacam-se estudos envolvendo o plasma. O mecanismo de ação deste desenvolve-se com a aplicação de Rádio-Freqüência a gases precursores, resultando na inativação microbiana por espécies altamente reativas. Este método inovador caracteriza-se por não gerar riscos de toxicidade ocupacional e aos pacientes, e ser processado em temperatura próxima ao ambiente. Para análise comparativa foi utilizado o método de esterilização por óxido de etileno (agente químico na forma gasosa). Este gás apresenta características de elevada inflamabilidade, explosividade e toxicidade, por isso é usado diluído em gases inertes, além de deixar residual no material esterilizado, tendo que ter um controle rigoroso no processo de aeração; porém atualmente é um dos métodos mais utilizados para esterilização de materiais odonto-médico-hospitalares, particularmente os termossensíveis. O principal objetivo deste trabalho foi estudar diferentes parâmetros do processo e seus respectivos resultados, que influenciam na esterilização empregando plasma e compará-los com os obtidos empregando óxido de etileno. O equipamento utilizado para o estudo dos processos de esterilização por plasma foi o ICP (Inductively Coupled Plasma). Analisou-se assim para o plasma algumas distintas combinações de parâmetros, tais como: gases (oxigênio puro e mistura deste com peróxido de hidrogênio a 5,10 e 20%), pressão (330 mTor), vazão do gás (100sccm), temperatura (próxima ao ambiente), potência de rádio-freqüência (300, 350 e 400W), tempos de exposição (com intervalos de 3 a 60 min) e umidade relativa (80±5%). No ICP foram desenvolvidas duas fases planejadas para os processos, seguindo uma programação experimental, já no óxido de etileno foram realizadas três séries de exposições sub–letais utilizando mistura esterilizante Oxyfume® 2002 (10% Óxido de Etileno, 63% HCFC 124 e 27% HCFC 22), sendo os parâmetros padronizados: umidade relativa (40 a 60%), concentração do gás (450 mg/L), temperatura (55° C) e tempos de exposição (com intervalos de 3 a 15 min.). Todos os ciclos foram realizados em triplicata. Esporos de Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 foram obtidos a partir de suspensões de microrganismos e inoculados em suportes na concentração de 107 UFC/suporte para serem utilizados nos estudos dos processos de esterilização. Empregou-se a técnica de Pour Plate (incubação em estufa por 24hs a 37 °C) para a quantificação dos esporos. Para o processo de esterilização por plasma os resultados obtidos forneceram valores D que variaram entre 8 e 3 min., dependendo dos parâmetros testados, e para o processo de esterilização por óxido de etileno o Valor D foi de 2,80 min. Concluiu-se que o processo de esterilização por plasma apresentou resultados interessantes e promissores e os melhores resultados foram obtidos com as potências maiores de 350 e 400W para o gás oxigênio puro, caracterizando o plasma como alternativa promissora de esterilização, devido às suas características positivas frente ao óxido de etileno, pois os valores D entre os dois processos de esterilização não apresentaram uma diferença significativa. / The gas Plasma sterilization technology has been emerging as an alternative to conventional low temperature processes since the advent of new therapies using heat sensitive materials in the healthcare field is greater than ever. The gas Plasma mechanism of action includes the generation of actives species by an electrical discharge, which is able to promote lethal effect on microorganisms. The sterilization techniques using gas plasma are under intense investigation and it has already been demonstrated by recent studies that this technology is simple, cost-effective, suitable for microbicidal activity and absent of toxic residuals. Ethylene oxide is the sterilization agent most widely applied to medical devices. However, its explosiveness, inflammability and toxicity led to the search for other sterilization methods at low temperature and it has been used associated to non active gases which inhibit these properties and it is necessary to have the control at the occupational safety and environmental monitoration. Therefore, the aim of this work was to explore possible microbicidal application of the gas plasma sterilization generated by an inductively coupled system and to compare this