M.S.

The penicillin-binding proteins (PBPs) synthesize and modify peptidoglycan (PG), the main structural element of the bacterial cell wall. PBPs and PG synthesis are highly conserved in all bacteria and both have been important targets for antibiotic and antibacterial development. In the Gram positive bacterium Bacillus subtilis, PBP1 is composed of the four domains S, N, P, and C in order from the N- to C-terminus. It plays important roles in vegetative PG synthesis. Compared to the wild type B. subtilis, the PBP1 null mutant has decreased growth rate, cell diameter, and PG crosslinking; the cell population has more long cells; and the colonies have raised and smooth edges. In this work, we constructed six mutant forms of PBP1 that were tagged with a C-terminal FLAG epitope, to complement the wild type gene. We examined the colony and cell morphologies, and PBP1 localization in the mutant strains. The removal of the cytoplasmic region of the PBP1 S domain and the replacement of PBP1 S domain by PBP4 S domain did not change the colony morphologies, and each of these two mutations had minor effects on growth rate, cell diameter, PG crosslinking and generation of long cells in the cell population. The single point mutation in the active site of the N or P domain presumably removed the enzymatic activity, and each mutation caused slower growth rate, decreased cell diameter and PG crosslinking. The point mutation in the P domain had a minor effect on the colony morphology and formation of long cells; while the mutation in the N domain altered the colony morphology, and resulted in high percentage of long cells that is comparable to the PBP1 null mutant. The C domain of PBP1 has no apparent enzymatic activity, but the loss of it altered the colony morphology, and caused slower growth rate, decreased cell diameter, and PG crosslinking. In the wild type B. subtilis, PBP1 localizes to the septum. This septum localization specificity was lost in strains expressing PBP1 without the C domain, with PBP4 S domain, or with a point mutation in the active site of the N domain. PBP1 with a point mutation in the active site of the P domain, or without the cytoplasmic region of the S domain, had decreased septum localization specificity. These findings were used to develop a model of how PBP1 domain functioning in B. subtilis. / Master of Science

No / N-terminal lipidation is a major mechanism by which bacteria can tether proteins to membranes and one which is of particular importance to Gram-positive bacteria due to the absence of a retentive outer membrane. Lipidation is directed by the presence of a cysteine-containing `lipobox' within the lipoprotein signal peptide sequence and this feature has greatly facilitated the identification of putative lipoproteins by gene sequence analysis. The properties of lipoprotein signal peptides have been described previously by the Prosite pattern PS00013. Here, a dataset of 33 experimentally verified Gram-positive bacterial lipoproteins (excluding those from Mollicutes) has been identified by an extensive literature review. The signal peptide features of these lipoproteins have been analysed to create a refined pattern, G+LPP, which is more specific for the identification of Gram-positive bacterial lipoproteins. The ability of this pattern to identify probable lipoprotein sequences is demonstrated by a search of the genome of Streptococcus pyogenes, in comparison with sequences identified using PS00013. Greater discrimination against likely false-positives was evident from the use of G+LPP compared with PS00013. These data confirm the likely abundance of lipoproteins in Gram-positive bacterial genomes, with at least 25 probable lipoproteins identified in S. pyogenes

Orientador: Danielle Biscaro Pedrolli / Resumo: Os métodos de indução da expressão gênica disponíveis para linhagens bacterianas envolvem a adição de compostos indutores ao meio de cultura (por exemplo, isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo, xilose e arabinose), o que é indesejável para linhagens industriais, pois encarece o processo produtivo. Já a utilização da expressão constitutiva, alternativa à indução, pode ocasionar stress metabólico durante a fase lag de crescimento quando são utilizados promotores fortes. O objetivo do trabalho foi construir e padronizar um novo modelo de indução da expressão gênica para linhagens bacterianas industriais. O novo modelo de autoindução baseado no sistema de quorum-sensing bacteriano, permitindo que a célula se automonitore e induza a expressão gênica durante a fase exponencial de crescimento, eliminando assim não só a necessidade de adição de composto indutor como a necessidade de monitoramento da densidade celular pré-indução. Realizou-se amplificação e clonagem dos genes luxR e luxI, com e sem caudas de histidina, e suas respectivas sequências regulatórias de Aliivibrio fischeri, em plasmídeo contendo os genes responsáveis pela bioluminescência ou fluorescência com códons otimizados para Bacillus subtilis. Em seguida, foi realizada transformação e a integração do plasmídeo no cromossomo de B. subtilis. A funcionalidade do sistema foi avaliada em diferentes etapas de crescimento microbiano com o auxílio de um leitor de microplacas durante intervalos regulares. O sistema de autoind... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Current methods available for the autoinduction of gene expression in genetically engineered bacterial strains require addition of inducing compounds to the culture medium (e.g. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, xylose, and arabinose), which is undesirable for industrial strains due to additional costs to the production process. Alternatively, constitutive gene expression is employed. However, the later can possibly cause metabolic stress during the lag growth phase if strong promoters are employed. The objective of this work was to construct and to standardize a new model for induction of gene expression in industrial bacterial strains. The new model is based on an autoinduction process triggered by the bacterial quorum-sensing system. It allows the cell to monitor itself and induce its own gene expression during the exponential growth phase, thereby eliminating both the need for an external inducing compound and the need for monitoring pre-inducing cell density. Bacterial cultures were grown in rich media, supplemented or not with antibiotics. Amplification and cloning of luxR and luxI genes, with and without histidine tags, and their respective regulatory sequences of Aliivibrio fischeri, were performed on a plasmid containing the genes responsible for bioluminescence or fluorescence with codons optimized for Bacillus subtilis. Next, transformation and integration of the plasmid into the B. subtilis chromosome were performed. The functionality of the system was evalua... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

La plupart du temps, les bactéries vivent au sein de biofilms : un tissu biologique accroché sur des surfaces (molles ou solides), qui est composé de bactéries et de matrice extracellulaire. Lors de cette thèse nous avons étudié les mécanismes qui contrôlent la formation d’un biofilm à l’interface eau-air par Bacillus subtilis (BS). D’abord, nous avons observé l’évolution phénotypique de BS au cours du développement de sa population en milieu liquide, dans des conditions de culture standard (pas de biofilm in fine). Nous avons constaté que la population exhibe différents types cellulaires (phénotypes) au cours du temps. Puis, afin d’observer les étapes de la formation d’un biofilm, nous avons créé une expérience qui permet de suivre l’évolution macroscopique de la concentration des bactéries et sa répartition spatiale au sein du milieu de culture. Nous constatons qu’une accumulation de bactéries se forme en dessous de l’interface eau-air avant même l’apparition d’un biofilms. Cette accumulation est concomitante avec de la convection dans le fluide (bioconvection). Le biofilm apparait lors de la phase de croissance de la population en bactérie pour une concentration moyenne dans le milieu de culture de l’ordre de 10¹³ bactéries/m³. Ensuite, nous avons formulé un modèle continu qui renseigne sur l’évolution de l’environnement des bactéries. Ce modèle reproduit la bioconvection observée dans les expériences et révèle son effet sur la concentration en dioxygène dissous dans la culture. Enfin, nous avons construit un modèle hybride continu-discret qui décrit la transition de bactéries déconnectées (nomades) vers des bactéries connectées formant un biofilm solide (sédentaires). Chaque bactérie est considérée comme une particule individuelle. Le modèle tient compte des forces de contact, ainsi que les forces élastiques qui peuvent s’établir entre les bactéries lorsqu’elles sont liées par de la matrice. Un nombre minimal d’aptitudes biologiques a été utilisé pour modéliser les bactéries : la division cellulaire qui leur permet de coloniser le milieu de culture, la motilité et l’aérotactisme qui explique leur migration vers la surface liquide, le quorum sensing (QS) et la différenciation cellulaire qui leur permet de passer du phénotype nomade (motile) au phénotype sédentaire (producteur de matrice). L’environnement en dioxygène des bactéries et les propriétés hydrodynamiques du milieu sont décrits par des champs continus. Le modèle reproduit toutes les étapes de la formation d'un biofilm observées dans nos expériences et confirme la nécessité de certaines aptitudes biologiques. Il montre que le seuil de QS joue un rôle majeur dans la morphologie du biofilm et sa cinétique de formation. En revanche, le taux de consommation de dioxygène par les bactéries ne semble pas avoir de rôle important. Enfin, nous avons établi que la bioconvection agit comme un retardateur de la formation du biofilm. / Most of the time, the bacteria live inside the biofilm: the biological tissue that is attached to the surface (soft or solid), is made of the bacteria and of extracellular matrix. According to this thesis we study the mechanics that control the formation of a biofilm at the interface water-air by Bacillus subtilis (BS). First, we absorbed the phenotype evolution of the BS during the development of its population in liquid medium, under the conditions of a standard culture (no of biofilm in fine). We noticed that the population exhibits different cellular types (phenotypes) during this time. Then, after absorbing the different stages of the development in the formation of a biofilm, we created an experience that allows us to follow the macroscopic evolution of the concentration of the bacteria and its special distribution in the middle of the culture. We found that an accumulation of the bacteria forms under the surface water-air, even before the appearance of a biofilm. This accumulation is concomitant with the conservation in the liquid (bioconvection). The biofilm appears during the growth phase of the bacterial population in an average concentration in the culture medium of about 10¹³ bacteria / m³. Then, we formed a continuous model that shows us the evolution of the environment of the bacteria. This model reproduced the bioconvection that was observed in the experiments and reveals its effect on the concentration of oxygen in the biological culture. Finally we built a hybrid continuous-discreet model that described the transition of the disconnected bacteria (nomads) through the connected bacteria that form a solid biofilm (sedentary). Each bacteria is considered as an individual particle. The model takes the contact forces under consideration, as well as the elastic forces that can settle between the bacteria when linked by the matrix. A minimum number of biological skills were used to form a model from the bacteria; the cellular division that allowed it to colonize the medium biological culture, the motility and the aerotaxi that explains its migration towards the liquid surface, the quorum sensing (QS) and the cellular differentiation that allows them to spend nomadic phenotype (motile) sedentary phenotype (producer of matrix). The dioxygen environment of the bacteria and its middle hydrodynamic properties are described by continuous fields. The model reproduces all the formation steps of an observed biofilm in our experiment and confirms the need of certain biological skills. It shows that the threshold of QS plays a major role in the morphology and biofilm formation kinetics. On the other hand, the rate of diocygen consumption by the bacteria does not seem to have any significant role. Finally, we established that the bioconvection reacts as a retardant in the biofilm formation.

Tendo em vista a importância do processo esterilizante aplicado a produtos farmacêuticos e aos produtos médico-hospitalares, distintos métodos foram desenvolvidos de forma a possibilitar sua aplicação, inclusive a materiais termossensíveis. Neste contexto, o processo que se tornou mais amplamente empregado consiste naquele utilizando o óxido de etileno. Este agente, devido às características de inflamabilidade e explosividade, tem sido usado diluído em gases inertes, predominantemente os clorofluorcarbonos (CFCs), que contornam tais problemas. Conhecimentos recentemente adquiridos e consenso internacional quanto ao risco da depleção da camada de ozônio da estratosfera ocasionaram a busca de alternativas, dentre as quais a adoção dos hidroclorofluorcarbonos (HCFCs). O delineamento do presente trabalho objetivou a comparação da eficácia esterilizante de misturas de óxido de etileno em CFC 12 (Oxyfume 12R), e em HCFCs 22 e 124 (Oxyfume 2002R), quando aplicadas em diferentes concentrações (450 mg/L e 600mg/L) e sob distintas temperaturas (45°C, 55°C e 65°C). Procedeu-se a desafios subletais (3, 6 ,9, 12 e 15 minutos de exposição), empregando a cada ciclo seis indicadores biológicos laboratorialmente preparados, com esporos de Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 obtidos em garrafas de Roux contendo meio de esporulação, sendo a seguir padronizados, inoculados em suportes celulósicos e acondicionados em embalagens filme-papel, perfazendo um total de 1080 monitores. Paralelamente foram também submetidos a desafios indicadores biológicos de aquisição comercial (AttestR 1264, 3M), dois a cada ciclo, perfazendo 360 unidades. Os resultados de resistência obtidos (valor D) nos 180 ciclos privilegiaram estes últimos, levando tal resultado a considerações quanto ao procedimento de purificação da suspensão de esporos e diferenças existentes entre suportes e acondicionamentos empregados. A eficácia esterilizante de ambas as misturas, Oxyfume 12R e Oxyfume 2002R, revelou-se equivalente, mesmo em diferentes concentrações. Além de observações que evidenciaram os efeitos significantes quanto à preparação dos indicadores biológicos, foi evidente e estatisticamente significante ( p=1% ) o efeito do aumento da temperatura, promovendo efeito mais intenso sobre a letalidade dos esporos. Numa outra abordagem, de conotação ocupacional, procedeu-se também no decorrer do trabalho experimental à monitoração do ambiente quanto a resíduos de óxido de etileno, usando bomba e tubos de detecção da DragüerR: os resultados obtidos nas diferentes posições e momentos, inferiores a 1 ppm, proporcionaram a conclusão de que, respeitando a adoção dos conceitos de engenharia indicados na Portaria Interministerial nº 482 de 16 de abril de 1999, publicada no Diário Oficial da União do dia 19 do mesmo mês e ano, é obtida condição compatível com a presença humana. É portanto gratificante que se possa concluir o trabalho com o sentimento de que efetivamente se tenha constituído em contribuição no sentido de permitir a manutenção de emprego do processo esterilizante em pauta, conferindo segurança ao paciente no uso de produtos, sem entretanto comprometer a vida humana em nosso planeta. / Taking into account the importance of the sterilization process applied to medicines and medical devices, different kinds of methods have been developed, also applicable to heat sensitive materiais. Ethylene oxide is the process most widely applied to medical devices. Due its explosiveness and inflamability, it has been used associated to non active gases, wich inhibit these properties, mainly the chlorofluorocarbons (CFCs). Recent knowledge about ozone-depleting gases and an international consensus on the need of reducing their effects are promoting a search for alternative chemicals. From these, one of the most interesting are the hydrochlorofluorocarbons (HCFCs) which, besides having this role, can also be used as transitional compounds while more environmentally suitable compounds are not available. This paper aims to compare two ethylene oxide sterilization mixtures: Oxyfume 12R (using CFC 12) and Oxyfume 2002R (using HCFCs 22 and 124), under different concentrations (450mg/L and 600mg/L) and different temperatures (45°C, 55°C and 65°C). To accomplish this procedure, sub-Iethal challenges were performed (3, 6, 9, 12 and 15 minutes of exposition), in a total of 180 cycles, using six biological indicators per cycle prepared in a laboratory, in a total of 1080 units, as well as two others purchased from an American supplier (AttestR 1264, 3M), in a total of 360 units. The former indicators were obtained using Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 in Roux bottles, innoculated on paper carriers and wrapped up on protective packaging. The posterior lethality study and D value calculation highlighted the highest resistance of AttestR indicators in comparison with the laboratory ones. This can be explained by different leveIs of spores purification, alongside with the differences between the carriers and packaging used in both cases. The sterilizing efficacy of Oxyfume 12R and Oxyfume 2002R revealed equivalent results, even in different concentrations. The influence of higher temperatures was efficient (p=1,0). Aiming at occupational safety, environmental monitoration was also performed related to ethylene oxide, using DragüerR detection tubes and foley pump. The results, obtained in different positions and moments under 1 ppm, confirmed that the engineering concepts indicated by the Portaria Interministerial nº 482 from 16 april 1999, published on the 19th of the same month in the Diário Oficial, offer residual safe levels compatible with human presence. It is therefore gratifying to conclude that the sterilization process using Oxyfume 2002R is both an efficient contribution to a safe utilization of products and, at the same time, to preserve the animallife on Earth.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Seja no meio ambiente, dentro de um hospedeiro ou em outro habitat, bactérias estarão frequentemente enfrentando condições adversas, como exposição a compostos antibacterianos ou carência nutricional. Em situações como essas, as bactérias são capazes de ativar a chamada resposta estringente, modulada pelo alarmônio (p)ppGpp. O acúmulo de (p)ppGpp promove a inibição da transcrição de rRNAs e tRNAs e a supressão do processo de tradução, e a ativação de operons de biossíntese de aminoácidos. Sabe-se também hoje que a resposta estringente está relacionada a outras importantes carências nutricionais em Escherichia coli, como a falta de ácidos graxos, porém não se sabe se o mesmo ocorre em Bacillus subtilis ou em outras Grampositivas. (p)ppGpp atua também direta e indiretamente em vários outros processos celulares, como motilidade, resistência a antibióticos, virulência e persistência, indicando que (p)ppGpp é um regulador central que integra informação metabólica e respostas adaptativas. O presente trabalho buscou estudar a correlação da resposta estringente de B. subtilis com a carência de ácidos graxos e a busca por pequenas moléculas capazes de modular RelA (a principal proteína envolvida na síntese de (p)ppGpp) e impedir o acúmulo de (p)ppGpp. Para a indução da carência de ácidos graxos, foram utilizadas duas estratégias; uso da droga Cerulenina (inibidor de FabF) e mutantes condicionais no gene FabF. Observou-se que mutantes incapazes de ativar a resposta estringente (cepa ppGpp(0) ou RelAD264G) apresentaram grande perda de viabilidade celular durante a carência de ácidos graxos, ao passo que a cepa selvagem manteve sua viabilidade celular. A causa da morte se deu majoritariamente devido ao colapso do potencial de membrana. Apesar de não termos observado aumento de (p)ppGpp nas células selvagens durante a carência de ácidos graxos, observou-se uma redução da razão GTP/ATP, ao passo que na cepa ppGpp(0), a razão GTP/ATP aumentou, devido ao acúmulo de GTP. O uso da droga decoinina, capaz de reduzir os níveis intracelulares de GTP, resgatou parcialmente a viabilidade da cepa e impediu a perda do potencial de membrana, indicando que os níveis de GTP são importantes durante a carência de ácidos graxos em B. subtilis. Para a triagem de pequenas moléculas inibidoras do acúmulo de (p)ppGpp, foi utilizada uma biblioteca de 2320 diferentes compostos químicos, e buscou-se drogas capazes de reverter o fenótipo de crescimento lento de cepas de B. subtilis que acumulam (p)ppGpp (via mutação pontual; mutante RelAH77A e via tratamento com o indutor hidroxamato de arginina) em meio rico. A primeira etapa selecionou 40 moléculas capazes de resgatar o crescimento de células tratadas com arginina-hidroxamato, porém apenas uma, salicilanilida, foi capaz de também resgatar o crescimento da cepa RelAH77A. Todavia, apesar de ser capaz de acelerar o crescimento de B. subtilis esse efeito é limitado. Diversos análogos de salicilanilida foram testados, porém não apresentaram efeito superior a salicilanilida para a reversão do fenótipo de crescimento lento de B. subtilis. Em adição, a droga não foi capaz de aumentar a sensibilidade dos organismos a diversos antibióticos testados, e aparentemente é incapaz de alterar os níveis internos de (p)ppGpp, porém é capaz de causar alterações nos níveis de ATP. Logo, acredita-se que o efeito observado para o crescimento das células seja devido a efeitos indiretos, possivelmente envolvendo alteração de outros nucleotídeos fosforilados. / In the environment, inside a host or other habitat, bacteria will always face adverse conditions, as for example exposure to antimicrobials or starvation. In situations like those, bacteria activate the stringent response, modulated by the alarmone (p)ppGpp. (p)ppGpp accumulation promotes inhibition of rRNA and tRNA transcription and suppression of translational process, at the same time that it activates several amino acid biosynthesis operons. It is known also that the stringent response it is related to other starvation stress in Escherichia coli, like lack of fatty acids, but there is no knowledge if the same occurs for Bacillus subtilis or other gram-positive bacteria. ppGpp acts directly and indirectly affecting several other cellular process, as motility, resistance to antibiotics, virulence and persistence, indicating that (p)ppGpp is a central regulator that integrates metabolic information and adaptive responses. This work aimed to study the correlation between the stringent response in B. subtilis with fatty acid starvation, and search for small moleculas capable of modulating RelA (the main enzyme responsible for ppGpp synthesis) and stop (p)ppGpp production. For fatty acid starvation induction, two strategies were used; use of the drug Cerulenin (inhibitor of the FabF protein) and conditional mutants of the FabF gene. We observed that mutants incapable of activating the stringent response (strains ppGpp(0) ou RelAD264G) presented great loss of viability during fatty acid starvation, whereas the wild-type strain keeps its viability. The main cause of death is due membrane rupture in some cells, but mainly due to membrane potential collapse. Although we did not observed increase of (p)ppGpp in wild-type strains during fatty acid starvation, we observed reduction in GTP/ATP ratios, a hallmark of (p)ppGpp production in gram-positive bacteria. In the strain ppGpp(0) GTP/ATP ratio increased, mainly due to GTP increase. Using the drug decoyinine, capable of reducing GTP levels, partially recued viability and protects cells of losing its membrane potential, indicating that GTP levels plays an important role during fatty acid starvation in B. subtilis. For the screening of small molecules capable of inhibit (p)ppGpp production, a library of 2320 different chemical compounds were used, and we looked for drugs capable of reverting the slow growth phenotype of B. subtilis strains with (p)ppGpp accumulation (using a mutant RelAH77A; and using a stringent response inductor, arginine hidroxamate). The first step selected for 40 molecules capable of rescuing the growth of cells treated with arginine hidroxamate, but only one drug, salicilanilyde could also rescue the growth of the strain RelAH77A. Although capable of rescuing growth of B. subtilis that accumulates (p)ppGpp, this rescue is limited. Several analogues of salicilanilyde were tested, but none were stronger than salicilanilyde itself in rescuing growth of slow growing strains of B. subtilis. In addition, the drug was not capable of increasing antibiotic sensibility and it is incapable of changing intracellular (p)ppGpp levels, but it does shifts ATP levels. Therefore, we believe that the observed effects of salicilanilyde is due indirect action, probably involving other phosphorylated nucleotides, rather than modifying (p)ppGpp levels

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.