sterilization method with ethylene oxide (chemistry substance in gaseous form), observing their D value. It was used distinct combinations of process parameters to sterilization by plasma, as follows: radio-frequency powers (300, 350 and 400 watts), exposition times (in the range of 3 to 60 minutes), gas (pure oxygen and mixture with hydrogen peroxide 5,10 and 20%), gas flow (100 sccm), pressure (330 mTorr), temperature (close to the environmental one) and relative humidity 80±5%. For ethylene oxide, Oxyfume 2002® was used (mixture of ethylene oxide, HCFCs 22 and 124), under the concentration of 450mg/L, at the temperature of 55°C and relative humidity of 50±5% and it was submitted to a time of exposition between 3 to 15 minutes. Both processes were submitted to exposition cycles in triple. Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 inoculated in a standard load of 107 spores per carrier was used as biological indicator. After the exposition, the biological indicator\'s spore survivors were counted by the \"Pour Plate\" technique (incubation temperature of 35 ± 2ºC for 24 hours). Significant microbial reduction was observed in some cases where the plasma D value was between 3 and 8 min and 3,08 min, 3,04 min. to 350 and 400W powers respectively. In the ethylene oxide process the D value was 2,80 min. These results evidenced the higher effectiveness of ethylene oxide comparatively to plasma. However the latter presents advantages that make it an interesting alternative to low temperature sterilization processes.

Tendo em vista a importância do processo esterilizante aplicado a produtos farmacêuticos e aos produtos médico-hospitalares, distintos métodos foram desenvolvidos de forma a possibilitar sua aplicação, inclusive a materiais termossensíveis. Neste contexto, o processo que se tornou mais amplamente empregado consiste naquele utilizando o óxido de etileno. Este agente, devido às características de inflamabilidade e explosividade, tem sido usado diluído em gases inertes, predominantemente os clorofluorcarbonos (CFCs), que contornam tais problemas. Conhecimentos recentemente adquiridos e consenso internacional quanto ao risco da depleção da camada de ozônio da estratosfera ocasionaram a busca de alternativas, dentre as quais a adoção dos hidroclorofluorcarbonos (HCFCs). O delineamento do presente trabalho objetivou a comparação da eficácia esterilizante de misturas de óxido de etileno em CFC 12 (Oxyfume 12R), e em HCFCs 22 e 124 (Oxyfume 2002R), quando aplicadas em diferentes concentrações (450 mg/L e 600mg/L) e sob distintas temperaturas (45°C, 55°C e 65°C). Procedeu-se a desafios subletais (3, 6 ,9, 12 e 15 minutos de exposição), empregando a cada ciclo seis indicadores biológicos laboratorialmente preparados, com esporos de Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 obtidos em garrafas de Roux contendo meio de esporulação, sendo a seguir padronizados, inoculados em suportes celulósicos e acondicionados em embalagens filme-papel, perfazendo um total de 1080 monitores. Paralelamente foram também submetidos a desafios indicadores biológicos de aquisição comercial (AttestR 1264, 3M), dois a cada ciclo, perfazendo 360 unidades. Os resultados de resistência obtidos (valor D) nos 180 ciclos privilegiaram estes últimos, levando tal resultado a considerações quanto ao procedimento de purificação da suspensão de esporos e diferenças existentes entre suportes e acondicionamentos empregados. A eficácia esterilizante de ambas as misturas, Oxyfume 12R e Oxyfume 2002R, revelou-se equivalente, mesmo em diferentes concentrações. Além de observações que evidenciaram os efeitos significantes quanto à preparação dos indicadores biológicos, foi evidente e estatisticamente significante ( p=1% ) o efeito do aumento da temperatura, promovendo efeito mais intenso sobre a letalidade dos esporos. Numa outra abordagem, de conotação ocupacional, procedeu-se também no decorrer do trabalho experimental à monitoração do ambiente quanto a resíduos de óxido de etileno, usando bomba e tubos de detecção da DragüerR: os resultados obtidos nas diferentes posições e momentos, inferiores a 1 ppm, proporcionaram a conclusão de que, respeitando a adoção dos conceitos de engenharia indicados na Portaria Interministerial nº 482 de 16 de abril de 1999, publicada no Diário Oficial da União do dia 19 do mesmo mês e ano, é obtida condição compatível com a presença humana. É portanto gratificante que se possa concluir o trabalho com o sentimento de que efetivamente se tenha constituído em contribuição no sentido de permitir a manutenção de emprego do processo esterilizante em pauta, conferindo segurança ao paciente no uso de produtos, sem entretanto comprometer a vida humana em nosso planeta. / Taking into account the importance of the sterilization process applied to medicines and medical devices, different kinds of methods have been developed, also applicable to heat sensitive materiais. Ethylene oxide is the process most widely applied to medical devices. Due its explosiveness and inflamability, it has been used associated to non active gases, wich inhibit these properties, mainly the chlorofluorocarbons (CFCs). Recent knowledge about ozone-depleting gases and an international consensus on the need of reducing their effects are promoting a search for alternative chemicals. From these, one of the most interesting are the hydrochlorofluorocarbons (HCFCs) which, besides having this role, can also be used as transitional compounds while more environmentally suitable compounds are not available. This paper aims to compare two ethylene oxide sterilization mixtures: Oxyfume 12R (using CFC 12) and Oxyfume 2002R (using HCFCs 22 and 124), under different concentrations (450mg/L and 600mg/L) and different temperatures (45°C, 55°C and 65°C). To accomplish this procedure, sub-Iethal challenges were performed (3, 6, 9, 12 and 15 minutes of exposition), in a total of 180 cycles, using six biological indicators per cycle prepared in a laboratory, in a total of 1080 units, as well as two others purchased from an American supplier (AttestR 1264, 3M), in a total of 360 units. The former indicators were obtained using Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 in Roux bottles, innoculated on paper carriers and wrapped up on protective packaging. The posterior lethality study and D value calculation highlighted the highest resistance of AttestR indicators in comparison with the laboratory ones. This can be explained by different leveIs of spores purification, alongside with the differences between the carriers and packaging used in both cases. The sterilizing efficacy of Oxyfume 12R and Oxyfume 2002R revealed equivalent results, even in different concentrations. The influence of higher temperatures was efficient (p=1,0). Aiming at occupational safety, environmental monitoration was also performed related to ethylene oxide, using DragüerR detection tubes and foley pump. The results, obtained in different positions and moments under 1 ppm, confirmed that the engineering concepts indicated by the Portaria Interministerial nº 482 from 16 april 1999, published on the 19th of the same month in the Diário Oficial, offer residual safe levels compatible with human presence. It is therefore gratifying to conclude that the sterilization process using Oxyfume 2002R is both an efficient contribution to a safe utilization of products and, at the same time, to preserve the animallife on Earth.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Orientador: Mário Tyago Murakami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_NadiaHelena_D.pdf: 33217097 bytes, checksum: 6cbd9ad5dcfddd06e2357b3c680cd3f6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A enzima purina nucleosídeo fosforilase hexamérica de Bacillus subtilis (BsPNP233) c uma nucleosídeo fosforilase do tipo 1 , responsável pela catalise reversível da reação de guebra de urn nucleosídeo em base nitrogenada e ribose-1-fosfato na via de salvação de purinas. Essa enzima possui interesses biomédicos e biotecnológicos devido ao uso na terapia gênica em canceres sólidos e na biossíntese de análogos de nucleosídeos...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The hexamcric purine nucleoside phosphorylase from Bacillus subtilis (BsPNP233) is a nucleoside phosphorylase typc-1 involved in purine salvage pathway by the nucleoside phosphorolysis resulting in purine base and ribose-1-phosphatc. The interest about this enzyme involves gene therapy application in solid cancers treatment and nucleoside analogs biosynthesis...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular